Tema 7 - Elements mòbils (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 15
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TEMA 7 – Elements mòbils en bacteris SEQÜÈNCIES D’INSERCIÓ 26/11/14 Taula – què es considera un element mòbil en procariotes o no (no només tenim transposons).
69 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Les seqüències d’inserció són seqüències petites que s’anomenen IS i són elements que estan molt distribuïts en procariotes. És a dir, sempre estan presents en el genoma de diferents procariotes. Aquestes IS acostumen a ser típiques d’alguns fílums genètics concrets – d’alguna forma podem associar una IS a la presència d’un fílum sencer (si en un cultiu hi són, vol dir que un fílum concret hi és). Aquesta especificitat per grups filogenètics s’usa per epidemiologia, per estudiar l’origen d’una cèl·lula).
Com estan formades i com funcionen? Són com una mena d’entrepà – tenim un gen o més d’un que estan implicats en el salt de la IS i que estan flanquejats per les IRs que són seqüències invertides repetides (IR, Inverted Repeat, en groc) que es troben a banda i banda de les regions codificants pels salt.
Quan mirem en el genoma d’un determinat microorganismes la presència d’un IS veiem que al costat hi la sempre les seqüències TS (target sequence, en lila) – són unes seqüències diana que no formen part de la IS, quan la IS salta no se l’emporta, però és una regió repetida sempre present flanquejant els IS. En el genoma original només hi havia una TS però el procés d’incorporació de les IS provoca la duplicació de les TS.
Les IS es classifiquen en funció dels mecanismes que permeten el salt de les IS. És a dir, com hi ha diferents gens entre les IS, en funció de com són aquestes transposases i de com promouen el salt, classificarem les IS. El més habitual és trobar una transposasa i inhibidors de la transposasa (mecanisme de control que fa que la transposició no sigui habitual). Això es fa per tal que la freqüència de salt dels elements mòbils no sigui molt alta. La majoria de l’estona es mantenen silents. Llavors com es veu que salten? Perquè al final sempre veiem alguna cèl·lula on s’ha mogut algun element.
70 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Els elements mòbils són una mica paràsits de la cèl·lula; és a dir, el moviment d’elements és una mica un perill per la cèl·lula (poden truncar algun gen en el seu salt). Però evolutivament s’han mantingut perquè és el que hi ha.
Una mateixa seqüència d’inserció la podem trobar repetidament en el genoma d’un procariota. De fet abans es consideraven seqüències repetitives del genoma.
Els elements mòbils NO salten a l’atzar sense una seqüència concreta – sempre tenen una certa preferència per una regió determinada. El que passa és que aquestes seqüències poden ser molt degenerades – podem anar d’alguna cosa molt específica a una seqüència random.
Imatge: R pot ser una A i una T. M és una certa combinació de nucleòtids. Una Y és una altra combinació de nucleòtids en concret. Aquests codis de seqüència són degenerats – moltes posicions són aleatòries.
Aquí tenim una representació dels dominis bacterians amb les IS identificades en cada fílum.
Alguns grups tenen uns puntets que altres grups no tenen. Això servei per identificar bitxitos. A vegades fins i tot s’utilitzen IS com a sondes per determinar si un grup microbià es troba en un cultiu concret sense haver de seqüenciar. A vegades trobem trossos de DNA que no sabem què són, i quan trobem una IS sabem de quin grup filogenètic prové.
SALT DE LA SEQÜÈNCIA D’INSERCIÓ Quan la transposasa o el sistema de transposició (conjunt de subunitats que conformen un holoenzim) funciona, identifica la TS (que pot ser més o menys específica, pot tenir unes determinades bases o ser aleatòria). Llavors l’enzim codificat per aquell sistema de 71 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 transposició produeix un tall cohesiu generant unes cues de ssDNA. Aquestes cues i aquesta regió és la TS (la regió lila). En el DNA aquesta TS no està duplicada però quan funciona el sistema es duplica. La transposasa separa dues seqüències del DNA que acaba de tallar i entre mig de les dues col·loca l’element d’inserció. Però com aquest lloc diana tenia extrems cohesius, queden forats, i els sistemes de reparació l’omplen generant la duplicació de la TS que dèiem abans.
En funció de la transposasa i del tall que es generi, la longitud de les TS pot ser més gran o més petit. És a dir, que si la distància entre l’IS i el tall és gran, les TS seran més grans (es replicaran més bases).
La seqüència TS dependrà del lloc on s’insereixi. Algunes IS tenen direccionalitat però moltes són aleatòries. Per tant sempre hi haurà uns quants pb que es duplicaran i que anomenem TS però la seqüència d’aquests pb podrà canviar. El que es manté és que a banda i banda està duplicat. Quan la IS salta d’un lloc a l’altre alguens transposases eliminen les TS (es torna a la seqüència original i no deixen rastre). Altres IS quan s’escindeixen no tenen aquesta capacitat, de manera que queden les 2 TS allà i és com una marca que allà hi ha hagut una IS.
Les IS són els elements mòbils més senzill. Anem a veure ara transposons.
72 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRANSPOSONS DE CLASSE I – Classe bocata Els transposons de classe I tenen dues IS i entre mig de les dues IS trobem gens que codifiquen per resistències a antibiòtics. No sempre són només gens de resistència, però apareixen aquests gens per la pressió selectiva en fer créixer bacteris en cultius amb antibiòtics. Aquesta IS que tenen a banda i banda són exactament iguals, és la mateixa IS duplicada. El que pot variar és la orientació – poden estar en la mateixa direcció o estar invertides.
Aquestes IS són com les que hem descrit abans tindran en les zones grogues les proteïnes implicades en el procés de transposició i en la regió vermella trobarem les IR flanquejants.
Aquests transposons tenen a banda i banda les seqüències TS duplicades degut als processos d’inserció del transposó.
Les dues IS que flanquegen el transposó contenen els gens del salt, de la transposició (transposasa). Però no salta una IS, el que salta és TOT el transposó, amb les dues IS. Per què? El que passa és que una de les dues IS té alguna mutació que fa que no pugui saltar gaire bé (s’ha perdut el marc de lectura per una inserció, hi ha hagut una mutació en la transposasa que la fa no funcional, etc.). Per tant el mecanisme de transposició no acaba de funcionar del tot bé. Normalment la que funciona és la dreta. Excepte si ets Pablín Iglesias. Llavors únicament pot funcionar l’esquerra. Quan el sistema de transposició funciona es detecten els extrems del transposó, no de la transposasa; escindeix tot el transposó, s’emporta tot el bocata a on sigui.
Inicialment funcionaven les dues. Però les IS s’espachuflen en un moment determinat de l’evolució de manera que al final s’escindeix tot i això s’ha seleccionat evolutivament. És ha dir, s’ha potenciat aquest error perquè el gen que contenen al mig és importantíssim per la supervivència del bacteri. Si només saltés la IS no saltaria el gen de la resistència.
Tenim diferents tipus de classe I – tenim diferents combinacions de IS, i cada una tindrà una transposasa diferent que podran estar també en orientacions diferents. Les residències en els transposons també poden ser diferents. Per últim, el salt també pot ser més o menys específic.
Tenim seqüències aleatòries a l’hora d’ancorar-se o trobem també hot spots d’ancoratge.
73 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 DE CLASSE II Tenen també les TS, tenen en groc dues seqüències repetides invertides i enmig d’aquestes tenen la transposasa, una resolvasa i gens de resistència antibiòtica. Són els “transposons per excel·lència” però en el fons és una IS amb un gen de resistència. També s’anomenen transposons complexes pel fet de contenir aquesta resolvasa.
DE CLASSE III Els transposons de tipus III són bacteriòfags, però enlloc de tenir integrasa tenen transposasa, i com s’insereixen sense tenir una TT, s’insereixen l’atzar, ells diuen que són transposons.
DE CLASSE IV Són transposons que s’integren reconeixent una regió concreta i s’integren amb una integrasa enlloc de amb una transposasa. La regió de salt és molt específica.
74 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 COMPLEXITAT DELS TRANSPOSONS Els transposons no serveixen com a marcadors epidemiològics. Es distribueixen àmpliament per la filogènia perquè tenen resistències antibiòtiques i això fa que sigui guay tenir transposons sobretot si algú fa pressió selectiva sobre certs bitxitos. Per tant no tindrem especificitat en la seva distribució.
La classificació en classes és utòpic, perquè en realitat quan mirem plasmidis i genomes ens trobem amb dues IS que fan fintes – a dins poden tenir seqüències repetides, resistències a antibiòtics, un altre transposó, etc. i a ver qui és el guapo que classifica això.
MECANISME DE SALT 01/12/14 Tenim dos mecanismes de transposició: - De tipus I o conservativa.
De tipus II o replicativa.
Aquesta nomenclatura es refereix al número d’elements mòbils que queden al final del procés de transposició. La transposició conservativa només conserva un element mòbil (corta y pega), mentre que en la replicativa el transposó es manté en el lloc i envia una còpia a un altre lloc (copia y pega).
75 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRANSPOSICIÓ DE TIPUS I o CONSERVATIVA La fan els transposons de classe I i les IS. No s’augmenta el nombre d’elements mòbils. El mecanisme és exactament igual al mecanisme de transposició de les IS. De fet els transposons de classe I tenen IS. La única diferència és que salta TOT l’element, no només la IS.
Així doncs, es dóna un tall a banda i banda de l’element mòbil en les dues cadenes, s’identificarà una target sequence (lloc d’integració a l’atzar tot i que amb certes preferències – zones riques en AT), produirà un tall cohesiu que separarà les dues cadenes de DNA i col·locarà l’element mòbil entre les dues cadenes, cosa que produeix les repeticions de les target sequence a banda i banda del transposó tot i que no salten.
76 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRANSPOSICIÓ DE TIPUS II o REPLICATIVA La fan els transposons de classe II. Es dóna gràcies a una resolvasa, un enzim que es troba enmig d’aquesta seqüències repetides invertides i que forma part de la maquinària de salt dels transposons de tipus II.
En el lloc on està el transposó es dóna un tall a banda i banda de l’element mòbil però en aquest cas és en una sola cadena (en una banda la monocadena de baix i en l’altra la monocadena contrària). També fa un tall cohesiu exactament igual en la regió diana on s’ha d’inserir (en la target sequence). Abans podíem treure el transposó sencer, aquí no. Llavors, tindrem que una banda del transposó s’enganxa a l’element receptor i l’altra queda enganxat a l’element donador; i l’altra banda el mateix però al revés.
77 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Ara queda un GAP que els sistemes de reparació reconeixen i la DNA polimerasa s’omplirà al GAP i l’omplirà. Amb això acabem de fusionar els dos elements genètics en un únic element genètic que anomenarem cointegrat. Com tornem a la situació original? La resolvasa no és més que una recombinasa específica de lloc que reconeix una regió específica del DNA la qual rep el nom de res (lloc de resolució de la resolvasa, on es donarà l’intercanvi). La resolvasa (tnpR en la imatge) reconeix aquesta regió res i produeix un intercanvi entre les dues regions ja que són homòlogues (mecanisme semblant a XerDC).
En intercanviar-ho, separem els dos elements genètics de nou i cada un s’emporta un transposó – dupliquem el transposó.
El salt d’elements mòbils en un mateix cromosoma pot provocar reestructuracions com ara inversions, delecions, duplicacions, translocacions, etc. fins i tot pot haver mutagènesi. Per tant la forma dels transposons de saltar pot permetre totes aquestes reestructuracions que facin que veiem que de cop un tros del cromosoma en l’evolució canviï, i està associat a la presència d’elements mòbils.
El fet de formar cointegrats pot estabilitzar plasmidis i la presència d’elements extracromosòmics (ara repliquen des d’un origen comú i es mantenen en la cèl·lula). A causa d’aquesta estabilitat, a vegades aquests cointegrats no es resolen, la resolvasa no acaba de funcionar i generes un únic element a partir de dos.
La resolvasa no és la única capaç de resoldre cointegrats – si RecA reconeix que hi ha dos fragments que són iguals a nivells de seqüència, la resolució d’aquests cointegrats pot donarse mitjançant recombinació homòloga. És important saber si la cèl·lula és RecA- o RecA+ per coses com aquesta.
78 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 EFECTES DELS ELEMENTS MÒBILS 79 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 INTEGRONS No són estrictament elements mòbils – es defineixen com a plataformes que incorporen cassettes exògens en el seu interior (extracromosòmicament).
És una plataforma que comprèn una integrasa, una regió attI amb un promotor que dóna la integrasa (PI, promotor de la integrasa) i un promotor (Pc, promotor constant) que dóna una unitat transcripcional que contindrà cassettes (ORFs) que s’aniran incorporant o escindint de l’integró en funció de les necessitats de la cèl·lula.
Un cassette (element extracromosòmic circular que no replica ni res) és un ORF sense promotor que conté un att (attC) que és reconegut per la integrasa. Aquesta att integra el cassette a la regió attI, que és la regió att de l’integró. Incorpores un att al començament de l’estructura de l’integró. D’aquesta manera, com tens un promotor, expressa tots els gens que hi ha darrere el attI, per tant el mRNA contindrà tots aquests gens continguts.
Com tenim una unitat transcripcional que comprèn diferents introns, com més lluny estigui un cistró de la part promotora més baixa serà la producció a causa de l’efecte polar.
80 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Es classifiquen els integrons dins els elements mòbils ja que els cassettes són mòbils, vas movent les peces de l’integró en funció de les necessitats de la cèl·lula.
CLASSIFICACIÓ INTEGRONS MÒBILS - - - - Tenen entre 2 a 8 gens que codifiquen per resistències antibiòtiques.
Resistències antibiòtiques més habituals:β-lactàmics, aminoglicòsids, cloramfenicol, trimetoprim, estreptomicina, rifampicina, eritromicina, fosfomicina, lincomicina i a antisèptics de la família de compostos amb amoni quaternari.
Aquests integrons estan associats a elements mòbils, poden estar flanquejat per IS, col·locats en transposons o elements conjugatius. Per tant ell per se no es mou però està dintre regions mòbils.
Trobem 5 classes diferents en funció de com és la integrasa, però sempre tenen la mateixa estructura.
Tots es caracteritzen per 3 gens que tenen al final, que són una resistència a amonis quaternaris i desinfectants, una resistència a sulfonamides i un gen que no se sap perquè funciona. Aquests 3 tenen el seu propi promotor, no estan codificats per Pc.
El número de cassettes és variable.
81 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 pMUR – plasmidi d’un porquet de Múrcia. Aquest plasmidi tenia multiresitències. El que està senyalat és un integró amb moltes resistències a antibiòtics que es troba dins un plasmidi mòbil i està flanquejat per transposons. Era una bomba d’integró.
SÚPER INTEGRONS Parlem de més de 20 cassettes (fins a 200 cassettes seguits, és un mamotreto). Normalment no es troba en plasmidis i no es mouen, es troben ancorats al cromosoma de diverses espècies bacterianes (molta diversitat). Es creu que són l’origen de la resta d’integrons ja que els seus cassettes no només codifiquen per resistències – també tenen gens que codifiquen per activitats metabòliques, sistemes toxina – antitoxina, etc.
És un lloc on la cèl·lula guarda coses que li poden ser interessants en un moment determinat.
La estructura és la mateixa – un promotor que codifica per la integrasa i un mateix promotor per la unitat transcripcional que conté tots els cassettes.
82 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 En el cas de Vibrio sp (imatge) parlem de fins a 176 cassettes que poden ocupar fins a 130kb, un 3% del genoma.
Els investigadors en descobrir l’integró de Vibrio, sabien com funcionaven Pi i PC però no se sabia com es regulava la integrasa. Ara se sap que el PI està controlat per LexA – forma part del reguló LexA, que reprimeix l’acció de la integrasa. Si LexA regula la integrasa significa que de normal la integrasa està silenciada (expressió basal, no s’integren massa coses). Però llavors els cassettes d’on venen? En un principi es pensava que venien d’altres integrons que hi ha dins la cèl·lula i que es donava un intercanvi de cassettes com de cromos. Però si la integrasa està silenciada no es donarà l’intercanvi. Llavors es va descobrir que la integrasa està controlada per LexA perquè a la cèl·lula només li interessa canviar quan està sota estrès – en realitat els cassettes venen del propi superintegró, i com és lògic si tenim 176 cassettes no s’expressaran tots, la RNA polimerasa no arriba fins el final, és inviable; s’expressen els 10 primers i el desè ja s’expressa en una concentració molt baixa.
Però la integrasa a més d’integrar cassettes també s’encarrega d’escindir els cassettes. Així com en els bacteriòfags els escindia i els integrava ella mateixa, aquí també; quan estem sota estrès, es produeix molt LexA, tindrem molta integrasa, s’escindeixen molts cassettes i també se n’integren molts i es dóna una reorganització de la bateria enzimàtica per buscar una combinació per superar la situació d’estrès fins que les condicions tornen a ser favorables i la concentració de LexA i d’integrasa disminueix.
Els integrons mòbils amb resistències antibiòtiques també venen controlats per LexA de manera que també reordenen els gens de resistències en condicions d’estrès per a veure si li és més útil tenir en un ordre diferent els gens resistents (més concentració de un potser t’afavoreix en presència d’un bacteri en concret).
Si trobem dos plasmidis amb dos integrons diferents també es pot donar un intercanvi de cromos/integrons.
83 ...