Citogenètica - 2,3 - Organització del material hereditari (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura citogenetica
Año del apunte 2014
Páginas 38
Fecha de subida 01/11/2014 (Actualizado: 04/09/2015)
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

CITOGENÈTICA PARCIAL 1 BLOC II: Organització del material hereditari en eucariotes superiors TEMA 2 – Introduccio general EL CROMOSOMA 10/09/14 Què és un cromosoma? Estructura altament organitzada formada per DNA, RNA i proteïnes amb la funció de conservar, transmetre i expressar la informació genètica que conté.
DNA + Histones = cromatina, amb diferents nivells d’organització – estructura altament dinàmica; al llarg del cicle cel·lular, els cromosomes poden estar condensats i descondensats, són components que van variant.
Aquesta organització va molt més enllà del cromosoma metafàsic mitòtic (típic X) – adopta estructures totalment diferents – formen territoris cromosòmics.
Té la funció de conservar – hi ha una sèrie de components que conformen una estructura que permet la preservació de l’estructura de la seqüència de nucleòtids.
Té la funció de transmetre – centròmers i telòmers transmeten informació.
Té la funció d’expressar la informació genètica – en funció dels diferents nivells d’organització.
Què és la citogenètica? És la branca de la genètica que estudia l'estructura i la funció cel·lular, especialment dels cromosomes.
1 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 TEMA 3 – El cromosoma eucariotic TIPUS DE CROMOSOMES 10/09/14 Virus i bacteris acostumen a presentar un sol cromosoma circular. El genoma de E. coli és un genoma molt simple a nivell d’estructura i codifica per pocs gens.
La mida del genoma i el número de gens que codifiquen per proteïnes varia entre soques d’una mateixa espècie, especialment en els regnes Bacteria i Archaea. En general, la mida del genoma acostuma a ser petita en procariotes i gran en eucariotes – la mida del genoma s’incrementa en eucariotes perquè molts gens poden donar lloc a diverses variants alternatives proteiques, de manera que el nombre total de proteïnes especificat pel genoma és substancialment més gran que el número de gens.
En tots els eucariotes, el genoma s’estructura en més d’un cromosoma. Internament, aquests cromosomes s’organitzen diferent. En fongs i llevats són molècules grans que formen complexes amb proteïnes – formen una espècie de cromatina. En eucariotes superiors trobem sempre més d’un cromosoma sense excepció, i cada un està format per una molècula lineal de DNA fortament unida a histones (organització bàsica). Aquest tipus de cromosomes serà el que nosaltres veurem.
ESTRUCTURA QUÍMICA DEL CROMOSOMA EUCARIÒTIC ORGANITZACIÓ DE LA FIBRA DE CROMATINA HISTONES La cromatina és l’associació entre DNA i proteïnes. Les histones són proteïnes bàsiques, de baix pes molecular, molt conservades evolutivament entre els eucariotes i alguns procariotes, que formen la cromatina juntament amb el DNA, sobre la base d'unes unitats conegudes com a nucleosomes.
2 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Tenim 5 tipus d’histones. Quatre d’elles s’anomenen core o nuclears i són proteïnes petites que formen un octàmer (paquet de 8 molècules) al voltant del DNA. Està compost per un tetràmer de les histones H3 i H4 al qual s’agreguen dos heterodímers formats per les histones H2A i H2B. L’altra histona, anomenada linker o externa o H1, és més gran i interacciona amb el DNA internucleosomal. Totes elles presenten un alt contingut d’alanina i glicina (aminoàcids negatius).
Alteracions en la seqüència d’AA poden afectar negativament ja que les histones són proteïnes altament conservades al llarg del temps, d’on deduïm que la seva funció és essencial.
Les proteïnes presenten dos dominis estructural i funcionalment diferents. En la part dreta (proper a l’extrem C) hi ha el domini de plegament – funció bàsica en l’organització de les molècules. A l’extrem oposat, trobem el domini N-ter.
NUCLEOSOMA – 1r nivell d’estructuració de la cromatina Com hem dit, les histones s’organitzen en un octàmer d’histones envoltat per dues voltes de DNA. La mida d’aquest fragment és de 146 pb.
H1 + aquest fragment de DNA + l’octàmer formen un nucleosoma, de 11 nm de diàmetre. L’associació de l’octàmer d’histones depèn directament del domini de plegament.
La formació de l’octàmer no és espontània, és una organització altament regulada. Són necessàries xaperones. Es forma de la següent manera: 1. Les primeres associacions necessàries per un nucleosoma són la formació de dímers – interacció de H3 i H4. A través de proteïnes xaperones, interaccionen amb el DNA. La unió entre els dímers i la molècula de DNA s’aconsegueix a través de diferents interaccions entre la molècula de DNA i el domini de plegament. Els tipus d’interaccions que es poden formar són: - 142 ponts d'hidrogen (50% amb el grup fosfat) - Interaccions hidrofòbiques - Unions salines 3 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 2. En el segon pas del procés entra un altre dímer – trobem un pas intermediari on trobem quatre molècules (dues d’H3 i dues d’H4).
3. Seguidament es formarà un hexàmer ja que s’uneixen un H2A i un H2B, i finalment obtenim un octàmer amb l’entrada d’un altre dímer H2A i un H2B. Sempre aquestes unions histona – histona i histona – molècula de DNA estan associades al domini de plegament, que té una funció bàsicament estructural i permet l’associació d’histones en el nucleosoma i també la seva unió a la molècula de DNA.
PROCÉS RESUMIT: Dímers H3-H4  Dímers H2A-H2B  Tetràmer(H3-H4)x2  Octàmer L’extrem N-ter de les histones es projecta cap a l’exterior del nucleosoma, mai està tancat.
Això té un significat funcional determinant l’organització del nucleosoma.
4 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 COLLAR DE PERLES – 2n nivell d’estructuració de la cromatina Els diferents nucleosomes del DNA formen una fibra de DNA de 10 nm. Cada nucleosoma recordem que està rodejat de 2 voltes de DNA.
El segment de DNA espaiador entre nucleosomes normalment és aproximadament de 80 pb (no és constant).
FIBRA DE 30nm – 3r nivell d’estructuració de la cromatina El model més explicat és el model solenoide. Proposa que la fibra de 10nm forma una organització superior formant una mena de molla que té un gruix total de 30nm. Les forces que determinen el pas de 10nm a 30nm es deuen a dues variables: - - Histona H1 – hi ha una còpia d’H1 per nucleosoma. Aquesta és l’encarregada de, mitjançant interaccions entre elles, unir-se i incrementar el nivell d’empaquetament.
Cua N-terminal de la H4 – participa en la compactació.
Hi ha altres models. Està clar que in vitro la cromatina s’organitza en fibres de 30nm. El que no està clar és si sempre és solenoide ja que s’han observat altres maneres d’organització.
L’altre model observat és el model ziga-zaga.
5 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 FIBRA DE 300nm – Organització de la cromatina del cromosoma interfàsic A partir de 30nm no ta mu claro. Tot són hipòtesis.
En el cromosoma interfàsic, es poden observar fibres de 10, 30 i 300nm. Aquests tres nivells són els que es poden observar in vitro.
Quins són els mecanismes que governen la transició de 30 a 300? Hi ha una base proteica – s’enganxen fibres de cromatina de 30nm en diferents regions fent bucles fins a determinar un gruix de 300nm.
Dades experimentals que donen suport a l’esquelet de 300nm? Si agafem cromosomes metafàsics mitòtics o nuclis interfàsics i els tractem amb tractaments que eliminen les proteïnes, el que s’observa al final del tractament són estructures que recorden la forma d’un cromosoma metafàsic/regions més denses a partir de les quals surten diferents grups de DNA.
Aquesta dada és la que dóna peu a l’estructura que fa una mena de bastida/nucli. De què està formada la bastida? Se sap que l’esquelet proteic és de naturalesa proteica, que no són histones i que hi ha Topoisomerasa II (implicada en el processament del DNA), SMC2 (proteïnes de manteniment del cromosoma, pertanyents a la família de proteïnes SMC) i KIF4 (pertany a les proteïnes kinesines – proteïnes d’unió als microtúbuls que determinen el moviment).
6 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Aquest esquelet pot ser rígid, discontinu o dispers – és una estructura dinàmica i té a veure amb el dinamisme dels cromosomes.
També sabem que les seqüències de DNA unides a l’esquelet s’anomenen SAR (Scaffold Attachment Regions) i que són regions riques en adenina i timina.
DINÀMICA DEL heterocromatina CROMOSOMA INTERFÀSIC – Eucromatina i Un cromosoma interfàsic presenta diferents graus d’organització de la cromatina, i a més aquests varien (estructures dinàmiques). Trobem formes condensades i formes esteses: CONCEPTES D’EUCROMATINA HETEROCROMATINA - I Concepte Citològic: L’heterocromatina és la que es tenyeix diferent de l’eucromatina. En nuclis interfàsics, és la que es tenyeix intensament (centròmers i corpuscle de Barr).
En cromosomes mitòtics l’heterocromatina correspon a regions que es tenyeixen menys coincidint amb les constriccions secundàries.
En citologia és molt senzill – tot allò que es tenyeix diferent.
7 CITOGENÈTICA - PARCIAL 1 Concepte Funcional o Eucromatina: és aquella cromatina transcripcionalment activa. La majoria es troba en forma de fibra de cromatina de 30nm, encara que un 10% presenten l’estructura de 10nm. 10 i 30 són per tant els dos nivells d’organització de la cromatina interfàsica.
o Heterocromatina: és aquella cromatina transcripcionalment inactiva que presenta un grau de compactació molt elevat – són regions que habitualment s’organitzen en forma de 300nm. Trobem dos tipus:  Constitutiva: DNA altament repetitiu (centròmers i telòmers).
 Facultativa: Cromosoma X en femelles de mamífer.
La característica eucromàtica o heterocromàtica de la cromatina depèn de: 1. Metilació de Citosines 2. Modificacions de l’extrem N-ter de les histones 3. Presència de variants d’histones 1. METILACIÓ DE CITOSINES Reacció catalitzada pels enzims DNMT (DNA Metiltransferases). Hi ha varis tipus actius en mamífers que actuen en diferents tipus cel·lulars (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B). Tots ells el que fan és utilitzar la S-Adenosil-Metionina (SAM) com a donador de grups metil.
Model d’acció: - - La metilació del DNA impedeix la unió de factors de transcripció – la metilació és una modificació del DNA que impedeix l’acció de factors de transcripció i determina la repressió d’un determinat segment de DNA.
La metilació del DNA permet la unió de les proteïnes MBDs (methyl-CpGbinding domain proteins) – és un senyal (són proteïnes de senyalització) que nuclea en una determinada regió les MBDs, que el que fan és reclutar proteïnes addicionals que actuen com a proteïnes de remodelació de la cromatina (són les que fan que és creï una regió transcripcionalment inactiva).
És a dir, les MBDs recluten proteïnes addicionals, com ara les proteïnes modificadores d’histones i altres proteïnes de remodelació de la cromatina.
En general, metilació = heterocromatinització.
8 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 2. MODIFICACIONS DE L’EXTREM N-ter DE LES HISTONES Parlem de modificacions covalents reversibles realitzades per enzims específics en aminoàcids: - Acetilació de lisines i arginines – afegir grups acetils.
Metilació de lisines i arginines – afegir grups metils.
Fosforilació de serines – afegir grups fosfats.
Ubiqüinització – afegir ubiqüitina.
El fet que una histona, per exemple, estigui o no metilada o acetilada, fa que l’entorn cromàtic estigui en una conformació o en una altra – la pròpia modificació covalent implica un canvi en la cromatina. Per què implica canvis conformacional? ACETILACIONS Per exemple, les acetiltransferases (HATs), que transfereixen grups acetil a les cues de les histones. Tenim dos grups principals de HATs, les A i les B. Les A catalitzen acetilacions vàries, les B són enzims citoplasmàtics i catalitzen acetilacions vinculades al transport de les histones de nova síntesi des del citoplasma al nucli. Un altre exemple són les histona desacetilaces (HDACs).
9 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 L’argument principal és que l’acetilació dels grups Ɛ-amino en lisines implica que la càrrega neta positiva de les lisines quedi neutralitzada. El DNA, pels grups fosfats, té una càrrega neta negativa. El fet que aquesta càrrega s’amagui es relaciona amb que la histona s’afebleix – els pols s’atrauen, l’atracció entre DNA i lisina es perd, de manera que això relaxa l’estructura fent que la cromatina, globalment, en aquell domini, quedi en una estructura més laxa o més oberta. Aquesta acció, que s’amagui la càrrega positiva, és un senyal eucromàtic – el segment cromosòmic acetilat implica relaxació i per tant fa que la regió passi a ser transcripcionalment activa – regió eucromàtica.
Poques dades experimentals ho suporten. Altres diuen que aquesta modificació de la càrrega és tan feble que no ho hauria de fer possible, i que és la presència d’acetils el que desestabilitza el nucleosoma (unió entre DNA i nucli) i això produeix la relaxació i el canvi conformacional (l’eliminació de les cues de les histones resulta en que el nucleosoma no pot condensar més enllà de la fibra de 10 nm).
Altres conseqüències de les acetilacions són la millora de la disponibilitat de DNA cromosòmic i la possibilitat de canviar la interacció amb altres proteïnes reguladores.
En general, acetilació = eucromatització i desacetilació = heterocromatinització.
METILACIONS Les metilacions les provoquen les metiltransferases. Actuen de forma específica en diferents llocs (hi ha molts tipus de metiltransferases). Poden afegir fins a 3 grups metil a un AA concret.
Hi ha indicis que existeixen també enzims desmetiladors.
Els efectes de les metilacions s’associen a regions tancades transcripcionalment inactives – és un senyal lligat a l’heterocromatinització. En l’acetilació es relaciona amb la càrrega o amb canvis conformacionals dels nucleosomes. Aquí no se sap ben bé perquè. La hipòtesi més acceptada és que una lisina metilada no pot estar acetilada – la metilació és un sistema per evitar l’acetilació. Secundàriament, evita una estructura oberta i la manté en heterocromatina.
10 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Per tant, en general diem que la metilació evita l’acetilació i es manté la càrrega positiva – metilació = heterocromatinització.
Exemple de metilació: Ara bé, les grans transicions heterocromatina – eucromatina són difícils d’explicar només amb metilacions i acetilacions. La raó per la qual aquestes modificacions produeixen canvis conformacionals ens porta al concepte del codi de les histones o més ben dit la hipòtesi del codi de les histones – combinació de modificacions dels extrems N-terminal de les histones que determina com i quan el DNA empaquetat en el nucleosoma és accessible.
El que diu aquest codi és que aquestes modificacions dels extrems N-ter determinen que es produeixin combinacions de modificacions, i aquestes són senyals perquè en una regió concreta actuïn factors remodeladors de la cromatina – proteïnes que van a un lloc determinat del genoma i modifiquen l’estat conformacional.
11 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Cas de la histona H3: - - - La cua de H3 està metilada en la Lys en posició 9 (es una trimetilació) i implica que aquell domini estigui silenciat, sent sempre heterocromatina.
Una fosforilació de la serina 10, junt amb metilacions i altres acetilacions impliquen l’expressió del gen.
La metilació de la lisina en posició 27 comporta inactivació els gens Hox.
Per tant, tenim exemples de com aquestes modificacions actuen com un codi, actuen com a senyals que són reconegudes per altres proteïnes que canvien el grau de condensació de la cromatina.
EXEMPLES DE LECTURA DEL CODI D’HISTONES 1. Proteïnes HP1 (proteïna d’heterocromatinització tipus 1).
És una proteïna la presència de la qual implica heterocromatina.
Com actua? Està formada per diferents subunitats (oligòmer proteic). Una d’elles és el cromo-domini. Aquesta part reconeix específicament lisines en posició 9 que estiguin trimetilades en la histona H3. Quan ho reconeix, s’hi uneix.
No hi ha un únic nucleosoma amb aquesta modificació – és a nivell de múltiples nucleosomes adjacents. HP1 s’uneix específicament amb el cromo-domini a les lisines.
HP1 presenta un segon domini funcional anomenat cromo-shadow.
Aquest domini té la capacitat de reconèixer i unir-se a altres dominis cromo-shadows d’HP1s– forma dímers. On hi ha HP1s unides (on hi ha trimeltiacions), s’uneix a elles i fa que s’ajuntin entre elles.
L’efecte final d’aquesta funció és que una regió concreta de nucleosomes es condensa i per tant aquell segment passa d’estat conformacional obert (eucromatina) a estat conformacional tancat (heterocromatina).
12 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 2. Proteïnes Sir (Silence information regulator) Fan la mateixa funció però en Saccharomyces. Fan el mateix, provoquen regions heterocromàtiques, però als extrems dels cromosomes de llevat.
Com actuen? Les proteïnes Sir reconeixen específicament les cues N-ter desacetilades de les histones (la presència de grups acetil és activitat eucromàtica). Quan ho reconeixen, s’hi uneixen. Són reclutades a través d’unes proteïnes intermediàries que reconeixen les repeticions en tàndem dels telòmers del DNA (tots els eucariotes ho presenten). Ho reconeixen a través d’un domini funcional. Al mateix temps, hi ha un segon domini que permet crear unions entre proteïnes Sir adjacents igual que amb les d’abans.
Moltes Sir tenen un tercer domini que és una desacetilasa que elimina els grups acetils de nucleosomes adjacents i així expandeix el seu senyal heterocromàtic. L’efecte final en els extrems dels cromosomes de llevat a través de Sir és similar a les HP1 – primer reconeix, després desacetila els adjacents i finalment amb unions es forma una regió tancada transcripcionalment inactiva – heterocromatinització.
Una modificació determinada dels N-ter comporta un canvi conformacional.
13 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 3. Proteïnes que contenen Bromo-dominis Els cromo-dominis no només estan presents en HP1 sinó que estan presents de forma genèrica als factors remodeladors de la cromatina i reconeixen metilacions. Els bromo-dominis reconeixen lisines acetilades en les cues acetilades – tenen una funció anàloga (totes elles comparteixen la presència de cromo-dominis o de bromo-dominis).
Les quatre hèlixs s’emboliquen amb una butxaca hidrofòbica capaç d'interactuar amb lisines acetilades.
Tot això porta a un model de lectura de com funciona el codi d’histona – un model d’extensió del senyal eucromàtic/heterocromàtic. El model implica la presència de senyals barrera que marquen una frontera entre regions eucromàtiques i heterocromàtiques.
Així en general, els senyals que serveixen per heterocromatinitzar o eucromatinitzar arriben i activen proteïnes reguladores de gens. Llavors vénen les proteïnes escriptores, que són les encarregades de modificar les histones (HMTs, kinases, HATs, PPTases, HDACs, HDM?).
Després arriben les proteïnes lectores de codi (per exemple HP1), que es caracteritzen totes per presentar cromodominis o bromodominis (són les encarregades de llegir el que s'ha escrit prèviament). Aquestes proteïnes lectores empaqueten la cromatina combinant-se entre elles, i sovint també tenen la capacitat d'escriure. Aquest procés molts cops és simplificat amb un únic complex proteic que té totes les funcions a la vegada (com el cas de Sir).
14 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 La modificació de les cues N-ter i la metilació de citosines són dos processos que solen anar de la mà. En un lloc on les citosines estan metilades, es produiran canvis en les cues N-ter que comportaran heterocromatinització. On les citosines estiguin acetilades, passarà el contrari.
3. PRESÈNCIA DE VARIANTS D’HISTONES A part de les histones canòniques, trobem variants d'aquestes histones. Per exemple, variants de la H3 són la H3.3 (sempre que és present indica que aquelles regions són transcripcionalment actives) o la CENP-A (sempre present en nucleosomes que formen els centròmers). Variants de la H2A són la H2AX (és present quan el DNA es trenca i els nucleosomes adopten morfologies característiques per la reparació), la H2A2 o la macro-H2A.
Aquestes variants d'histones formen part dels nucleosomes en substitució de les histones canòniques.
Fan funcions concretes a llocs concrets (també pot ser que estiguin per tot el genoma, com ara H2AX).
15 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CONCEPTE D’EPIGENÈTICA Fa referència a mecanismes que regulen l'activitat d'un gen sense que es produeixin canvis a la seqüència de nucleòtids. És a dir, de tot el que hem estat parlant .
EL CROMOSOMA MITÒTIC – Grau de condensació superior 22/09/14 Seguim parlant dels models d'organització de la cromatina. El grau de condensació màxim és un cromosoma metafàsic mitòtic. La hipòtesi més acceptada de com es passa de fibra de 300 nm a cromosoma metafàsic és que la fibra de 300 nm s'organitza en un model de solenoide per formar una fibra de 700 nm.
16 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Un model alternatiu per passar a fibra de 700 nm és el model mini-band. Diu que la fibra de 700 nm es forma degut que els bucles de la fibra de 30 nm s'organitzen sobre una matriu proteica com en forma de flor. Així es formaria la fibra de 700 passant directament de 30 a 700 nm (sense passar per la fibra de 300 nm).
Després, es passaria de la fibra de 700 nm al cromosoma metafàsic final. La condensació màxima dels cromosomes mitòtics en la metafase permet la separació de les dues molècules de DNA (les dues cromàtides) i permet també protegir la molècula de DNA de trencaments durant l'anafase.
Per exemple, el cromosoma 22 humà té: - Nucleòtids: 48x106 - Estirat: 15 mm - Interfàsic: 0,015 mm (x1.000) - Condensat: 2mm (x10.000) Quines són les molècules que permeten aquest grau de condensació màxima? Per una banda tenim les histones i les seves variant modificades, i per altra tenim unes proteïnes NO histones que formen l'esquelet proteic sobre el què se suporta el DNA. Aquest esquelet pot ser rígid, discontinu o dispers (estructura dinàmica). Les seqüències de DNA unides a l'esquelet s'anomenen SAR (Scaffold Attachment Regions).
Les proteïnes identificades fins ara són la Topoisomerasa II, les condensines i la KIF4. La distribució d'aquestes 3 molècules en l'esquelet proteic del cromosoma metafàsic forma clarament 2 eixos longitudinals, un a cada cromàtide.
17 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Sens dubte, les molècules que produeixen en gran part aquesta condensació màxima són les condensines. De condensines n'hi ha de diferents tipus, totes amb la mateixa estructura:   Dues proteïnes SMC (SMC2 i SMC4), que s'ajunten en un dels extrems per formar un domini funcional en forma de frontissa (es pot obrir o tancar). A l'extrem oposat, trobem un altre domini de naturalesa globular que té activitat ATPasa. En resposta a la hidròlisi d'ATP, el domini frontissa s'obrirà o es tancarà.
Hi ha dues proteïnes accessòries: les kleisines (modulen l'activitat ATPasa de la condensina), i les molècules HEAT.
Totes aquestes proteïnes formen en conjunt la condesina.
Les condensines estan distribuïdes al llarg de l'eix longitudinal del cromosoma. El què s'ha observat in vitro és que, si afegeixes condensines, DNA i ATP, les condensines tenen la capacitat d’organitzar per elles mateixes el DNA (l’agafen amb la hidròlisi i fan bucles, tot i que d'una forma desestructurada). Es creu que funcionen de la següent manera: s'uneixen pel domini frontissa diverses condensines, com formant un anell, exposant els dominis ATPasa cap a fora de l'anell. Aquests dominis ATPasa serien els que enganxarien el DNA i el condensarien.
El que no es coneix és de quina manera les condensines organitzen correctament aquest DNA (és a dir, com saben unir-se a llocs concrets del DNA; això es desconeix).
18 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Representació d’aquest model d’actuació en una cromàtide: Existeix una teoria que postula que no existeix cap nivell més gran de condensació que 10 nm. Tot el que s'ha vist amb un diàmetre major diu que són artefactes.
També hi ha un article que diu que les molècules que realment organitzen la cromatina durant el cicle cel·lular són les condensines, NO només quan els cromosomes s'han de condensar en el nucli interfàsic.
ESTRUCTURA EXTERNA DEL CROMOSOMA EUCARIÒTIC ¡ES TODO MENTIRA! LAAAAAAAAL 19 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 ESTRUCTURA EXTERNA DEL CROMOSOMA EUCARIÒTIC Recordem que el cromosoma pot presentar diferents morfologies segons la part del cicle cel·lular en el què ens trobem. Si ens centrem en el cromosoma metafàsic, el cromosoma pot adoptar diferents morfologies segons si és mitòtic o meiòtic.
El cromosoma metafàsic mitòtic està format per dues cromàtides (cada un). Cada cromàtica està formada per una molècula de DNA. En termes generals, s’admet la constància en la morfologia, la mida i el nombre de cromosomes.
- Morfologia – classificació morfològica en funció de la posició del centròmer.
Mida – variable en funció de la tècnica utilitzada.
Número – les cèl·lules somàtiques de la majoria de les espècies es caracteritzen per la presència d’una parella de cada tipus de cromosoma. El número de cromosomes es representa per 2n i les cèl·lules com a diploides. Els parells de cromosomes es coneixen amb el nom de cromosomes homòlegs.
Els cromosomes es classifiquen segons la posició del centròmer (metacèntrics, submetacèntrics, acrocèntrics i telocèntrics). A cada braç se li assigna un nom: p (el curt) i q (el llarg).
Recordem que no hi ha correlació/relació directa entre el número de cromosomes i el contingut de DNA. El motiu és que el número de cromosomes ha estat sotmès a molta pressió en el procés evolutiu. Per tant, el número de cromosomes no té un significat evolutiu directe.
20 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Schertan l’any 1990 va dur a terme la fusió en tàndem dels cromosomes petits i acrocèntrics de M. reevesi per a formar els cromosomes de M. Muntjack. Es va veure que tenien el mateix contingut de DNA.
Conceptes claus:  Complement cromosòmic: conjunt de cromosomes d'una cèl·lula o organisme.
 Cariotip: estudi de les característiques morfològiques externes (forma, mida i nombre) que es realitza ordenant els parells de cromosomes homòlegs en relació a la seva mida i forma.
 Ideograma: representació gràfica del cariotip.
En quant al cromosoma metafàsic meiòtic, s’organitzen de forma diferent segons si és meiosi I o II.
- En meiosi I (metafase I), cada cromosoma homòleg (format per dues cromàtides) es troba en forma bivalent i formant quiasmes. Els bivalents poden adoptar diferents morfologies depenent del nombre de quiasmes, la seva situació i la mida dels cromosomes (en forma de creu, filament, cercle...)..
21 CITOGENÈTICA - PARCIAL 1 En meiosi II (metafase II), la cèl·lula és haploide (els cromosomes presenten les dues cromàtides molt separades).
ESTRUCTURA INTERNA DEL CROMOSOMA EUCARIÒTIC Per explicar l’estructura interna del cromosoma eucariòtic, comencem explicant un experiment clau per demostrar que un cromosoma funcional està format per una molècula lineal de DNA que conté regions de replicació, un centròmer i dos telòmers.
Tots els experiments duts a terme partien d’un plasmidi (seqüència de DNA circular) que contenia gens per la síntesi de l’AA Leucosina. Aquests plasmidis els van transferir a cèl·lules eucariotes (de Saccharomyces) tot creant cèl·lules eucariotes amb el plasmidi. Posteriorment es van cultivar aquestes cèl·lules en un medi sense Leu, de manera que només les que haguessin incorporat els gens essencials per la ruta biosintètica de la Leu podrien sobreviure.
Es va veure que en les següents generacions no hi havia creixement.
Més tard al plasmidi li van incorporar un origen de replicació, una seqüència de nucleòtids que actua com a origen de replicació. Es van transferir les cèl·lules amb plasmidi al cultiu. Una gran quantitat de cèl·lules resultants morien, mentre que un 5-20% sí podien sobreviure. Per tant, si hi ha un origen de replicació, els plasmidis poden replicar-se però la segregació és molt pobre.
Per tal que es produeixi la segregació cromosòmica, cal alguna cosa més, una seqüència de nucleòtids que faci que el plasmidi es comporti com un centròmer.
Conclusió: Orígens de replicació Replicació del DNA 22 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 En un tercer experiment van incorporar una seqüència de nucleòtids que podien realitzar la funció de nucleòtids. Es van cultivar en medi sense Leu i es va veure que les cèl·lules filles podien créixer i totes (>90%) presentaven el plasmidi – calen orígens de replicació i seqüències centromèriques per poder segregar. Però clar, el plasmidi és circular, i els cromosomes són lineals. Per tant, finalment, el que van fer va ser linealitzar el plasmidi amb enzims de restricció. Llavors els cromosomes ho presentaven tot però ni creixien ni es replicaven.
Conclusió: Un centròmer Segregació de les còpies replicades En la darrera sèrie, van incorporar sèries que actuen com a telòmers potencials perquè en els extrems dels cromosomes cal alguna cosa perquè siguin funcionals – telòmers.
Conclusió: Dos telòmers  Manteniment del DNA Importància – seqüència de nucleòtids concreta per fer que una regió concreta d’un cromosoma es comporti com un centròmer o com un telòmer.
23 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CENTRÒMER Regió del cromosoma que s’associa amb les fibres del fus durant la divisió cel·lular facilitant la migració de les cromàtides germanes o els cromosomes homòlegs cap a els pols cel·lulars durant l’anafase. Inclou el cinetocor, una regió específica del centròmer que s'associa amb els microtúbuls del fus.
El centròmer més senzill conegut és el del S. cerevisiae.
Malgrat presentar diferents cromosomes, tots ells tenen la mateixa organització a nivell de centròmer. En tots els casos, la seqüència centromèrica de nucleòtids presenta uns 125 pb i sempre va associada al desenvolupament del centròmer amb 3 regions funcionals. Els 3 dominis s’anomenen CDE I, CDE II i CDE III. La característica dels dominis és que presenten una gran varietat de nucleòtids. Del domini central (CDE II), la característica bàsica és la gran quantitat de AT (>90%). Cadascun dels dominis tenen també una funció molt determinada – el domini CDE II, que té entre 78 i 86 pb, forma un sol nucleosoma (regió d’unió amb un octàmer d’histones) i aquest nucleosoma es caracteritza per presentar una variant d’H3 que és la proteïna CENP-A. Al voltant de l’octàmer d’histones hi ha els parells de bases.
Els altres 2 dominis el que fan és situar-se als extrems del nucleosomes i la seva funció principal és actuar com a centre de reconeixement de proteïnes cinetocòriques (cinetocor – organització proteínica implicada a l’associació de fibres del fus i a la segregació de cromosomes). Reconeixen nucleòtids modificats – la seva funció és actuar com a senyals perquè les proteïnes cinetocòriques la reconeguin com a zona on s’ha de formar un cinetocor i per tant un centròmer.
Perquè en el centròmer de S. cerevisiae es forma una sola regió centromèrica? Perquè només presenten una sola regió de 125 bp amb aquesta seqüència concreta.
El DNA centromèric pot ser molt variable entre espècies. La relació de DNA centromèric per microtúbul entre espècies varia entre 1000 i 10.000 vegades. En Saccharomyces pombe 24 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 trobem 4 parells de cromosomes – les diferents seqüències centromèriques són diferents entre elles, no tenen la mateixa seqüència de nucleòtids, a diferència de S. cerevisiae. A més, les seqüències centromèriques de S. pombe són molt grans – 65 kb (65000pb). Quan es van analitzar les característiques, es va veure que, malgrat les diferències entre els diferents centròmers, tots mantenen una estructura més o menys similar. En tots els casos, hi ha una regió central (CC) i aquesta és una regió no conservada des del punt de vista de seqüència – és una regió variable. La regió CC està flanquejada per dues regions B, les quals estan formades per DNA altament repetitiu. A banda i banda hi ha altres regions de DNA repetitiu, les L i les K.
Quines són les característiques del centròmer? Una regió central no conservada amb diferència de seqüència entre els cromosomes de S. pombe flanquejada per regions de DNA altament repetitiu sí conservats entre els diferents cromosomes (en L i K) entre diferents centròmers de S. pombe. Això no lliga amb S. cerevisiae. Actualment se sap que el domini CC i el B presenten una variant de la histona H3 – organitzen molts nucleosomes (no 1) però tots ells tenen una variant d’H3. A més, les histones H3 de la regió centromèrica presenten una metilació en la lisina K9 que implica heterocromatinització. Per tant, en S. pombe mantenim una variant d’H3 important, i enlloc de variants de nucleòtids, presenta variants d’histones.
En Drosophila melanogaster – SURPRAIS MADAFAKA! Trobem diferents cromosomes amb seqüències diferents entre cromosomes. A més, són enormíssimes (420kb, 420.000pb). Grans segments de DNA organitzen un centròmer. Quines són les seves característiques? Presenta DNA α-satèl·lit (tipus de DNA altament repetitiu), amb repeticions en tàndem de 5 nucleòtids.
Aquests dos tipus de DNA α-satèl·lit estan intercalats per transposons (elements mòbils) i per poques seqüències de DNA no repetitiu (no conservades entre diferents cromosomes).
Aquesta característica és extensiva als centròmers de la majoria de metazous.
25 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 LA CROMATINA CENTROMÈRICA PRESENTA UN EMPAQUETAMENT ESPECIAL DELS NUCLEOSOMES En aquestes regions centromèriques observem que hi ha 2 tipus d’heterocromatina – pots diferenciar dos tipus de configuracions, l’heterocromatina cèntrica i la pericèntrica.
La primera presenta segments intercalats. Alguns en els seus nucleosomes tenen la variant de la histona 3 (CENP-A), i altres, la histona H3 normal però amb una dimetilació de la lisina 4 de la cua N-ter de H3 (segments roses i verds).
Aquests dos tipus de cromatina, en l’organització en 3D en bucles de la regió centromèrica, formen, com diem, dos dominis funcionals diferents (2 regions heterocromàtiques): - - Totes les regions amb la variant d’H3 CENP-A generen un domini (en groc) que està directament relacionat amb la formació del cinetocor.
L’altre domini amb la H3 modificada està just per sota (en vermell) i està dirigit cap a la capa interna del centròmer, a l’interior del cromosoma. Aquest domini té com a funció incrementar la cohesió entre cromàtides germanes. La constricció del centròmer s’aconsegueix ja que la concentració de cohesines en la regió pericentromèrica és molt més alta.
Hi ha una seqüència de nucleòtids que formen un nucleosoma i hi ha uns altres que dirigeixen la formació d’un cinetocor. En eucariotes superiors es compliquen bastant perquè tenim una gran regió centromèrica de 400500 kb que s’organitza en dominis funcionals diferents, però l’esquema en essència és similar. És a dir, en eucariotes superiors, les proteïnes d’associació estructuren el cinetocor.
Cinetocor – complex multiproteic que s’uneix a les fibres del fus, format per proteïnes homòlogues en la seva funció a les que actuen a S. cerevisiae.
26 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 El cinetocor intern (capa interna relacionada amb la capa de nucleòtids) s’anomena xarxa proteica centromèrica constitutiva o CCAN, sempre està present (txarango), i va relacionat als nucleosomes de CENP-A. Aquesta regió s’associa a proteïnes que ens permetran la seva funcionalitat. Entre elles, trobem: - Proteïnes motores Proteïnes reguladores de kinases Proteïnes d’unió als microtúbuls Proteïnes dels punts control.
La diferència és a nivell de seqüència de DNA. Des d’un punt de vista funcional són similars – trobem variants de la histona H3 que determinen la formació del cinetocor i senyals que determinen la formació d’un entorn amb característiques que permetin la diferenciació del centròmer.
29/09/14 En determinades regions dels cromosomes es distingeixen centròmers. El model explicat ha evolucionat cap a un model on es manté la variant d’H3 i aquesta forma nucleosomes importants per l’estructura del cinetocor; presenten variants d’histones enlloc de variants de nucleòtids.
La seqüència de nucleòtids és la que determina un tipus de cromatina i per tant un tipus de funció.
27 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CONCEPTES - - Centròmer localitzat: inserció dels microtúbuls restringida a un segment del cromosoma. La majoria de cromosomes presenten un centròmer localitzat – una regió especialitzada on s’insereixen les fibres del fus (cromosoma monocèntric).
Centròmer difús: inserció de les fibres del fus sobre tota l’extensió cromosòmica. Alguns tenen un centròmer difús – s’insereixen les fibres del fus al llarg de tot l’eix cromosòmic. Formen cromosomes holocèntrics o holosimètrics.
Com s’interpreta molecularment això? Parlem d’espècies concretes, com ara Nematodes (Ascaris), insectes (Lepidopters) i plantes (Lazula) (no hi ha molts estudis fets sobre la base molecular d’aquesta disposició). Tot apunta a que presenten regions de DNA que desenvolupen centròmers que possibiliten la diferenciació del centròmer en diferents llocs al llarg del cromosoma (múltiples centròmers, un al costat de l’altre).
Qualsevol situació així implica anomalies. Les més freqüents que afecten als centròmers són: - Cromosomes dicèntrics (dos centròmers o més). La situació contrària són acèntrics.
Misdivisió – fenomen on en una divisió, enlloc de dividir-se un cromosoma longitudinalment, es trenca transversalment el centròmer, de manera que les 2 molècules de DNA es trenquen per la meitat. Això origina 2 cromosomes telocèntrics d'un sol braç.
28 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 TELÒMER Els telòmers són seqüències localitzades als extrems dels cromosomes d’eucariotes importants en la replicació i en el manteniment dels cromosomes – repeticions en tàndem d’una seqüència simple de DNA.
Trobem 2 funcions bàsiques: - Mantenen l’estructura cromosòmica Participen en la replicació del DNA en cromosomes lineals Els telòmers són rics en guanina i timina (una monocadena rica en G i una complementària rica en T). Tots presenten una seqüència d’entre 6 i 8 parells de bases (tenim diferents tipus de seqüències, com veiem a la taula). En humans tots els cromosomes presenten la repetició en tàndem AGGGTT en els seus extrems. El número de repeticions és variable en espècies. En humans s’ha vist que el nombre de repeticions és d’entre 3.000 i 8.000 – dins la pròpia espècie també és força variable. En canvi en S. cerevisiae no presenta tantes (entre 60 i 100 repeticions).
Una altra característica és que aquestes repeticions riques en GT formen en l’extrem de la monocadena una zona rica en G que sobresurt (no té complementari), que en anglès s’anomena G rich strand. Aquesta forma un extrem 3' OH protuberant (té un OH). La mida/longitud d’aquest extrem també és variable entre espècies – en humans, aquesta G-tail la componen entre 75 i 300 nucleòtids. En S. cerevisiae, entre 50 i 100.
29 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 En el DNA telomèric (sense el complement proteic), en els extrems de tots els cromosomes s’observa una estructura en forma de bucle. A dia d'avui es coneixen les proteïnes que en formen part. Aquesta estructura terminal s’anomena T-loop, que és una força conservativa entre diferents espècies.
Com hem dit, trobem dues funcions, una relacionada amb el manteniment i una relacionada amb la replicació.
FUNCIÓ DE MANTENIMENT Trobem seqüències fortament unides a proteïnes que formen estructures circulars que: 1) Protegeixen els extrems d’exonucleases 2) Eviten la fusió entre cromosomes 3) Associen els telòmers a dominis específics dins el nucli Aquest extrem protuberant el que fa és inserir-se dins la doble hèlix del DNA i desplaçar una monocadena, de manera que es forma un intermediari a la part terminal del telòmer format per 3 monocadenes de DNA. Visualment és la imatge en gris de la dreta: Telòmers i replicació de cromosomes30 lineals.
CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Calen moltes proteïnes per fer això. Algunes d'elles són helicases, topoisomerases, i també enzims que modificaran la forma del DNA per formar el t-loop. Cal també que l’extrem protuberant s’uneixi a una regió específica i desplaci una de les cadenes (no és fàcil de fer).
Una proteïna essencial és la POT1 ja que estabilitza la cadena desplaçada (s’hi uneix específicament). L’intermediari és inestable i POT1 preserva l’estructura com a estructura constant. Cal també que participin enzims de reparació del DNA.
Finalment calen també proteïnes estructurals que estabilitzen tot el llarg del t-loop que són TRF1 i TRF2, i són grans complexes proteics.
Funcions t-loop: - - Protecció – les exonucleases, si detecten un extrem obert no format per un octet, actuen i digereixen el DNA. El t-loop ho evita i protegeix els extrems de les nucleases.
Evita la fusió de cromosomes – els extrems oberts són inestables i poden crear anomalies cromosòmiques.
Funció d’associació – associació dels extrems dels cromosomes a dominis específics del nucli, actuen com a llocs d’ancoratge, per exemple en un nucli interfàsic.
La majoria dels telòmers s’organitzen més o menys així en tots els eucariotes.
31 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 FUNCIO DE REPLICACIÓ L’enzim telomerasa forma part del complex nucleoproteic. És un petit primer que per complementarietat de bases s’uneix a l’extrem del telòmer i actua com a primer per poder sintetitzar/unir més nucleòtids. És complementari de seqüències en tàndem dels extrems telomèrics.
Per acció de la telomerasa, la longitud telomèrica de la cadena discontinua no s’escurça a cada divisió cel·lular – és un mecanisme per evitar aquest escurçament telomèric.
La funció telomerasa no es dóna en tots els tipus cel·lulars! La majoria de cèl·lules somàtiques impliquen escurçament telomèrics, que estan relacionats amb l’envelliment cel·lular, tumors etc. Però trobem tres grans tipus de cèl·lules que són telomerasa +: - Cèl·lules germinals primordials – precursores dels oòcits.
Cèl·lules mare pluri o totipotents – les cèl·lules que proliferen constantment, generalment la presenten.
Cèl·lules amb una elevada capacitat proliferativa: cèl·lules de la pell, de teixits hematopoiètics, dels epiteli intestinals.
L’activitat de la telomerasa està regulada per TRF1 i TRF2 – no hi ha una unió il·limitada, sinó que està regulada. El número de repeticions presenta un rang – les telomerases mantenen les cèl·lules en un rang de normalitat.
Funció dels telòmers en la replicació de cromosomes lineals: - Les DNA pol no poden copiar els extrems 5’ dels cromosomes lineals.
La telomerasa presenta una seqüència d’ RNA motllo que forma part del complex de replicació.
La telomerasa actua com una transcriptasa inversa.
32 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CROMÒMER Partícules discretes de cromatina de mida i forma variables ordenades linealment sobre la longitud del cromosoma. S’interpreten com enrotllaments de la cromatina.
En la imatge veiem un cromosoma profàsic amb una tinció uniforme. Observem zones amb més colorant i zones amb menys. Les zones més brillants són els cromòmers (concepte citològic).
REGIONS ORGANITZADORES DEL NUCLÈOL La regió organitzadora nucleolar o constricció secundària que presenten alguns cromosomes.
Ocupa una posició subterminal al cromosoma (el segment distal es coneix amb el nom de satèl·lit). En el nucli interfàsic organitza el nuclèol, i conté els gens que codifiquen pel RNA ribosòmic.
La majoria de cromosomes en eucariotes són monocèntrics i presenten una constricció primària coincidint amb el centròmer. Però alguns presenten constriccions secundàries – són regions més constretes.
Aquest segment de DNA que connecta el satèl·lit amb la resta del cromosoma conté els gens (la constricció secundària) que codifiquen pel rRNA – són gens repetits en tàndem continguts en aquesta constricció secundària.
En un nucli interfàsic, el que organitzen aquests gens és el nuclèol. Per tant, les regions s'anomenaran regions organitzadores del nuclèol.
33 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 ARQUITECTURA NUCLEAR I TERRITORIS CROMOSÒMICS 1/10/14 En el nucli interfàsic, els cromosomes ocupen territoris discrets (es tracta d’una fibra altament organitzada). Aquesta organització s’aconsegueix mitjançant unions entre els cromosomes (telòmers, centròmers, segments de DNA altament repetitiu) i l’embolcall nuclear.
Algunes evidències sobre aquesta disposició són: - - Evidències indirectes (sense anàlisi del cromosoma): o Gran quantitat d’intercanvis entre cromosomes homòlegs en malalties acompanyades de trencaments cromosòmics.
o Alguns tipus d’intercanvis entre cromosomes no homòlegs s’observen amb mes freqüència que d’altres: t(9;22)  Cromosoma Philadelphia.
Es tracta de la translocació recíproca més freqüent (els territoris del cromosoma 9 i 22 estan relacionats).
Evidències directes: Estudis de localització cromosòmica mitjançant tècniques d’hibridació in situ fluorescent.
Aquesta és una de les primeres imatges que van posar en evidència una territorialitat concreta dels cromosomes.
En aquestes cèl·lules de Drosophila, veiem un perímetre blau + dues regions identificades. El que s’observava en totes les cèl·lules era que aquestes regions sempre se situaven a la perifèria.
En la segona imatge veiem un meristem – teixit de cèl·lules proliferatives (en creixement constant) d’una arrel de ceba.
Identifiquem amb hibridació in situ els telòmers en vermell i els centròmers en verd. En hibridar les sondes observem l’orientació Rabl en que tots els telòmers i centròmers estan distribuïts (en nuclis interfàsics) a la mateixa regió cromosòmica.
34 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 En macrocromosomes (ocells) amb hibridació sobre nuclis interfàsics s’observa també una disposició on clarament s'observen dominis amb un color diferent.
FACTORS QUE DETERMINEN LA TERRITORIALITAT Un cop demostrada la territorialitat, es busquen els factors que la determinen. El que coneixem sobre aquests factors és que: - Es distribueixen en funció de la seva densitat gènica. Els cromosomes que tenen una càrrega gènica significativa tenen tendència a situar-se a l’interior del nucli.
Per exemple: un limfòcit humà amb el cromosoma 19 i el cromosoma 18. El cromosoma 19 és ric en gens i el 18 no tant.
- Un altre paràmetre: la mida. Els petits es disposen al centre, mentre que els grans a la perifèria. Aquesta disposició té més a veure amb forces físiques que no amb forces biològiques – no té a veure amb la densitat gènica, és una qüestió de distribuir elements de mides diferents en una esfera.
ORGANITZACIÓ INTERNA DE LA TERRITORIALITAT En A s’observen dos territoris clarament diferenciats dins un mateix territori cromosòmic corresponents al braç p i q.
En B marquem la part terminal del braç p i q en verd i la resta del cromosoma vermell.
S’hibrida sobre un cromosoma metafàsic i s’observa el patró esquematitzat. Això s’hibrida sobre nuclis interfàsics i dóna com a resultat la imatge de baix.
A nivell de dominis encara més petits, també es poden veure distribucions concretes i organitzades. En C tenim la reconstrucció del cromosoma X. Com sabem, en humans XX, un dels dos està inactivat, però aquesta inactivació no és total (s’inactiven aproximadament un 70% dels gens). En aquest X inactiu van veure quina era la disposició d’un gen que és transcripcionalment actiu en l’X activat i transcripcionalment inactiu en l’X inactivat. El gen en el Xa se situa en la perifèria mentre que en el Xi se situa en l’interior del territori. En una segona sèrie experimental es va veure quina era la distribució d’un gen que era transcripcionalment actiu en els dos cromosomes, i veien que en els dos casos estava situat a la perifèria. Conclusió – la distribució depèn de la seva activitat transcripcional.
35 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Per tant, en general, l’organització interna depèn de: - - Activitat de transcripció Temps de replicació –la fase S és asincrònica, no es produeix de forma instantània per tot un cromosoma, hi ha regions que repliquen al final i n’hi ha que al principi. Aquestes regions de replicació tardana o primerenca presenten una distribució concreta en el territori, és un factor que també determina la posició.
Finalment, un últim paràmetre és el contingut de GC.
Moltes dades experimentals demostren una territorialitat i que depèn d’una sèrie de variables i que moltes estan dirigides a l’activitat transcripcional.
Aquests territoris cromosòmics varien entre tipus cel·lulars. Així doncs, la posició del cromosoma 18 no serà la mateixa en un limfòcit que en un fibroblast.
Tot un nucli és cromosòmic – la cromatina ocupa tota la superfície nuclear? Nein. Els territoris cromosòmics són estructures poroses, no tot és cromatina. Els territoris cromosòmics tenen una estructura determinada però permeten l’entrada i sortida de diferents molècules i fluids.
Aquestes estructures poroses donen lloc al que anomenem compartiments intercromosòmics (IC), i són complexes multienzimàtics implicats en la replicació, transcripció, reparació i splicing.
36 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Moltes dades demostren que en el nucli no nomes hi ha cromatina.
En els nuclis interfàsics, amb microscòpia confocal, s’observa com es distribueix la histona H2B. Amb un anticòs conjugat amb un fluorocrom de color verd es va veure quina part del nucli quedava tenyida de verd. No tot es tenyia de verd, ergo no tot és cromatina Section showing GFP-tagged chromatin (high density, white; low density, grey), two nucleoli (nu) and the interchromatin compartment (IC) space (black).
Què hi ha a les zones no verdes? Per saber-ho utilitzem un factor d'splicing (factor que produeix la maduració dels RNAs). Es marca amb un anticòs i es veu on es distribueix en el nucli. Tot lo blanc en la imatge és splcing.
Speckles visualized in the same section using antibodies to the nonsnRNP splicing factor SC-35.
Total que superposant les imatges obtenim: En el resultat d’imatges superposades veiem que les zones on no hi ha H2B coincideixen amb les que sí que hi ha splicing.
Overlay of sections (chromatin, green; speckles, red) shows that speckles form clusters in IC lacunas.
Total que al nucli hi ha territoris que presenten tota la enzimologia que necessita la cèl·lula per dur a terme la transcripció, reparació i splicing dels cromosomes.
MODEL CT/IC Tot això s’explica en el model CT/IC (Cremer et al. 2001): - CT (Chromosome territories).
IC (Interchromatin compartiment) – complexes multienzimàtics implicats en la replicació, transcripció, reparació i splicing.
Aquest model explica com es distribueixen els territoris cromosòmics i els segments dins cada territori.
37 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Les regions heterocromàtiques estan situades a l’interior del territori, les regions eucromàtiques estan a la perifèria, les regions de replicació primerenca (verd) se situen a l’interior i les tardanes (vermell), a l’exterior.
En ser una estructura porosa, comprèn complexes multienzimàtics situats en aquests porus amb regions especialitzades per cada cosa.
Es tracta d’un model dinàmic – només es pot explicar partint que els territoris tenen una capacitat de moviment (un gen pot expressar-se en un moment i no fer-ho en un altre).
Per demostrar aquest dinamisme dels territoris cromosòmics en funció de l’activitat dels seus gens, es va fer un experiment consistent en activar els gens A i C mantenint inactiu el gen B – es va veure que A i C sortien del seu territori i es posicionaven en una regió del centre (si eren actius) o de la perifèria (si eren inactius). Aquests moviments són fàcilment apreciables al microscopi.
38 ...