Tema 2 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 22/04/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Tema 2: Replicación Generalidades La transcripción de ADN a ARN es muy diferente entre bacterias y eucariotas. Sin embargo, la replicación es mucho más similar.
La replicación del ADN es un proceso que necesita gran precisión (no tan necesaria en transcripción), pues los errores afectan permanente y además son hereditarios.
Mecanismo Se postularon tres posibles mecanismos para la replicación:    Semi-conservativa: método correcto.
El ADN parental se separa en 2, se une con un híbrido. Las células hijas disponen de: ADN parental + ADN nuevo.
Conservativa: se obtiene la cadena original y otra sintetizada de nuevo.
Dispersiva: obtendremos dos cadenas nuevas, cada una con fragmentos de la original y fragmentos nuevos.
Experimento de Meselson y Stahl Postulación semi-conservativa era la correcta. Consistía en que se extraía DNA y se centrifugaba. Éste DNA contenía el isótopo 15N, pesado, y quedaba muy abajo en la centrifugación.
El DNA se traspasaba entonces a un medio con 14N, menos pesado.
El DNA se replicaba y volvía a centrifugar, y la banda subía, quedaba entra la de 15N y 14N.
Así se dedujo que las hebras de DNA disponían de una cadena inicial y otra hija. Éstas se podían separar desnaturalizando, y al centrifugar se separaban de nuevo en las dos bandas mencionadas.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Replicación de DNA La replicación presenta puntos de inicio y final de replicación. Es bidireccional en eucariotas, pero unidireccional en algunos virus, plásmidos (de procariotas) y mitocondrias.
En eucariotas no empieza en un solo punto sino en varios (cromosomas mucho más grandes), son los orígenes de replicación. En ellos se forman burbujas de replicación, cuyos extremos son horquillas de replicación. A partir de las horquillas, el DNA parental se desenrollar para facilitar el proceso.
Síntesis de DNA La síntesis de DNA transcurre en dirección 5’→3’ y es semi-discontinua. Cuando se abre la doble hélice desde el origen, tenemos la burbuja dividida por la mitad. Partiremos desde el origen hasta las horquillas:  Si observamos el fragmento que va de 3’→5’, la cadena sintetizada será continua, ya que es antiparalela (va de 5’→3’, es el sentido de la síntesis). Es la cadena conductora. En la nueva hebra, sólo habrá un cebador (al principio).
 En el fragmento de la cadena parental que va de 5’→3’, la enzima sintetizadora tendrá que avanzar sintetizando fragmentos (pues la cadena sintetizada tiene sentido 3’→5’, contrario a la síntesis). Son los fragmentos de Okazaki. La nueva cadena será discontinua y contendrá DNA y secuencias cebadoras de RNA al inciio de cada fragmento. Esta nueva cadena es la cadena retrasada.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología La síntesis del DNA se hace de 5’→3’. De este modo si tenemos un error podremos cortar el último nucleótido y quedará un OH 3’. Así, podrá venir otro nucleótido con tres fosfatos y unirse a la cadena por el fosfato α, liberando los grupos β y γ. Si la síntesis fuera en sentido inverso, al cortar para reparar, quedaría un monofosfato de modo que los dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato) no podrían realizar ninguna reacción para unirse a la cadena porque no dispondría de la energía para formar el enlace fosfodiéster.
Nucleasas El DNA es degradado por acción de nucleasas, enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos. Según si actúan sobre DNA o RNA, distinguimos:   Desoxirribonucleasas o DNasas.
Ribonucleasas o RNasas.
También podemos distinguir por su función (algo similar en protesasas):   Exonucleasa: la enzima degrada por los extremos yendo de 5’→3’ o de 3’→5’.
Endonucleasa: la enzima reconoce secuencias de nucleótidos y actúa sobre secuencias diana.
DNA polimerasas Requisitos para actuar:    Presencia de DNA molde Cebador con un OH 3’ libre.
dNTPs.
Es un proceso muy preciso, realizado en sentido 3’→5’ para facilitar la corrección.
Estudiaremos la I, II y III de procariotas. En eucariotas hay muchas más, dedicadas a la corrección de errores. Todas tienen actividad polimerasa 5’→3’ y exonucleasa 3’→5’ (corrige apareamientos erróneos antes de seguir).
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología DNA polimerasa I Posee una subunidad. Funciones:   Exonucleasa 5’→3’. Degrada el DNA o RNA que se encuentra por delante. Elimina los fragmentos de Okazaki, y rellena los hue cos con DNA. Cuando la enzima se encuentra un nick o hueco, detecta el OH 3’ y elimina el trozo de RNA del fragmento de Okazaki, resintetizándolo con DNA (sitio activo de polimerización). Esto genera otro Nick más adelante.
Así, se provoca una translación de la mella que acabará siendo resuelta por una ligasa.
Exonucleotídica 3’→5’. Detecta bases mal apareadas.
Al encontrar un fallo, puede regresar cortando y resintetizando la secuencia errónea.
Posee diferentes sitios activos, divididos en 2 dominios:  Dominio C-ter, posee sitios activos de polimerización y corrección 3’→5’ (proofreading), lógicamente cercanos entre sí. Conocido como fragmento KF (Fragmento de Klenow). Forma de mano o de cangrejo.
 Dominio N-ter, exonucleasa 5’→3’.
Funcionamiento del Fragmento de Klenow Para funcionar, el DNA entra al centro de la enzima donde se va polimerizando. Si hay un error, entra al dominio de proofreading, donde se corrige antes de continuar.
El fenomeno de translación de la mella es útil también para el marcaje de DNA, usando un fragmento KF que tome nucleótidos marcados radiactivamente.
DNA polimerasa II Posee 7 subunidades que provienen de genes diferentes. Función de reparación.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología DNA polimerasa III Posee más de 10 subunidades. Función más compleja, de replicación a gran escala. Las subunidades más importantes son:     α y ε, que ayudan a polimerizar.
τ, estabiliza la enzima, hace de grapa (hay 2 de ellas).
β, regula la procesividad. Consiste en 4 subunidades agrupadas de 2 en 2, haciendo las veces de anillos que toman el DNA, aumentando su procesividad.
Complejo ϒ, permite que la cadena retrasada se recoloque (polimerasa se va soltando y uniendo por la cadena retrasada).
Parámetros   Velocidad de polimerización: es lenta para quitar el cebador de Okazaki y algunas reparaciones (polimerasas I y II), pero mucho más rápida para la replicación (polimerasa III).
Procesividad: número de nucleótidos polimerizados sin que se suelte la polimerasa.
o Pequeña para eliminar el cebador (polimerasa I).
o Algo mayor para reparaciones (polimerasa II).
o Muy elevada para la polimerasa III, que replica la cadena conductora (muy larga).
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología Replicación del DNA en procariotas Existen numerosas proteínas implicada. Tener en cuenta que DNasa hace referencia a enzimas, y las de tipo DnaA son proteínas. Dividiremos entre:  Proteínas necesarias para iniciar la replicación: o DnaA: reconoce la secuencia “ori” (de origen de replicación).
o DnaB, helicasa: abre la hélice, separa las 2 cadenas.
o DnaC.
o DnaG, primasa: sintetiza cebadores de cadena retrasada.
o SSB: se une a DNA de cadena sencilla, lo protege.
o Girasa o DNA topoisomerasa II: controla el superenrollamiento.
o Dam metilasa: metila A (Dcm metila C).
o HU, FIS e IHF estructuran el cromosoma de la bacteria y participan en la replicación. Equivalentes en función a histonas en cromatina.
 Proteínas necesarias para la elongación: o DNA polimerasa III: replica.
o DNA polimerasa I: elimina cebadores.
o Helicasa o Girasa: vuelve a ser la misma topoisomerasa.
o Primasa o Ligasa: une DNA tras eliminar cebador.
o SSB Orígenes de replicación  En procariotas: 1 solo origen, oriC. El DNA procariota tarda 40 minutos en replicarse completamente. Sin embargo hay una nueva generación cada 20 minutos.
Cuando se ha empezado a replicar y se tiene un fragmento ya sintetizado, en éste se abre otro origen de replicación, introduciendo un replisoma. Cada generación, por lo tanto, se lleva un DNA ya completo que ya ha empezado a replicarse. Se conoce como cromosoma multihorquilla.
 En eucariotas: hay un origen de replicación cada 3000-300000 pares de bases. No se han encontrado secuencias de term inación, chocan horquillas.
Biología molecular Nanociencia y nanotecnología La replicación procede por etapas: inicio, elongación y terminación.
Inicio Se da en oriC, de 245 bp. El primer segmento es el DUE (DNA unwinding element).
Región con un ordenamiento en tándem de tres secuencias de 13 pb cada uno. Contiene muchos residuos de T y A,lo que facilita abrir las dos cade nas de DNA.
El segundo segmento son cuatro cajas de DnaA, cuatro sitios de fijación de la proteína DnaA de 9 pb cada uno.
Cuando las proteínas de DnaA se unen a las cajas, se colocan formando una hélice sobre la que se enrollará el DNA (generan superhélice negativa. Al girar, el segmento DUE se abre separando las cadenas de la doble hélice. En el espacio que quede al desnaturalizar el DUE se van a introducir dos helicasas (la DnaB se unirá por acción de la DnaC, que se hidrolizará, liberándose gastando ATP). Cada proteína DnaB se quedará en una de las cadenas de la doble hélice y a partir del punto de origen, cada una seguirá el sentido 5’→3’, desplazándose por la cadena parental y marcando el ritmo de la replicación.
La primasa identifica entonces la DnaB y se une a ella. Las SSB se irán uniendo al DNA simple a medida que se vaya abriendo la cadena, protegiéndola de endonucleasas. La subunidad β de la DNA polimerasa III también reconocerá la cadena sencilla y se unirá a ella para poder replicar. Como la primasa deberá ir sintetizando cebadores Biología molecular Nanociencia y nanotecnología continuamente, la cadena retrasada hace un loop para tener espacio. Por delante de la helicasa necesitaremos tener una girasa (topoisomerasa II) que mantenga el superenrollamiento estable.
La RNA polimerasa puede fabricar el primer cebador, pero se necesita de otras enzimas que fabriquen los cebadores (primasa).
Puede apreciarse a la aparición del nick Unión de los fragmentos de Okazaki La DNA polimerasa I reconoce un OH 3’, y se activa su función exonucleasa 5’→3’, quitando el cebador y sustituyéndolo por el fragmento de DNA correspondiente, trasladando la mella (punto sin enlace fosfodiéster).
Finalmente, una DNA ligasa reconoce los fragmentos de DNA a cada lado de la mella, y cataliza la formación de un enlace fosfodiéster. Esta enzima es muy útil en los laboratorios, usada para cerrar plásmidos en la tecnología del DNA recombinante.
Terminación Las secuencias terminales se encuentran justo enfrente del origen de replicación, asegurando que ambas horquillas acaben en el mismo punto.
La terminación se da al llegar a una serie de secuencias en el DNA. Las proteínas Tus se unen a estas secuencias, algunas del derecho y otras del revés. La horquilla de replicación puede atravesar una Tus que esté en el sentido de replicación. Sin embargo, si la Tus se encuentra en Biología molecular Nanociencia y nanotecnología sentido inverso la horquilla se detendrá, inhibiendo la helicasa DNaB, y los cromosomas quedan unidos por acción de la topoisome rasa II.
Se detiene la replicación normal. Aun así, en E.coli la polimerasa III puede pasar a través de la Tus. Copia el DNA pero como no hay helicasa se queda concadenado. Se necesita una topoisomerasa IV para separar la nueva cadena de la doble hélice.
Replicación en eucariotas En eucariotas, la velocidad de replicación es mucho menor, pero se compensa con la presencia de numerosos orígenes de replicación, controlada mediante las ciclinas del ciclo celular.
Durante la interfase se constituye un ORC (origin replication complex, equivale a DnaA) en todos los orígenes de replicación, lo que “licencia” el DNA. Una vez iniciada la fase S, teniendo ya todo el DNA “licenciado”, se sintetiza un inhibidor para la CDT1 (como DnaC) de modo que no se monte otro origen de replicación.
El complejo se forma por unión por ATP de la proteína ORC al DNA.
A la ORC se une una proteína CDC6 que permitirá la unión de la CDT1 (DnaC) junto a la MCM2-7 (DnaB). La CDC6 y la CDT1 se hidrolizan y la ORC traspasa la DnaB a la cadena de DNA. Cuando la mitosis termina, las ciclinas desaparecen.
DNA polimerasas en eucariotas      α: Replica la cadena retrasada (actividad primasa). Tiene un cebador diferente, pone algo de DNA, pero no todo. δ pone el resto.
β: Equivale a polimerasa II (reparación).
ϒ: En mitocondria, replicación de DNA.
δ: Replica DNA en cadena conductora y retrasada.
ε: Equivale a polimerasa I, reparación.
Acortamiento de telómeros El cebador que se encuentra en el extremo de la doble hélice no se puede eliminar porque las enzimas no tienen OH 3’ donde empezar. Por lo tanto, en teoría con cada replicación obtendríamos una cadena más corta (fragmento de Okazaki no puede ser Biología molecular Nanociencia y nanotecnología replicado) hasta que se llegaría a eliminar información genética obteniendo cromosomas más pequeños.
Para solucionar este fenómeno, actúa la telomerasa (ribonucleoproteína), que añade secuencias teloméricas en el extremo 3’ de las dos hebras molde. Así, la primasa añade otro primer externo, en el que la DNA polimerasa añadirá más dNTPs. El acortamiento de los telómeros se relaciona con el envejecimiento y el cáncer. Sin embargo, actividad telomerasa excesiva también tiene que ver con el cáncer. La telomerasa:    Ribonucleoproteína, DNA polimerasa dependiente de RNA.
Contiene RNA catalítico, que además usa como propio molde.
Actividad transcriptasa inversa.
La cadena que será el molde para la retardada se une por el extremo 3’ a la secuencia propia de la telomerasa. Se hibrida y se polimeriza un segmento extra desde el extremo de la cadena molde. El telómero se protege formando un Lazo T, se mete el último trozo, 3’ –el extra de la molde para la retardada-, a través de las proteínas TRF1 y TRF2, en la misma doble hélice dejando una triple hélice.
...