Bloc II B (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2017
Páginas 16
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia I Silvia Expósito Determinació del pes sec: Tenim un medi de cultiu i utilitzem uns recipients de vidre (pesa filtres), els tarem, posem una quantitat coneguda del medi de cultiu al recipient i ho escalfem fins que s’hagi evaporat tota l’aigua i que quedi només el pes sec (cèl·lules assecades)  fins que el pes sigui estable llavors ho traurem, podem valorar així el creixement perquè a la fase exponencial el creixement és equilibrat llavors el nombre de cèl·lules augmenta de manera proporcional a qualsevol component de la cèl·lula així com la massa total. El gran inconvenient és que es perd la mostra. També podem mesurar proteïnes, DNA, nitrogen...
B) Mètodes no exactes: Densitat òptica: Determinem la terbolesa del cultiu, com més concentració de bacteris hi ha més tèrbol està el recipient. No serà útil quan el medi de cultiu sigui tèrbol de per si. Conforme augmenta el nombre de bacteris el que fan és refractar la llum, per això es veu tèrbol i també augmenta la densitat òptica del cultiu.
Inconvenients: els medis de cultiu tèrbols no són útils, hi ha bacteris que quan creixen fan agregats i no suspensions uniformes llavors l’augment de DO serà per sota del real, hi ha bacteris que formen biofilms a les parets dels recipient i el valor seria també per sota del real, si arribem a números de cèl·lules molt elevats tenim valors erronis en la recta semi-logarítmica (la llum pot ser refractada per més d’una cèl·lula donant valors més petits dels que haurien de sortir).
Comptadors electrònics, citometria de flux: Fem passar per un forat molt petit les cèl·lules una a una per una solució salina, hi ha una llum làser i un detector, així es detecta cada cèl·lula que passa per davant del detector. S’utilitzen molt en anàlisis clíniques per hematologia.
Comptatge directe al MO, càmera de Neubauer: No es pot diferenciar entre cèl·lules viables i no viables. La càmera de recompte és un portaobjectes que si el mirem de costat veiem que té una part més baixa que els extrems i és un conjunt de quadres. Normalment es fan dilucions per poder comptar bé les cèl·lules i que no estiguin solapades, es carrega la càmera amb una pipeta amb un volum donat pel fabricant, es col·loca al microscopi i com a mínim arribem a comptar 100 cèl·lules. Després es calcula la mitjana de cèl·lules/quadre i les cèl·lules/mL, en recompte en placa obtenim sempre valors més petits perquè només hi contem les viables.
Un altre mètode que utilitzem és una recta de calibratge on fem una gràfica per comparar un mètode de lectura ràpida i poc exacte amb un mètode més lent però més exacte, com per exemple un recompte de cèl·lules viables enfront la densitat òptica: Amb els valors de les dues proves s’obté una recta, és útil perquè així ens beneficiem dels avantatges del dos mètodes: la feina es fa una sola vegada i gràcies a aquesta recta podem saber que una determinada DO equival a una concentració de cèl·lules que a mi m’interessa, així els altres dies només cal mesurar la DO (mètode ràpid) i extrapolar a la recta, si cal diluir la mostra o deixar incubant una estona més. Molt útil per fer estudis on calgui sempre inocular la mateixa quantitat de bacteris. Hem de tenir en compte que cada recta de calibratge serà útil per una espècie de MO en concret.
Microbiologia I  Silvia Expósito Cultiu continu o sistema obert: PRODUCCIÓ INDUSTRIAL: Per utilitzar un cultiu de microorganismes per fer-ne una producció industrial, cal utilitzar un tipus de cultiu que garanteixi que la producció dels productes que necessitem sigui constant al llarg del temps i de la mateixa qualitat. Hem d'obtenir un cultiu continu dels microorganismes.
Què fem per obtenir un cultiu continu? Anem afegint nutrients i eliminant els productes tòxics del metabolisme que es van acumulant. Com? Hem de fer créixer els microorganismes amb un sistema que permeti afegir medi fresc i eliminar els productes tòxics: sol ser un mètode de sobreeixidor. I com es regula aquest sistema? Hi ha dos mecanismes diferents.
Al ser un sistema obert es pot variar el medi de cultiu. Tenim un vas de cultiu on es duu a terme el creixement, un reservori on hi ha medi fresc estèril i un sistema de vessament per on va sortint el medi “brut”, també pot ser que hi hagi una alimentació d’aire o no segons si fem créixer bacteris aerobis o anaerobis.
L’objectiu d’aquest cultiu és mantenir el creixement dels bacteris en fase exponencial durant un període de temps indefinit, s’aconsegueix variant els nutrients (afegint medi fresc) i les substàncies tòxiques (eliminant-les) que deriven del metabolisme.
Tenen interès perquè els bacteris intervenen en processos de biotransformació, en els que durant el cultiu els bacteris produeixen substàncies amb una certa utilitat per nosaltres (sucres, alcohols, medicaments, biomassa...).
Inoculem el vas de cultiu amb el que vulguem fer-los créixer fins que arribin a una fase exponencial i per mantenir-los en aquesta fase, cada vegada que arribem a una concentració determinada de cèl·lules i a intervals constants de temps s’haurà d’introduir el medi fresc i al mateix temps eliminar els productes tòxics o algunes cèl·lules mortes de manera que el volum del vas de cultiu sigui sempre constant.
Quan a la fase exponencial s’assoleix un estat d’equilibri també s’anomena estat estacionari però no té res a veure amb la fase estacionària de la corba de creixement. Quan arriba l’estat d’equilibri el nombre de cèl·lules i el seu estat metabòlic seran constants i podem mantenir el creixement de la població de forma indefinida. Dos sistemes de cultiu continu principals: - Turbiostat: es basa en la determinació de la densitat òptica que hi ha dins del vas de cultiu a partir d’una cèl·lula fotoelèctrica, quan el sistema detecti que la concentració de cèl·lules ha augmentat per sobre del valor que nosaltres hem fixat, s’obrirà la vàlvula de control perquè entri medi fresc i l’altra vàlvula perquè surti el cultiu pel sistema de vessament.
Inconvenients: la terbolesa pot ser no homogènia i llavors el sistema pot ser erroni, la velocitat de dilució no serà constant; és un sistema que treballa millor a altes velocitats de dilució i fa que el sistema sigui molt inestable i que pugui fallar amb molta facilitat perquè estem molt propers a que es produeixi el rentat del turbiostat.
Microbiologia I - Silvia Expósito Quimiòstat: dissenyat per Monod al 1950. Controla la densitat de població perquè al medi de cultiu hi ha els nutrients indispensables pel bacteri en una quantitat limitada; i la velocitat específica de creixement també és controlada per la velocitat de flux.
El flux d’entrada de medi fresc ha d’ajustar-se en funció de la taxa de creixement per evitar que es produeixi una eliminació de les cèl·lules del cultiu.
Si hi ha una concentració de nutrients limitants baixa, els bacteris comencen a créixer i s’esgoten ràpidament els nutrients i es donarà la mort cel·lular  rentat del quimiòstat, el sistema fracassa. Si hi ha una velocitat de dilució (entrada de medi fresc) molt alta també es produeix el rentat del quimiòstat perquè els bacteris no podran créixer a una velocitat suficient per compensar tot el medi fresc que entra i al sortir pel vessament hi haurà cèl·lules que encara estiguin creixent.
La concentració de cèl·lules, en canvi, és constant en un rang de dilucions molt ampli i és quan estem en una fase d’equilibri o estat estacionari del quimiòstat, l’estat metabòlic de les cèl·lules també serà constant. És un rang bastant ample perquè el quimiòstat s’autocorregeix, és a dir, si hi ha poca velocitat de dilució però dintre dels paràmetres ho compensa augmentat la velocitat específica de creixement (el temps de generació disminueix).
 Control de la velocitat de creixement: Per ajustar un cultiu constant cal fer que la velocitat específica de creixement sigui igual a la velocitat de dilució. Com? Ajustant el creixement en funció de la concentració del substrat limitant ja que al medi fresc, aquesta concentració serà diferent a la del contenidor, on es dilueix.
Cr · D = concentració que entra des del reservori de substrat limitant DC = el que s'elimina amb l'extracció 𝑑𝐶 𝑐𝑟𝑒𝑖𝑥𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡 𝜇𝑋 = 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑡 = = 𝑑𝑡 𝑌 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑖𝑢 𝑑𝐶 + 𝐷𝐶 = 𝐶𝑟 · 𝐷 𝑑𝑡 Microbiologia I Silvia Expósito Si substituïm i tenint en compte que el que volem és μ = D (número de cèl·lules que s’eliminen = número de cèl·lules que es generen, per mantenir el cultiu continu) llavors: 𝑌 · (𝐶𝑟 − 𝐶) = 𝑋 També s'han de controlar altres paràmetres. Amb un fermentador, que permet el creixement constant, s'ha de controlar el pH, la temperatura, el control d'escuma... Això es fa amb bombes peristàltiques que ajusten les diferents condicions.
Arriba un moment que la velocitat de dilució és tan elevada que no es pot compensar disminuint el temps de generació i és quan es dóna el rentat del quimiòstat.
 Control de la concentració cel·lular: Si a part de modificar la velocitat de dilució, modifiquem el segon paràmetre que seria la concentració del nutrient limitant s’observa que arribem a la fase estacionària del quimiòstat amb una concentració de cèl·lules més elevada que abans. Els dos paràmetres es poden controlar de manera individual.
Part matemàtica: 1a llei Monod: 𝜇 = 𝜇𝑚à𝑥 · 𝑆 𝐾𝑠 + 𝑆 𝐷 = 𝜇𝑚à𝑥 · 𝑆 𝐾𝑠 + 𝑆 sabem que D = velocitat específica de creixement Substrat que entra = substrat consumit + substrat no consumit 𝑌 · (𝑆𝑟 − 𝑆) = 𝑋 Y: rendiment, X: nombre de cèl·lules Sr: substrat reservori S: substrat no consumit  Paràmetres que influeixen en el creixement de microorganismes: De microorganismes hi ha molta diversitat i es troben a tot el món fins i tot en llocs on les condicions són molt extremes, han de desenvolupar un metabolisme especial per poder sobreviure.
Extremòfils: bacteris que s’han adaptat a créixer en condicions extremes Pressió osmòtica: Quan augmenta la P osmòtica en un medi disminueix l’activitat de l’aigua, els bacteris es classifiquen per: - Osmotolerants: poden créixer a P osmòtiques elevades però no és indispensable que la P sigui elevada pel seu creixement.
Osmòfils: només creixen si la P osmòtica és elevada.
Parlem d’osmotolerants i osmòfils quan els microorganismes creixen en medis rics en sucres o en soluts no iònics.
Quan els soluts són sals iòniques els bacteris s’anomenen halotolerants o halòfils, és el mateix concepte però amb concentracions de clorur sòdic.
Microbiologia I Silvia Expósito El Mannitol-hipersalí és un medi de cultiu diferencial i selectiu que conté una gran quantitat de clorur sòdic que permet créixer Staphilococcus però en TSA també creixen i no té una elevada concentració de sals, llavors aquest microorganisme seria halotolerant; també pot ser que en concentracions de sals no pugui créixer, llavors parlaríem de no halòfils.
Halòfils discrets: necessiten concentracions 1-6% de NaCl Els halòfils moderats i els extrems són els que poden créixer a concentracions gaire bé saturants de sals.
Quan estem en ambients extremadament secs tenim bacteris: - Xerotolerants Xeròfils  Creixement bacterià en medis ambientals: Aigua: L’aigua és el solvent essencial, pot ser reactant o necessari perquè es produeixin reaccions a la cèl·lula, també facilita que els nutrients hi arribin, manté la turgència de la cèl·lula que és important en el moment de la divisió i té també funció estructural en proteïnes i àcids nucleics. Quan augmenta la P osmòtica disminueix l’activitat d’aigua  indica la quantitat d’aigua que es troba a un microorganisme; també disminueix la turgència de la cèl·lula. La quantitat d’aigua que hi hagi en un medi també depèn de la quantitat de soluts perquè la poden captar i fer que no estigui disponible per la cèl·lula.
A part de la pèrdua de turgència, també pot haver-hi desnaturalització de proteïnes, mutacions i fragmentacions al DNA per l’augment de la P osmòtica.
Els bacteris que no són halòfils o osmòfils necessiten una activitat d’aigua entre 0,9 i 0,98.
Aquest augment de la P osmòtica el compensen a través dels soluts compatibles, substàncies sintetitzades per la cèl·lula o captades de l’exterior i s’acumulen al citoplasma, i això depèn de si estan codificats genèticament, la resistència a la P osmòtica ve donada pel codi genètic. Els soluts compatibles compensen la P osmòtica impedint la pèrdua d’aigua i mantenint la turgència. Característiques: no han d’interferir en cap reacció bioquímica que es doni dins de la cèl·lula.
Exemples: aminoàcids (prolina, glicina, glutamat...), sucres, alcohols... també tenim alguns arqueobacteris que utilitzen KCl.
La Trehalosa (sucre) la utilitzen molts bacteris que necessiten concentracions elevades de sal, també s’utilitza per conservar fongs i llevats.
Si disminuïm la quantitat d’aigua perquè augmentem la P osmòtica, estem inhibint el creixement bacterià, per tant, així es poden conservar molts aliments amb sucres (més del 50% de sacarosa), fumats o conservacions amb sals.
Microbiologia I Silvia Expósito pH: El pH mesura la concentració d’ions H+ que hi ha al medi. Classificació: - Acidòfils: de pH òptim 0 a 5,5 (fongs, que creixen molt millor a pH àcids entre 4 i 6) Neutròfils: pH òptim de 5,5 a 8 Alcalòfils o basòfils: pH òptim entre 8,5 i 11,5 Alcalòfils extrems: pH òptim superior a 10 És útil saber-ho perquè si amb un gel per aplicar a les mucoses fem el pH cada cop més bàsic fem que el microorganisme creixi cada cop més lentament afavorint l’eliminació dels fongs (bucal o vaginal), no es poden usar molt temps perquè eliminaríem la flora natural.
Els alcalòfils tenen interès industrial perquè alliberen enzims com lipases, proteases,... i s’utilitzen per fabricar sabons.
Danys cel·lulars pels valors extrems de pH: desnaturalització de les proteïnes perquè hi ha una dissociació de grups carboxil o grups amino i una desestabilització de les membranes plasmàtiques per inhibir el creixement, ionització de molècules de nutrients que ja no podran ser captats pel microorganisme.
Mecanismes de resistència per mantenir el pH citoplasmàtic: fan entrar o sortir H+ per mantenir el pH citoplasmàtic, que sempre serà neutre tan en acidòfils com en alcalòfils. Els acidòfils intercanvien protons a l’exterior per ions sodi o potassi en neutròfils. També tenim buffers per estabilitzar el pH, substàncies que tenen capacitat d’amortir petites variacions de pH. Per disminucions petites de pH es sintetitzen enzims com l’ATPasa per l’intercanvi de protons i si són més grans apareixen les xaperones per ajudar a la compensació.
Temperatura: És el factor més important, intervé directament en les reaccions químiques que es donen a l’interior de la cèl·lula.
Temperatures cardinals: temperatura òptima de creixement amb la que el bacteri creix a la màxima velocitat, temperatura mínima a partir de la qual el bacteri ja no pot créixer i temperatura màxima a partir de la qual el bacteri ja mor.
A la T mínima ja no poden créixer perquè els lípids de membrana es gelifiquen i impedeixen l’intercanvi de nutrients, conforme baixem la temperatura els processos de transport cada cop seran més lents fins a arribar a un valor en el que els elements són tan densos que s’atura el creixement de la cèl·lula; si baixem la temperatura sota la mínima la cèl·lula morirà per lisi. Els bacteris es poden conservar en gel amb crioboles que són uns vials que venen amb líquid que conté substàncies crioprotectores; o amb glicerol o DMSO que són crioprotectors que impedeixen la formació de cristalls de gel i la lisi de la cèl·lula.
A partir de la T òptima de manera molt brusca arribem a la T màxima on es dóna la desnaturalització de proteïnes provocant un col·lapse a les membranes i la lisi cel·lular tèrmica.
Classificació: - Psicròfils: creixen a baixes temperatures, entre 0 i 20ºC Mesòfils: creixen a temperatura ambient, 20 a 45ºC Termòfils: a temperatures elevades, 55 a 70ºC Hipertermòfils: a temperatures superiors als 100ºC Microbiologia I Silvia Expósito Adaptacions a altes temperatures: - - - Resistència a la temperatura de les proteïnes: o Hi ha seqüències d’aminoàcids a les proteïnes poc freqüents que les estabilitzen a temperatures elevades impedint la seva inactivació i desnaturalització (modifiquen el plegament).
o Acumulació de soluts (2,3 difosfoglicerat cíclic) que estabilitzen les proteïnes o Presència de proteïnes especials que estabilitzen altres proteïnes per replegament a temperatures properes al límit de creixement (ATPasa i xaperones) Resistència a la temperatura dels àcids nucleics: o Presència de proteïnes d'unió al DNA o Concentracions elevades de Mg o DNA girasa inversa: és una topoisomerasa que introdueix superhèlix (+) o Altes proporcions de G i C en el DNA que li donen estabilitat i augmenta el punt de fusió d'aquest àcid nucleic (alguns bacteris hipertermòfils, però tenen més A i T) Estabilitat de les membranes: o Elevat contingut de lípids rics en àcids grassos saturats o Presència de cadenes isoprenoide ramificades (fitanil , difitanil) unides per enllaços èter al glicerol (en bacteris hipertermòfils) Adaptacions a baixes temperatures: - - Resistència a la temperatura de les proteïnes: o Major quantitat de plegaments hèlix α o menor quantitat de fulles β en l´ estructura secundària de les proteïnes o Major quantitat d’aminoàcids polars i menor d'hidrofòbics en les proteïnes el que ajuda a mantenir-les flexibles Estabilitat de les membranes o Presència de lípids insaturats i/o de cadena curta i disminució d'àcids grassos cíclics permetent que les membranes es mantinguin en un estat semifluid Concentració d’oxigen: N'hi ha que realment necessiten oxigen per créixer, són els aerobis estrictes com els microaeròfils, que creixen quan l’oxigen es troba només a baixes concentracions. Els anaerobis, poden ser facultatius que creixen sense oxigen però si n'hi ha no els molesta o estrictes que només creixen en absència d'oxigen ja que no el toleren. També tindríem els anaerobis aerotolorerants que poden créixer en presència d’oxigen però no el poden utilitzar.
La resistència a l’oxigen depèn de la sensibilitat intrínseca dels enzims cel·lulars a l’oxigen (catalasa) i de la capacitat de descompondre H2O2 i O2- (amb la superòxid dismutasa) que són les formes tòxiques de l’oxigen.
Pressió hidrostàtica: La majoria de microorganismes estan sotmesos a pressions d'1 atm com nosaltres però s'han arribat a trobar microorganismes a fosses abissals sota una pressió de 600-1000 atm, són els barotolerants.
Microbiologia I Silvia Expósito Els baròfils són MO que no poden viure a pressions inferiors a 400-500 atm, exemple: un microorganisme aïllat de l'intestí d'un crustaci que creix en una fossa abissal a més de 10.000 metres de profunditat i que no s'aconsegueix que creixi si no és a més de 400 atm.
En bacteris no baròfils les altes pressions provoquen: - Inhibició de la síntesi de RNA, DNA i proteïnes Mal funcionament en el transport de membrana Disminució de la taxa d’activitat de diversos enzims Radiacions: Els bacteris les poden aprofitar si fan fotosíntesi però no els hi sol afectar. La llum UV els podria afectar com a nosaltres però la capa d'ozó els protegeix. A més, alguns poden recuperar-se dels danys d'una radiació que podria matar a una persona: són els radiococcus.
Les radiacions UV destrueixen a la majoria de microorganismes mitjançant la formació d’uns dímers de timina (TT) amb els que s’inhibeix la replicació i també degradant el triptòfan.
Comunicació entre cèl·lules: El creixement de les poblacions bacterianes està condicionat per senyals que els microorganismes poden emetre i captar i que els fan molt més eficients, és el quòrum sensing. Quan els microorganismes creixen en un cultiu no actuen com a organismes separats: s'ha vist que en determinades condicions actuen com una comunitat. Aquest fenomen té com a funció millorar l'efectivitat de la població; emeten molècules que fan de senyals que són captades per la resta d'individus de la població i en funció de la senyal reaccionen comunitàriament. Un exemple de bacteri és el Vibrio fischeri; la producció de toxines i la bioluminescència responen a aquest fenomen.
Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 11. CONTROL DEL CREIXEMENT BACTERIÀ  Control del creixement bacterià: Ens referim a mètodes per prevenir la transmissió de malalties o per eliminar o reduir microorganismes que són responsables d’infeccions. Els mètodes que controlen el creixement es divideixen en: - Físics: calor, filtració, radiació Químics Esterilització: procés que elimina totes les formes de vida microbiana (cèl·lules vegetatives, endòspores microbianes, virus, bacteris, fongs, protozous...) presents en un objecte o en una mostra; és un mètode absolut, l’objecte és totalment estèril o no ho és, hi ha d’haver l’absència total de forma microbiana.
Desinfecció: destrucció, inhibició o eliminació de com a mínim els microorganismes que poden causar una malaltia, s’aplica sobre superfícies o objectes inerts. A dosis elevades seran irritants per la pell, per això s’utilitzen sobre matèria no viva.
Antisèpsia: destrucció, inhibició o eliminació de com a mínim els microorganismes que poden causar una malaltia, s’aplica sobre superfícies o teixits vius.
 Cinètica de la mort bacteriana: Quan posem en contacte la solució bacteriana amb un agent antisèptic o que causi la mort, la mort no es dóna de manera espontània a tots els microorganismes sinó que si representem el logaritme respecte el temps observem una recta amb pendent negatiu, per això diem que la cinètica de mort bacteriana és de tipus exponencial o logarítmica.
Depenent de la mida de la població, l’agent que fem servir actuarà més ràpid o més lent, també dependrà de la composició de la població perquè no tots els MO tenen la mateixa sensibilitat a aquests agents. Els més resistents poden ser les endòspores bacterianes, ja que són formes que es creen quan les condicions del medi són adverses, necessitem condicions especials perquè els bactericides siguin efectius. També dependrà de la concentració o intensitat de l’agent antimicrobià, hi ha alguns que a molta concentració tenen efecte sobre les endòspores però altres que són menys efectius com l’alcohol de 96º enfront el de 70º.
Durada de l’exposició: depenent del temps que l’agent estigui en contacte amb els bacteris farà una acció o una altra. El temps també dependrà de la superfície on apliquem l’agent. La temperatura també és molt important perquè a elevades temperatures alguns agents tenen efectes sobre les endòspores. Les condicions ambientals del medi que volem tractar també es tenen en compte, com si el pH és àcid (potencia l’efecte de la temperatura), ...
 Mètodes per calor: Dos grups: calor seca i calor humida. (LLIBRE PRÀCTIQUES) La calor seca carbonitza els microorganismes i per això els eliminem, s’utilitza la incineració (flama) per esterilitzar les nanses, pinces metàl·liques... i un altre mètode que és el forn Pasteur on apliquem 160º durant dues hores o 170º durant una hora per esterilitzar material de vidre sempre que no sigui volumètric i material metàl·lic, també quan tinguem substàncies que no es poden utilitzar per autoclau. Són mètodes molt més lents, segons el material a esterilitzar escollim un mètode o altre.
Microbiologia I Silvia Expósito La calor humida és molt més eficaç perquè té molt més poder de penetració, causa la desnaturalització de proteïnes i la degradació del DNA: - - Ebullició: no és un mètode d’esterilització sinó de desinfecció perquè no elimina les endòspores bacterianes.
Ebullició intermitent o tyndal·lització: bullim a 100º - durant unes hores incubem a 30º - bullim a 100º... ho repetim tres vegades així eliminem bacteris, virus, fongs... i eliminem també les endòspores perquè a 30º germinaran i al tornar a 100º les acabem eliminant. Permet, per tant, l’eliminació d’endòspores, pot arribar a substituir a l’autoclau però no és el mètode d’elecció.
Autoclau: mètode principal d’esterilització, és el mètode més eficaç i més utilitzat, els únics que no es poden esterilitzar seran substàncies termosensibles com alguns sucres, pols higroscòpiques (aniran al forn Pasteur), olis... hem de permetre que el vapor d’aigua penetri dins del material a esterilitzar, els tubs no poden estar tancats hermèticament.
És una gran olla a pressió amb una resistència on nosaltres posem aigua, depenent del material que posem l’haurem de protegir, quan es tanca es forma vapor que mou l’aire, es tanquen les vàlvules formant vapor a saturació, es va formant més vapor per augmentar la pressió a l’interior i així tenir temperatures elevades (121º) durant 15 minuts, si el volum de material és molt gran augmentarem la quantitat de temps.
Podem posar controls per garantir que s’ha complert l’esterilització, com una cinta amb un tractament químic que canvia de color o posar alguna endòspora bacteriana i observar si germina o no.
Hem de tenir eines per saber si els mètodes funcionen, paràmetres que es mesuren: - - PMT (punt de mort tèrmica): temperatura més baixa a la que una suspensió bacteriana es destrueix en 10 min però no té en compte les condicions ambientals.
TMT (temps de mort tèrmica): menor temps necessari per destruir tots els organismes d’una suspensió bacteriana, a una temperatura específica i en altres condicions definides.
D (temps de reducció decimal): temps necessari per destruir el 90% dels microorganismes o espores en una mostra, a una temperatura específica.
Valor Z: augment de temperatura necessari per disminuir el temps de reducció decimal (D) a 1/10 (un logaritme) del seu valor.
Ex: Per endòspores de C. Botulinum , D121 = 0,204, si z = 10°C. Calcular el temps necessari per disminuir la població de C. Botulinum d’una llauna, que inicialment es sospita que pot ser de 1012 fins a 100: - Necessitarem 12 vegades el valor de D perquè volem reduir la població 12 vegades, 12xD = 2,45 min a 121º.
Per disminuir la temperatura d’esterilització 10º (ho diu Z) necessitem 10xD = 2,04 min.
En total necessitarem D = 2,04 x 12 = 24,5 min a 111º.
Altres mètodes de tractament per calor: Pasteurització: mètode desenvolupat al 1860 per Pasteur, va observar que els vins estaven contaminats per bacteris làctics i s’alteraven amb molta facilitat, va idear una formar per conservar el vi durant més temps sense alterar les seves propietats. S’escalfa a uns 63º durant 30 min per eliminar gran part d’aquests bacteris làctics, no és un mètode d’esterilització.
Microbiologia I Silvia Expósito Pasteurització ràpida: temperatures de 72º durant només 15 segons, conserva encara més les propietats, molt utilitzat sobretot en llet.
Esterilització a temperatura ultra elevada (UHT): tots els brics de llet, sucs... que no necessiten refrigeració, processos a altes temperatures de 140-150º durant només 1-3 segons.
 Radiacions: Per raigs UV: formen dímers de timina alterant el DNA i matant els microorganismes però el seu poder de penetració és molt petit, no travessa el vidre ni l’aigua, té un ús molt limitat. S’utilitza sobretot per esterilitzar aire o superfícies.
Radiacions ionitzants: per raigs X o γ causen mutacions al DNA però també poden alterar les proteïnes, el gran inconvenient és que el procés d’esterilització és molt car llavors s’usa per materials d’un sol ús pels que no hi ha altre mètode.
 Filtració: No és biocida, no mata les cèl·lules sinó que les retén. El diàmetre del porus ha de ser de 0.02 µm perquè sigui estèril el filtrat, sinó els virus poden travessar.
- Filtres en profunditat: formen molts canals per augmentar la superfície de filtració Filtres en superfície: formats per derivats de la cel·lulosa MÈTODES QUE ESTERILITZEN: calor seca (incineració o forn Pasteur), calor humida (autoclau i tyndal·lització), UHT, radiació UV, raigs X i γ i la filtració.
Ni l’ebullició ni la pasteurització esterilitzen.
 Control microbià per agents químics: GASOS: - - - - Òxid d’etilè: agent alquilant que principalment actua sobre els àcids nucleics, alta capacitat de penetració i eficaç, s’utilitza per material que és termosensible i no és corrosiu.
Inconvenients: és bastant tòxic, requereix temps llargs i abans d’utilitzar el material cal que s’airegi durant un temps, és inflamable i no és recomanable per esterilitzar roba.
Aparell similar a l’autoclau.
Gas plasma: peròxid d’hidrogen que quan es vaporitza amb radiofreqüències es transforma en plasma, no genera residus tòxics ni necessita aireig, el temps d’esterilització és molt més curt i és molt més fàcil de manipular. Inconvenients: no es pot utilitzar en tots els materials porosos (cel·lulosa, roba...) tampoc en líquids i cal empaquetar el material abans.
Formaldehid: a concentracions del 2%, inactiva les proteïnes i es fa servir per esterilitzar material clínic, medicaments com vacunes, descontaminació de cabines de seguretat, a nivell hospitalari s’usa molt en quiròfans o sales blanques en indústria farmacèutica. És fàcil i no requereix aireig, permet esterilitzar material que tinguin lumen, no requereix embalatge previ. Inconvenient: és molt tòxic.
Àcid peracètic: gas o líquid, principalment oxida parts importants de la cèl·lula impedint la seva divisió, és un procés molt ràpid per immersió, no és corrosiu ni tòxic. Inconvenient: només es pot utilitzar en material submergible.
Microbiologia I - Silvia Expósito Glutaraldehid: en forma líquida, inactiva les proteïnes sobretot s’utilitza per material clínic. Les solucions es poden reutilitzar en diverses esterilitzacions, és econòmic, no es veu afectat per la presència de matèria orgànica i no és corrosiu. Inconvenient: és tòxic.
ANTISÈPTICS I DESINFECTANTS: - - - - Alcohols: antisèptics. Per desinfectar ferides, la pell abans de puncions i superfícies. El de 70º és més efectiu en etanol i en isopropanol entre 90-95º és millor perquè no deshidrata tant la pell. Bactericides, fungicides i virucides en virus que tenen coberta lipídica, no són esporicides, per tant, no es poden utilitzar com a esterilitzants.
Halògens: principalment clor (50%) i iode (2%) o Iode: s’utilitza per desinfectar aigua de beguda, antisèptics cutanis que porten derivats de iode. Bactericides, fungicides, virucides i en segons quines condicions poden ser esporicides, però no es pot considerar com a esterilitzant.
o Clor: sobretot en lleixiu com hipoclorit sòdic, s’utilitza també per la desinfecció d’aigües. La seva efectivitat disminueix en presència de matèria orgànica i no té cap activitat esporicida.
Sulfactants: o Detergents aniònics: petita acció bactericida.
o Detergents catiònics: derivats de l’amoni quaternari, també s’utilitzen com a conservants però les substàncies poden produir reaccions al·lèrgiques si queden adherides a la superfície. Acció bactericida intermitja, virucida només per virus amb embolcall lipídic i fungicida variable.
Fenols: primer agent químic utilitzat com a desinfectant però es van desenvolupar derivats perquè és molt tòxic: o Hexaclorofè: és neurotòxic, bactericida, fungicida i virucida. Només s’utilitza en pediatria si hi ha estreptococs.
o Clorhexidina: col·lutoris, productes cutanis, sabons... antisèptic més potent a la farmàcia, acció bactericida, fungicida variable, virucida, i esporicida si s’aplica a altes temperatures.
La mel és un producte natural molt efectiu per evitar la infecció de ferides, el seu component principal és sucre, modifica l’activitat de l’aigua impedint el creixement de bacteris, també té una acció peroxidasa natural i hi ha molts compostos volàtils que són antibacterians i combinats amb vitamina C ajuda a la cicatrització.
 Asèpsia: absència màxima de microorganismes a l’ambient per evitar la propagació de malalties, l’esterilització i l’aplicació d’antisèptics són formes d’asèpsia. (La professora no li va donar més importància) Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 12. AGENTS ANTIMICROBIANS Antibiòtic: qualsevol substància que mata un bacteri per mètodes bactericides o bacteriostàtics.
Tradicionalment es diferenciaven com antibiòtics quan les substàncies provenien d’organismes vius i quimioteràpics si provenien de síntesi, actualment no s’utilitza aquesta diferenciació. Tipus d’agents antimicrobians: - Bactericida: mata la cèl·lula però sense haver-hi lisi cel·lular Bacteriolític: mata la cèl·lula provocant la lisi Bacteriostàtic: atura el creixement cel·lular, normalment quan els antibiòtics actuen a nivell del ribosoma, pot ser un efecte reversible conforme es dilueix l’antibiòtic al medi.
Per això és important completar tots els dies i horaris del tractament.
Paul Ehrlich: al 1908 tenia interès per les substàncies amb acció selectiva sobre els bacteris i que no fossin tòxiques enfront les cèl·lules de l’hoste, anteriorment s’havia utilitzat el fenol però tenia una toxicitat molt elevada. Va sintetitzar el primer quimioteràpic anomenat Salvarsan que podia curar la sífilis. Postulats: - Les substàncies selectives havien de ser actives contra els MO Fàcilment absorbides pel cos Actives als teixits en presència de fluids corporals Poc tòxiques de manera que la dosi màxima tolerada sigui suficient per controlar la infecció Que evitin al màxim l’aparició de resistències Alexander Fleming: al 1928 treballava amb Staphylococcus aureus, al cap d’uns dies les plaques s’havien contaminat amb un fong (Penicillium notatum) i va veure que allà on hi havia fong no havia crescut l’Staphylococcus. Va aïllar el fong i va fer experiments per veure si era això el que inhibia el creixement del bacteri. Va haver-hi una producció massiva de penicil·lina sobretot durant la segona guerra mundial.
Domagk: al 1935 va descobrir les sulfonamides i va sintetitzar la primera droga efectiva contra les infeccions bacterianes causades per Streptococcus.
 Principals grups de MO productors d’antibiòtics: - Bacteris: o Bacillus: gramicidina, bacitracina, polimixina o Streptomyces: tetraciclina, macròlids Fongs: o Penicullium o Cephalosporium - Existeixen més de 2000 antibiòtics i només s’utilitzen uns 80 en clínica. Es classifiquen segons: - Lloc d’acció Estructura química Espectre d’activitat Efecte bactericida o bacteriostàtic Hi ha dos llocs d’acció principals dels antibiòtics: la paret i a nivell dels ribosomes inhibint la síntesi o l’alliberació del pèptid un cop ja sintetitzat.
Microbiologia I Silvia Expósito Segons l’espectre d’acció: és una característica important a tenir en compte a l’hora d’escollir un antibiòtic - Reduït: sobre MO concrets Ampli: sobre MO diversos Si no tenim clar quin tipus de MO està produint la malaltia administrarem antibiòtics d’ampli espectre, si sabem quin és podem utilitzar antibiòtics d’espectre reduït.
 Valoració de l’efecte dels antibiòtics: MIC: concentració mínima inhibitòria, concentració mínima d’antibiòtic que inhibeix el creixement d’un MO en condicions estandarditzades.
MBC: concentració mínima bactericida, concentració mínima per matar el 99,9% dels bacteris de l’inòcul en un temps determinat.
Mètodes per mesurar l’acció: Determinació de la concentració mínima inhibitòria (CMI): es fa en tubs d’assaig o plaques de microtite que tenen 96 pouets petits amb un medi de cultiu Mueller Hirton tant en forma de brou com en forma d’agar, que és medi de cultiu nutritiu que permet el creixement de qualsevol tipus de MO i tots els resultats estan estandarditzats en l’ús d’aquest medi.
Cal fer una dilució de l’agent antimicrobià que es vol estudiar. Es fa un cultiu del MO fins a arribar a una terbolesa concreta (0,5 en escala de McFarland, dissolucions amb clorur de bari i àcid sulfúric on la terbolesa va incrementant), així sabrem que tenim una concentració de 1x10 8 UFC/ml, és millor mesurar les absorbàncies per evitar l’error.
Es fa una dilució 1:200 per tenir una concentració de bacteris de 5x105, inoculem el microorganisme que volem assajar, incubem 48h i observem el resultat. La CIM serà el tub de mínima concentració on hem tingut inhibició del creixement bacterià (1 µg/ml en aquest cas). En aquest mètode variem la concentració de l’agent antimicrobià, la de bacteris ha de ser sempre la mateixa.
Microbiologia I Silvia Expósito Antibiograma: difusió en agar: és el mètode més utilitzat.
Preparem un inòcul del bacteri a 0,5 de l’escala de McFarland, necessitarem plaques amb el medi Mueller Hirton i amb un escovilló estèril sembrarem la suspensió per tota la placa en tres direccions diferents, és una sembra confluent. Amb uns discos de paper de filtre on tenim antibiòtic els posem a sobre de la placa, diferents antibiòtics, incubem 24 o 48h. L’antibiòtic del disquet difon per l’agar i si el MO és sensible a l’antibiòtic s’inhibirà el seu creixement, així sabem quins es poden fer servir i quins no. Amb un regle mesurem el diàmetre de l’halus o zona d’inhibició i ho comparem amb unes taules que són específiques per a cada espècie i donen informació sobre si el bacteri és resistent, sensible o intermedi a l’agent antimicrobià.
A la zona d’inhibició poden haver-hi algunes colònies que sí que han crescut degut a que alguns MO han mutat i són resistents a l’antibiòtic, per mesurar el diàmetre de la zona es fa fins a la colònia resistent que estigui més propera al centre del disquet.
E-TEST: l’avantatge que té és que en un mateix temps podem mesurar l’acció d’un antibiòtic però a diferents concentracions que es troben a una tira, així sabem quina és la CMI.
Inconvenients dels dos últims mètodes: són complicats de fer quan són bacteris de creixement molt lent perquè hi ha risc de contaminació, i quan els antibiòtics són molècules molt grosses perquè costarà més de difondre per l’agar (vancomicina).
 Factors que afecten a l’activitat antibacteriana in vitro: - pH del medi de cultiu: alguns antibiòtics són actius a pH àcid (Nitrofurantoina) i altres ho són a pH alcalins (aminoglicòsids).
Components del cultiu: poden antagonitzar l’antibiòtic (l’extracte de llevat antagonitza les sulfamides).
Estabilitat de l’antibiòtic: alguns antibiòtics són inactivats a la temperatura de cultiu (clortetraciclina).
Mida de l’inòcul: si hi ha molts bacteris, la susceptibilitat és inferior i poden aparèixer mutants resistents.
Temps d’incubació: si és molt curt els MO poden no morir, si és molt llarg poden aparèixer mutants resistents.
- Microbiologia I  Silvia Expósito Mecanismes de resistència: Capacitat que adquireix un MO per resistir els efectes d’un agent quimioteràpic al que és sensible habitualment. Pot ser produïda per diferents causes. Tipus: - Innata si no hi ha la diana on actua l’antibiòtic Adquirida per mutació o intercanvi genètic (plasmidis) Causes, que poden ser genètiques o plasmídiques: - Absència de la diana d’acció Incapacitat per travessar els embolcalls cel·lulars El MO crea una ruta bioquímica resistent Bombeig a l’exterior de l’antibiòtic que ha penetrat a la cèl·lula mitjançant enzims Producció d’un enzim que inactiva l’antibiòtic Les resistències es poden donar per mutacions al genoma o poden ser codificades per plasmidis, que són petits fragments de DNA que s’intercanvien entre els MO, aquests plasmidis existien abans de la creació de l’antibiòtic degut a que abans de ser descoberts els antibiòtics ja estaven a la natura. La resistència adquirida per plasmidis és una selecció natural.
...

Comprar Previsualizar