00. TOT Biotec Indústria (1 únic doc.) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura biotecnologia indústria
Profesor
Año del apunte 2016
Páginas 93
Fecha de subida 22/10/2017
Descargas 1
Subido por

Vista previa del texto

CTRIGUERO BIOTECNOLOGIA: INDÚSTRIA BLOC 1: BIOTECNOLOGIA MICROBIANA TEMA 1 - ELS MICROORGANISMES COM A EINA BIOTECNOLÒGICA 1. Ús d’organismes sencers (bacteris, fongs, virus…) 2. Microorganismes necessaris per certes etapes químiques = BIOCONVERSIÓ 3. Ús de microorganismes perquè produeixin una substància que ens interessa FERMENTACIÓ A partir de fosforilació a nivell de substrat per obtenir energia.
Oxidació parcial de la molècula d’oxigen (ineficient) Al final si es necessita poder reductor per obtenir etanol Qualsevol transformació de matèria orgànica per un microorganisme (terme biotecnològic) Exemples d’ús de cèl·lules en biotecnologia: LLEVATS (unicel·lulars que es reprodueixen per gemmació) - Saccharomyces cerevisiae o Fermentació alcohòlica de cervesa/vi/cava o Fermentació alcohòlica en pa o Complements alimentaris també per a microorganismes, pinsos, humans.
- Saccharomyces pastoranus o Fermentació cervesa Lactobacillus delbrueckii Streptococcus thermophilus Iogurts Bifidobacterium Lactococcus lactis Leuconostoc Lactobacillus Lactococcus lactis S. thermopgilus característica Leuconostoc Penicillium Mantega Formatges -> Alguns s’utilitzen només en el procés però només aportant 1 CTRIGUERO Lactobacillus Pediococcus Staphylococcus Maduració de la carn Al fer servir aquests microorganismes, disminuïm el pH dels aliments i es conserven durant més temps Hi ha molts microorganismes útils en VACUES tant contra bacteris com contra virus per mitjà d’atenuacions o inactivacions per mitja de calor o químicament amb formaldehid.
Als atenuats els hi hem tret la virulència però poden ser reconeguts per l’organisme, Per fer-ho: - cultius envellits - subcultius (fer passes) - injecció a un hoste diferent del que serà vacunat (haurà perdut la virulència si aconsegueix sobreviure en l’altre hoste) - extraient o mutant el gen de virulència.
La vacuna contra el virus de l’Hepatitis B s’ha aconseguí a partir de la clonació d’una proteïna de superfície de viurs (PROTEÏNA RECOMBINANT) Vacunes de polisacàrids: Fragments de polisacàrids extrets de la càpsula K i a vegades s’hi conjuguen altres proteïnes per tenir més immunogenicitat.
Dins d’una mateixa espècie hi hauran fenotips diferents i per tant es classificaran en base al serogrup (grup de soques que comparteixen l’antigen K) Es fa una barreja de polisacàrids amb els serogrups que són patògens.
Al utilitzar una proteïna conjugada fem servir un TOXOIDE (proteïna tòxica inactivada però que segueix sent immunogènica fent que la vacuna sigui eficaç).
Vacuna Toxoide: en casos com Diftèria i Tètanus que el que causa la malaltia no és la infecció sinó el toxoide, que serà la part que inoculem.
ÚS DE BACTERIS EN BIOCONVERSIÓ S’utilitzen en certes reaccions per fer determinats passos que no es poden fer químicament i necessitem l’acció de, per exemple, Mycobacterium fortuitus o Rhizopus 2 CTRIGUERO ÚS PER OBTENCIÓ D’ENZIMS Certs enzims no es poden obtenir químicament sinó que necessitem de bacteris o fons per aconseguir els enzims adequats. Es du a terme en moltes industries.
Cal saber quina activitat té l’enzim i si és actiu o no. Cal tenir certes coses clares com: temperatura òptima, pH, etc.
Per exemple 2 enzims completament diferents però amb una activitat que el resultat final sigui el mateix, han d’actuar a la mateixa temperatura. (Thermus aquaticus va ser el primer microorganisme del qual es va aïllar un enzim que funcionava a altes temperatures).
També poden ser productors de certs metabòlits primaris de l’organisme com: producció d’àcid acètic, àcid cítric, etc.
I també obtenció de Vitamines B, alcohol, etc.
Metabòlit primari: es produeix alhora, en paral·lel, del creixement del microorganisme: conforme creix el mricoorg, creix la producció de metabòlits primaris. Són essencials per la cèl·lula.
Estan a la fase exponencial de creixement del microorg.
La màxima producció de metabòlit primari és al final just de la fase exponencial.
Metabòlits secundaris: no son requerits per al creixement del microorganisme, no són essencials. En la majoria dels casos depenen de la producció dels primaris (primaris normalment precursors dels secundaris).
No sempre passa així. Pot ser que a partir dels nutrients del medi es facin metabòlits secundaris Els trobarem en la fase estacionaria (quan el microorganisme és actiu però no creix) Depenen si vols un metabòlit primari o un secundari es fa en cultius en fase exponencial o en fase estacionaria.
Exemples Metabòlits secundaris · ANTIBIÒTCS: - Acció sobte RNA-polimerasa (Ryfemicyn) - A nivell de paret (Penicil·lina, bacitracina...) - ÀCID CLAVULÀNIC: Inhibeix la β-lactamasa (no es realment un metabòlit secundari) - Acció sobre DNA, traducció... (antifúngic) · ANTITUMORALS: Streptomyces penceilus · IMMUNOSUPRESSORS: Ciclosporina A, Tractolimus, Rapamicina · Alcaloides (lovastatina) PRODUCCIÓ DE PROTEÏNES NO PRÒPIES Podem produir en microorganismes proteïnes que no li són pròpies -> Proteïna HETERÒLOGA - Factors de coagulació - ...
- INSULINA - HORMONA DEL CREIXEMENT HUMÀ (hGH) - ACTIVADOR DEL PLASMINOGEN TISSULAR (tPA) Rhizobium -> Augemnta la fertilitat del sòl associat a les arrels -> fixen el N2 atmosfèric Depuració d’aigües residuals Vessament de petroli -> Bioremediació Mineria -> Extracció de metalls pesants per Bioliximació usant microorganismes.
3 CTRIGUERO TEMA 2 – ESQUEMA GLOBAL D’UN PROCÉS DE BIOTECNOLOGIA MICROBIANA Inici buscar, agafar mostres i cultivar-los Quan ja tenim una col·lecció de soques, es cultiven en diferents medis de cultiu perquè poden influir en quines molècules s’obtenen.
A partir d’aquí es fan extractes i es fan cribratges de les activitats que ens interessen.
Després del cribratge seleccionem quins extractes son actius i quins no.
Els extractes solen ser mescles de molècules i requerirà d’un fraccionament per anar acotant on està la activitat.
Quan ja ho hem aconseguit (veiem que te una bona activitat on busquem ) i que no és una molècula coneguda (desreplicació) -> en aquest moment s’anomena HIT Ara mirem si es pot produir a escala industrial, si és rentable, si és tòxic i s’intenta conèixer la estructura, el mecanisme d’acció i la ruta biosintètica Si tot això va bé passem a la ultima fase i el HIT es converteix en LEAD. Aquest LEAD ha de complir una normativa, fer assajos clínics, etc. fins que s’autoritza el fàrmac.
És un procés llarg i laboriós.
FÀRMACS D’ORIGEN NATURAL 48% són productes d’origen natural.
Els que son exclusivament sintètics són el 27% La resta són sintètics amb farmacofor d’origen natural o que mimetitza els productes naturals (inhibidors competitius de una molècula natural) PUNTS FORTS: - Major diversitat química i complexitat estructural i la potència biològica - Selecció natural per a interaccions biològiques específiques - Principal font de farmacòfors - Fonts inexplorades - La seva recerca pot portar al desenvolupament de les ciències biològiques - Eines importants per al desenvolupament de la biologia cel·lular i molecular, fisiologia, química, etc.
- Pot ser una guia per al disseny de compostos orgànics 4 CTRIGUERO PUNTS FEBLES: - Manca d’exploració d’ecosistemes (encara molt per analitzar) - Només un 1% dels microorganismes són cultivables.
- Selecció de soques per criteris fenotípics més que per criteris químics i genotípics - Evitar duplicitats per manca de “desreplicació” -> els que redescobrim han de ser nous.
- Obtenim mescles complexes i els compostos actius obtinguts són en baixa proporció i tenen estructures semblants.
- Dificultat en l’aplicació de cribratges d’alt rendiment (cribratge de moltes mostres alhora per optimitzar el procés) HTS: High Throughpunt Screening - Requereix gran esforç i molt de temps.
QUE CAL FER? - Mostratges nous i diversos - Noves estratègies d’aïllament - Aplicació de tècniques moleculars (seqüenciació, genotipatge...) MALDI TOF: de tècniques analítiques (HPLC, Espectroscopia de masses, TLC) - Fraccionament de les mostres - Estratègies de millora de soques i de condicions del cultiu i els medis - Recerca en el desenvolupament de noves tecnologies - Cal automatitzar ↑ BIODIVERSITAT = ↑ DIVERSITAT QUÍMICA Descobriment de nous microorganismes: No s’otorga finançament sinó que es fan encoberts en altres estudis Ecosistemes poc estudiats: On majoritàriament es busquen és en oceans i en sòls (hàbitat natural dels actinomycets-> productor de metabòlits secundaris) Els microorganismes que viuen a grans profunditats són hiperbaròfils També la diversitat d’ecosistemes fa que puguem descobrir nous microorganismes - Ambients polars = Psychromonas (12ºC) - Ambients termòfils = Pyrococcis (105ºC) Potser el creixement en aquests ambients extrems ens permeten trobar nous microorganismes.
En el sòl també passa: a major profunditat més microorganismes.
En la diversitat geogràfica trobem que la biomassa s’acumula en les costes i en els pols.
Ara també es mira com afecta el canvi climàtic.
5 CTRIGUERO També busquen quins microorganismes són els que ens colonitzen - MICROBIOTA: microorganismes que es localitzen en un hàbitat concret MICROBIOMA: gens que es troben en una determinada microbiota (99% dels gens del nostre organisme és gen bacterià) De la Biodiversitat microbiana en coneixem >10.000 especies bacterianes -> 104 sp.
En el planeta trobem de 106 a 109 espècies bacterianes (són aproximacions) Es descriuen unes 600 espècies noves per any ja que el preu de la seqüenciació del genoma complet ha baixat molt.
Acumulant dades genòmiques cada vegada es recoloquen de manera que les soques creixin per a un mateix microorganisme. Al fer la seqüenciació genètica veiem que la gran majoria són gens compartits i per això No són espècies noves sinó que només són soques noves.
Dels genomes complets 1/3 no sabem encara que fan.
AÏLLAMENT I CULTIU DE MICROORGANISMES: · Mètodes clàssics - Per estria - Per esgotament - Fent servir membrana de diàlisi-> permet la separació de 2 soques però per separat i compartint nutrients (es necessiten entre elles) · Mètodes Nous: - MEDIS OLIGOTRÒFICS: Amb excés de nutrients que aturen el seu creixement - REDUCCIÓ D’ESTRÉS OXIDATIU: per mitjà de piruvat o catalasa - ADDICIÓ DE MOLÈCULES DE SENYALITZACIÓ CEL·LULAR (cAMP, lactones N-acil- homoserines -> permeten reconèixer-se entre si, per augmentar la població del microorganisme i sobreviure) - AÏLLAMENT I CULTIU D’ALT RENDIMENT: l’ideal seria fer volums mínims en cada pouet que permeti la diferenciació cel·lular (d’una sola cèl·lula) S’intenta aïllar i cultivar el microorganisme en el mateix medi de cultiu de recollida.
Inoculem agar estèril amb la mostra i li donem forma de disc segellat per 2 membranes que no permeten el pas de microorganismes però sí de nutrients del sòl. Les cèl·lules de la colònia començaran a créixer, s’agafarà i s’intentarà cultivar al laboratori.
La membrana també pot tenir porus que permetin el pas de certs microorganismes.
També es fa cultius de nanopous (estructura de xip) de manera que en cada nanopouet hi va a parar una cèl·lula de manera que al posar-ho en contacte amb agar sang o agar xocolata, els nutrients flueixen i permeten el creixement de les cèl·lules. S’agafen les cèl·lules i s’intenten cultivar al laboratori.
6 CTRIGUERO - I-CHIP Multipous on queda atrapada la mostra entre 2 membranes semipermeables i es posa en contacte amb un medi igual al d’on s’ha extret la mostra.
Mostra de sòl resuspesa i inocular i-chip -> s’espera que només una cèl·lula caigui a cada pouet. Es posen en contacte amb el mateix sòl i ho incuben. Un temps despres es recuperen i s’observa el creixement de microorganismes que es traspassen a un cultiu de laboratori miniaturitzat.
Això ens permet fer rèpliques en plaques de 96 per provar nous medis i noves condicions de creixement.
Es mira ara si el cultiu te capacitat antimicrobiana (com el recentment trobat Teixobactin) S’ha seqüenciat el genoma complet per veure una nova espècie bacteriana Eleftheria terrae.
La diana del pèptid és la paret cel·lular inhibint-ne la síntesi i el bacteri és gramnegatiu.
Disminueix la concentració mínima inhibitòria (smic) i actua contra grampositius i micobacteris i conta soques multiresistens com Staphylococcus aureus i Enterocuccus fecalis S’ha intentat fer simulacions de resistència en els antibiòtics per veure’n la seva efectivitat. -> No s’ha trobat cap resistent, cosa que fa un bon antibiòtic - A partir d’una mostra es fa una aproximació genòmica: S’extreu DNA de la mostra i s’analitza. Per comparació de soques detecten algun fragment de DNA que tingui activitat interessant -> Han ideat un sistema que aïlla el microorganisme a qui pertany el gen (tota una innovació!) La mostra s’inocula en xips (més petits que i-xip) amb 3200 pouets (mida 2 monedes) de manera que en cada pouet càpiguen pocs microlitre i separar així cèl·lules soles.
Permet també fer moltes rèpliques en molts xips i canciant les condicions i/o mides de cultiu, s’incuben i es mira en els xips si hi ha creixement o no.
En els que hi ha creixement es recull tot el contingut del xip per mitja de rentat. Un cop tot recollit, es fa un PCR que pots dissenyar per detectar la seqüència correctament.
PCR +  Seqüenciació Alguna de les seqüencies pot ser que siguin molt semblants a la de referènica  voldrà dir que hem aconseguit el bo  es guarda el xip.
Es torna a la mostra inicial i es torna a sembrar amb les mateixes condicions que els xips +.
Farem un mínim de 2 rèpliques  Cal que la rèplica estigui situada en el mateix lloc de la placa.
En una de les rèpliques es fa PCD directe per pouet per veure si és PCR +  Així sabem quin microorganisme tenim.
Desreplicació de soques: Si la soca és diferent a les ja conegudes i interessant, es guarda en col·lecció de soques.
7 CTRIGUERO Cribratge directe de soques: Dilucions de la mostra i es sembra per superfície en plaques  Busquem soques ben separades entre elles i les incubem durant molt de temps per arribar a la fase estacionària on es produiran els metabòlits.
S’afegeixen a la placa un microorganisme control o indicador -> Apareixeran colònies sense Straphilococcus epidermis a sobre que vol dir que algun metabolisme secundari n’inhibeix el creixement.
Es fa una estria amb les colònies interessades a 1/3 de la placa i s’incuba.
Més tard hi posem altres indicadors amb diferents activitats en el microorganisme: - E. coli -> G+ - S. aureus -> G+ - Mycobacterium - Klebsiella pneumoniae: productor de càpsula S’afegeixen en estria vertical perpendicular a l’estria per esgotament. Els que no arriben a l’estria de metabòlits secundaris no ens serviran.
Aprofitament Fisiològic de “SOQUES DE TALENT” (Talented strains) Soques amb gran producció de metabòlits secundaris: - Actinomicets : Streptomyces Una única soca produeix moltíssims metabòlits secundaris - Penicillium i altres floridures (floridures en general bons productors de met. 2aris) - Cos fructífer de Mixobacteris  En situacions d’estrès produeixen cossos fructífers.
Cal cultiva en diferents condicions de cultiu o medis (Medis líquids + velocitat d’agitació, medis sòlids, diferents pH, diferents temperatures, etc.) Pensar que els medis de creixement son diferents que els medis de producció. A partir dels quals valorem com a extracte. A aquest extracte se li poden fer molts processos per trobar el metabòlit actiu, en cas de no saber on és, o si està dins la cèl·lula caldrà lisar-les ( o bé trencar el periplasma i la paret cel·lular per lisozims) També ens pot interessar millorar la producció: - Canvi de medi de cultiu - Obtenció de mutants - Clonatge de gens i producció en un altre microorganisme Cribratges d’alt rendiment Permet analitzar un gran nombre de mostres Hem d’intentar que l’assaig sigui amb els menors passos possibles (i millor automatitzat) Depenent de la molècula activa que estiguem descobrint potser no hi ha un assaig determinat i per tan s’haurà de desenvolupar i validar assajos d’activitat (ha de ser reproduïble, molt bona sensibilitat, reproductibilitat i especificitat) Al final la molècula activa si passa tots aquests filtres arriba a la producció industrial Mirar també l’activitat cel·lular També es veu l’efecte amb AMPc i tècniques d’imatge molecular.
8 CTRIGUERO En els assajos bioquímics, els d’Alt rendiment són millors, ara bé, com treballem sense cèl·lules, després no tindrem efectivitat in vitro.
Els assajos cel·lular requereixen més temps però han millorat prou  En Creixement Cel·lular obtenim molts bons resultats però encara no podem dir que siguin d’Alt rendiment ( Gran necessitat de plaques per fer-los créixer).
També s’ha avançat molt amb marcadors fluorescents veient cèl·lules que canvien i poden causar efectes citopàtics (com varia la cèl·lula amb el dany cel·luar) també permet la localització cel·lular al localitzar la molècula activa i això es du a terme amb Tècniques d’Alt Rendiment.
Si busquem activitats cel·lulars noves, necessitarem utilitzar cèl·lules.
TEMA 3 – TÈCNIQUES METAGENÒMIQUES Tenim tècniques de cultiu cel·lular, però també s’estudia el DNA: - PCR - Seqüenciació rDNA 16 s ( en desús perquè només un 1% són seqüències conegudes) - Tècniques Metagenòmiques: s’agafa una seqüència genòmica, es clona i és internalitzada en un altre microorganisme perquè l’expressi Ara hi ha una tècnica que permet seqüenciar els gens directament per comparació genòmica = EVOLUCIÓ METAGENÒMICA També es pot seqüenciar el mRNA per saber quins són exactament els gens que s’expressen en cada moment = METATRANSCRIPTÒMIC METAGENÒMICA Estudi dels gens microbians extrets directament de comunitats en mostres ambientals sense cultivar Interès en el desenvolupament de noves aplicacions industrials a partir dels gens dels microorganismes desconeguts: - Biotecnologia BLANCA: L’ús industrial de la biotecnolofa per a produir productes químics fins, biocombustibles, bioplàstics, enzims per al seu ús en detergents, aliments i pinsos...
- Biotecnologia VERMELLA La biotecnologia en la cura de la salut: medicaments, vacunes, diagnòstics i teràpia gènica.
- Biotecnologia VERDA La biotecnologia aplicada a l'agricultura, per ex. a la producció de cultius transgènics genèticament millorats amb resistència a plagues.
Els límits entre la biotecnologia blanca, verda i vermella es veuen borrosos.
9 CTRIGUERO TÈCNIQUES METAGENÒMIQUES AVANTATGES: - No necessitem cultivar els microorganismes - Possibilitat de recuperar i detectar genomes en baixa freqüència INCONVENIENTS: - La metodologia i eficàcia de l’extracció de DNA - Problemes en el manteniment i l’expressió de gens (microorganisme receptor, medis d’expressió…) - Dificultat en conèixer de quin microorganisme provenen els gens d’interès.
SEQÜENCIACIÓ DIRECTE O MASSIVA: Qualsevol fragment de DNA pot ser seqüenciat de forma massiva CLONACIÓ I EXPRESSIÓ GEN: Al expressar un gen concret pot ser que no funcioni.
COMBINACIÓ METAGENÒMICA I CULTIU: 60 soques productores de productes naturals -> van fer 2 aproximacions: - CULTIU: Aconseguien 65 productes naturals Paral·lelament van haver de fer una base de dades amb seqüències de gens i la predicció de l’estructura.
Van fer un cribratge genòmic sobre el DNA buscant productes naturals i va donar que de 60 soques hi havia 700 productes naturals.
Van demostrar que amb les tècniques genòmiques es podia descobrir 10 vegades més productes que amb les tècniques Biològiques.
10 CTRIGUERO EVOLUCIÓ IN-VITRO ENZIMÀTICA Abans de començar havien de dir l’enzim ideal i s’havia d’establir una sèrie de paràmetres per tal de controlar i que pogués obtenir-se l’enzim ideal.
Cal tenir una bona base de dades.
Extraiem DNA  Clonatge i Expressió Treim 2 activitats  Cada clon tindrà una activitat fins a veure quina funciona millor (tenim tot el DNA)  Ens quedem amb l’activitat que més ens interessi El problema és que la base de dades ha de ser molt extensa.
El biocatalitzador ideal: Per a qualsevol aplicació industrial, els enzims necessiten funcionar bé d'acord amb els paràmetres de rendiment d'aplicacions específiques. En lloc de dissenyar un procés per adaptar-se a un enzim, és possible que, a la diversitat microbiana no cultivable juntament amb les tecnologies d'evolució in vitro, puguem trobar un/s enzim/s natural adequat que serveixi com a base per a produir un enzim de disseny que, de manera òptima, s'adapti als requisits del procés.
PROSPECCIÓ METAGENÒMICA DE NOVES LIPOOXIGENASES Les lipooxigenases (LOX) tenen diferents funcions segons l’organisme: - En mamífers actuen en la formació de mediadors lipídics - En bacteris actuen com a tensioactius i bioremediació.
- També es troba en plantes: Àcids linoleic i linolènic  Resistència (estrès, infeccions, plagues) Objectiu: Aplicació de la tècnica dels microxips al rastreig de noves lipoxigenases en mostres de sòls.
A partir de mostres de sòl buscaven LOX -> van triar un non kit d’extracció de DNA i van buscar també un kit clonatge EPICENTRE = COSMID CLONING KIT Utilitzaven 9024 clons que representen els fragments Mostra de sòl -> DNA -> cosmidi -> E.coli -> 9024 clons = 94 plaques de 96 pous Primera estratègia: PCR amb encebadors De cada una de les repliques es treu el DNA del cosmidi-> ajuntar les fraccions en la seva placa corresponent > PCR -> si surt positiva es torna a fer dels 96 pouets per saber a quina banda corresponia De les plaques positives també es comparen amb els microxips Microxips: tenim 2 sondes Sobre els mateixos pouets es fica les 2 sondes -> hem de distingir quan es positiu per una sonda i quan ho es per una altre (vermell i verd -> diferents fluorocroms) Sobre controls positius i negatius s’ha de mirar a quines temperatures s’ha de fer la hibridació amb la sonda, quina concentració esta la sonda, si hi ha rentats, amb que es fa el rentat .. -> posar apunt el microxip.
Hem de fer un tractament d’imatge amb un programa informàtic-> es veu a partir de quina intensitat d’aquest color es dona com a positiu o no (eliminar el soroll de fons) El que esta amb les fletxes grogues son els positius S’ha de fer tot per triplicat perquè sigui mes fiable 11 CTRIGUERO Després del tractament de la imatge es donen un valor a partir del qual es considera positiu i per baix es considera soroll de fons En base a això tens uns resultats -> quin clon es positiu i no Pot ser que algun clon t’hagi donat positiu en les tres repliques i en les 2 sondes, però també pot ser que en 1 sonda si i en altre no, etc.
A partir d’aquí tenim quants clons son positius amb una metodologia i amb una altre (PCR i microxips) RESULTATS Clons que han superat el filtratge als dos canals o en cada una de les rèpliques dels spots que han superat el filtratge en el canal verd i en el canal vermell per separat: 85A1, 71F5, 89D7, 71E3, 85A12, 71D3, 71H1 i 71H3 Clons que han superat el filtratge en el canal vermell, són els següents: 06G7, 06G3, 06B3, 06C1, 06G4, 85G7, 71F4, 85F1 i 85E3 Clons que en alguna de les rèpliques han superat algun dels tres tipus de filtratges que s’han realitzat: 89G7, 85G11, 89A5, 85D3, 71C7, 85B3, 85A9, 71E10, 85E7, 06C3, 89F2, 85H8 i 06C8 És destacable l’absència de clons que únicament superin els filtratges per al canal verd. Això pot estar indicant, que la seqüència sobre la que es va dissenyar aquesta sonda realment és molt més variable que no pas l’altra sonda i que per tant la hibridació és molt més difícil.
SNR (Signal-to-Noise Ratio) SNR = (Intensitat de senyal- Background) / SD background Valor llindar = 3 - Anàlisi independent de cada canal.
- Eliminació d’spots amb menys de 150 píxels.
- Intensitat de cada spot = mitjana del senyal de l’spot - mitjana del soroll de fons (6 rèpliques per spot).
- Dos mètodes per al càlcul del background aplicat a la fórmula de SNR (càlcul independent per a cada canal en cada array): o El background és la mitjana de totes les intensitats dels spots de la placa 85 (control negatiu) excepte el control positiu.
o El background és la mitjana de totes les intensitats dels spots (4 plaques) excepte el control positiu.
- Càlcul de l’índex SNR per a cada spot usant la mitjana del background i la desviació estàndard corresponent a cada array i a cada canal.
- Comprovació que cap spot de la placa 85 té un valor de SNR superior a 3. No el té en cap cas.
- Càlcul de la mitjana i de la desviació estàndard de l’índex SNR pertanyents als punts amb el mateix nom, per a cada canal.
- Seleccionar aquells clons amb valors de l’índex SNR superiors a 3.
12 CTRIGUERO TEMA 4: MILLORA GENÈTICA Obtenint mutants: - Mutagènesi al atzar - Mutagènesi dirigida - Recombinació genètica La diferencia entre dirigida i atzar: al atzar mires si de manera natural o espontània hi ha una mutació o de manera induïda fent un tractament mutagènic Si es al atzar No sabem on s’ha produït la mutació i No sabem si afecta al que nosaltres volem, que és produir més.
En la dirigida hem de saber la seqüencia d’allò que volem mutar → ens permet fer un canvi o més de nucleòtids en llocs concrets de la seqüencia Al ATZAR: si la deixem de forma espontània, hem de tenir en compte que la freqüència de mutació dels bacteris es de l’ordre de 10-7-10-11/pb Un gen te 103 pb En un cultiu tenim uns 106-108 bacteris → en cada subcultiu pot haver-hi una mutació en alguna cèl·lula Per augmentar la freqüència de mutació hem d’induir-les Podem induir-les física, química o biològicament · Físics: - Radiacions ionitzants (raigs X i gamma) → penetren i causen dany al DNA. Depèn de la intensitat del tractament és molt efectiu com a mutagen però també causa una gran letalitat (no és massa aconsellable) - Rajos ultravioletes → això si que es fa servir per les mutacions al atzar · Químics: - Agents alquilats: o Nitrosoguanidina o Mostassa nitrogenada - Agents intercalants (pràcticament ja no s’utilitza) - Anàlegs de bases · Biològics: - Fags - Plasmidis - Transposors 13 CTRIGUERO Tenim una soca que és productora, en un cultiu líquid es fa el tractament mutagènic i despès cultives en placa i obtens una sèrie de colònies.
Hem de seleccionar quines soques son productores i quines no (volem un mutant però que tingui la mutació on la puguem replicar) Per SELECCIONAR: 1. Mirar les colònies: si la colònia ha canviat és que ha mutat (hi ha excepcions) 2. Soques auxòtrofes→ si algunes colònies s’han tornat auxòtrofes (necessiten un compost que abans no necessitàvem → deixen de ser capaços de produir un metabòlit, normalment es que la cèl·lula no te algun aminoàcid → hem d’assegurar que estigui en el medi de cultiu) Les soques que son auxòtrofes per algun aminoàcid → afegint l’aminoàcid augmentem la producció 3. Reversions de mutacions: Sobre les que han mutat tornem a fer un altre tractament mutagènic → per exemple una que s’havia tronat auxòtrofa, deixa de ser-ho. → això també pot donar sobreproducció 4. Reversió de la no producció: això també augmenta Actuar sobre la expressió gènica: Retroinhibició: inhibició de producte final. Ex: si volem produir prolina, quan hi ha una determinada quantitat de prolina inhibeix la producció Repressió: s’inhibeix la transcripció Atenuació Inhibició de la traducció És millor si coneixem la ruta biosintetica per poder actuar en diferents llocs de la biosíntesi.
Ex: si volem sobreproduir treonina : inhibir el pas de la isoleucina 5. Resistència als antimetabòlits: anàleg de metabòlit tòxic → entra en competència amb el metabòlit natural → els mutants resistents als antimetabòlits acaben produint més producte.
6. Resistència al producte i 7. Resistència al antibiòtic: una soca productora no es tolerant a qualsevol concentració del propi producte, pot arribar un moment en que el mateix producte inhibeixi la producció però per toxicitat (s’ha secretat al medi i la molècula acaba sent tòxica per a propi bacteri) 8. Mutants que fa que sigui mes tolerant a elevades concentracions de carboni: si la soca pot tenir mes font de carboni → mes producte 9. El mateix amb fosfats 10. Tenim mutants i fem assaig d’antibiòtics clàssics → mes producció en agar ? 11. Canvis en la permeabilitat: si tenim un mutant que afecta a la entrada de producte a la cèl·lula → l’acumularem més.
14 CTRIGUERO Segons el que vols, vas seleccionant quins sobreprodueixes.
Exemple: Penicil·lina: Al principi la producció era de 3 mg/L i ara s’ha aconseguit fer 40 g/L Van fent mutacions : - S: espontània - X: rajos X - NM: Mostassa nitrogenada - NG: nitrosoguanidina - UV Ara sabem quins gens estan implicats en la biosíntesi Amb duplicacions gèniques de gens implicats en la biosíntesi fan augmentar molt la producció.
També hem de conèixer be les rutes biosintètiques Si volem incidir d’una manera dirigida hem de saber com funcionen les rutes Per exemple: per produir mes β-lactamics augmentar la lisina en E.coli aniria be, però en fongs ho inhibeix.
15 CTRIGUERO MUTAGENESIS DIRIGIDA: FAGS Hem de conèixer prèviament la seqüencia perquè sinó no podem variar uns nucleòtids determinats Es fa amb E. coli Els 2 tenen en comú que aprofiten el genoma d’un virus, quan esta clonat el gen d’interès s’hibrida amb un oligonucleòtid → en aquest oligonucleòtid estarà aquell nucleòtid que volem canviar en una determinada posició.
Exemple1: Fag M13 es de cadena simple de DNA → quan entra dins bacteri ha de fer doble cadena El que es fa és aprofitar el genoma on esta clonat el gen, posem oligonucleòtid amb nucleòtid canviat → síntesi de DNA i completem la doble cadena.
Després ho transformem en E. coli i quan esta dins, la doble cadena del genoma víric es replicarà de manera que obtindrem dos variants del virus: una on s’ha incorporat la mutació i altres que no.
Després quan s’han produït aquest virus, hem de detectar en quins s’ha incorporat la mutació i en quins no → mitjançant sondes.
Exemple 2: Tota la producció es amb el gen mutat 1r partim de doble cadena (s’anomena forma replicativa) Tenim el gen clonat però en les dos cadenes A continuació es transforma en E. coli però es una E. coli que te unes determinades mutacions que a l’hora de replicar el DNA fica uracils → Quan es replica el DNA incorpora uracils en comptes de tiridines Ara se li afegeix el oligonucleòtid amb la mutació→ se sintetitza la cadena complementaria a partir d’aquest oligonucleòtid però com ho estem fent per síntesi (fora de la cel), la cadena complementaria si que te les T Tindrem una cadena normal que te la mutació i una altre que tindrà els Uracils Un cop tenim això es torna a transformar en uns E. colis normals →Quan detecten Uracils es degrada→ tot serà de les cadenes que eren correctes → Tot el que s’obté ja te la mutació Es una manera de dirigir la mutació especifica en un lloc concret de qualsevol gen.
16 CTRIGUERO MUTAGENESIS DIRIGIDA UTILITZANT PLASMIDIS: · Plasmidi amb el gen clonat, desnaturalització i síntesi de dsDNA amb un oligonucleòtid amb la mutació: Tenim un plasmidi i el que fem es inserir un DNA diana (gen que volem mutar) i ja el tenim clonat al plasmidi.
A continuació es desnaturalitza el DNA perquè es separin les 2 cadenes i alhora hi posem oligonucleòtids amb el canvi de mutació que volem. També un oligonucleòtid que canviï la resistència a un aminoàcid.
Quan es fa la síntesi del DNA (completem la doble cadena) -> entrem aquest plasmidi a E. coli -> aquests plasmidis es poden replicar dins les cels Hem de seleccionar aquells clons que tinguin la mutació -> hem de seleccionar els plasmidis que tinguin el gen mutat i això ho farem cultivant els clons amb i sense antibiòtic per veure quins han adquirit la mutació · Plasmidi + 2 encebadors + PCR = mutacions puntuals, insercions i delecions.
També ho podem fer sense els cultius bacterians: Combinar plasmidis, amb encebadors i PCR Per fer això partim d’un plasmidi on esta el gen mutat.
Fem servir 2 encebadors, un per cada cadena.
En un dels encebadors canviem un nucleòtid al fer la PCR, es faran repliques del plasmidi i ja tindrem incorporada la mutació  Canvi en un lloc d’un nucleòtid = mutació puntual Variants: Podem fer mutació amb delecions: Deixem 1 o diversos nucleòtids que no estan coberts pels encebadors -> això no s’amplifica-> quan es fa la PCR crees una deleció També podem tallar els encebadors mes enllà del inici -> quan fas la PCR també s’acabarà replicant aquesta cua de manera que estem afegint nucleòtids de mes = inserció (pot ser mes o menys llarga) També es pot fer amb algun nucleòtid de mes pel mig -> quan es replica haurem inserit algun nucleòtid de mes.
17 CTRIGUERO PCR Ho podem fer amb: - Oligonucleòtids degenerats: nosaltres dissenyem que en alguns llocs siguin llocs variables - PCR utilitzant una polimerasa que sigui propensa a l’error -> dirigida a un gen però les mutacions que trobarem, com son errades de la polimerasa, son al atzar. No sabem quins son els llocs on canviarà .
Ho podem saber després amb seqüenciació.
RECOMBINACIÓ A diferencia dels altres sistemes No son canvis puntuals de pocs nucleòtids, sinó que afecten a regions més grans de la seqüencia Aquesta recombinació es pot fer de diverses maneres: · GENS HOMÒLEGS → fem barreja entre els 2 al·lels - Trencant amb enzims de restricció → fragmentem els gens i els mesclem → amb aquests enzims sabem on actuen → esta dirigit → provoquem fragments de longitud coneguda.
Després ho lliguem → com tenen homologia, alhora de formar-se de nou, es crearan totes les combinacions possibles (l’ordre es el mateix però les combinacions son diverses) Estem creant diferents variants del mateix gen i després hem d’assajar quin funciona millor - Fragmentar el DNA i fer PCR → obtenim diferents híbrids · També podem fer la recombinació amb Cultius de microorganismes: FUSIÓ DE PROTOPLASTS: Protoplast = quan una cel amb paret cel·lular li eliminem la paret (la cel segueix sent viable) Bacteris com Streptomyces, Saccharomyces Llevats com: Asperfillus, Cephalosporium, Nocardia, Penicillium 1 cromosoma dins de cada cèl·lula bacteriana.
Tractament enzimàtic per obtenir protoplast amb lisozim Intentar que es fusionin els protoplasts → podem ajudar mitjançant polietilenglicol a la suspensió Quan es fusionen 2 cèl·lules es tendeix a que de 2 cromosomes en quedi 1 → transformar 2 cels en 1 Perquè això passi hi ha d’haver una recombinació entre un genoma i l’altre. (Cels de mateixa sp o gènere perquè els cromosomes tinguin suficient homologia per recombinar-se) Posem en cultiu les cels recombinants → creixen i sintetitzen de nou paret cel·lular És una recombinació absoluta de 2 cromosomes en 1.
18 CTRIGUERO TRANSPOSONS Plasmidis i transposons Transposo dins d’un plasmidi Gracies al transposó podem fer que salti el gen del plasmidi al cromosoma → manera d’introduir una copia gènica més.
TRANSFORMACIONS: Quan les cels son competents poden introduir DNA de fora de la cel que esta lliure i aquets DNA es pot arribar a recombinar, si hi ha suficient homologia, amb alguna zona del cromosoma.
Exemple: Bacillus subtilis Producció de alfa amilasa i de proteasa Si seguim fletxes d’abaix es va transformant: s’agafa una altre soca de Bacillus que també es productora → es lisa el cultiu d’una soca per a que la primera incorpori DNA de l’altre.
Comencem amb soca que produeix 11 Unitats/ml de α-amilasa i 5 unit/ml de proteasa → es fan 3 passos amb DNA de soques diferents (es van posant soques i es lisen perquè la primera incorpori el DNA de les altres) i al final hem obtingut una soca que produeix a 2530 U/mL de α-amilasa i 94 de proteasa 19 CTRIGUERO SISTEMA CRISPR-Cas Un home va descobrir que els procariotes poden tenir immunitat i memòria immunològica. És la mateixa cèl·lula la que va a defensar-se amb certa memòria en front, per exemple, virus.
És un sistema que fa de defensa davant DNA estrany.
Esta compost per: Genoma d’un bacteri amb 2 zones: - Un operó amb gens que s’anomenen Cas = seqüencies associades al CRISPR - Una seqüencia, separada de l’altre, amb una regió que es transcriu però no es tradueix → normalment son palíndroms La zona de repeticions que nomes es transcriu (no es tradueix) = CRISP R Aquestes repeticions són d’uns 30 o 40 nucleotids crRNA → quan es transcriu Quan entra un DNA estrany a la cèl·lula, al entrar, algunes de les proteïnes Cas reconeixen alguns nucleòtids d’aquest genoma víric i quan el reconeixen com estrany el tallen en fragments d’uns 30 nucleòtids. Aquest fragments s’anomenen ESPAIADORS o SEPARADORS. → Les cèl·lules integren aquests fragments en el sistema CRISPR (es queden seqüencies de DNA estany en aquesta regió) i sempre estan entre les repeticions.
La cèl·lula pot tallar el DNA estrany perquè reconeix 3 nucleòtids: els PAM = protospacer adjacent motifs (alguns nucleòtids que estan al costat del espaiador) Sempre que s’integra un fragment, s’integra en el 1r repetidor, (el que esta mes a prop de la seqüencia líder) i ho fa de manera que farà una nova copia de la repetició Sempre hi haurà un fragment integrat i una repetició 20 CTRIGUERO Una vegada integrats tots aquest fragments és quan entra la immunitat o memòria: El transcrit de crRNA es processa i es talla en tants trossos com separadors hi ha.
Altres proteïnes, diferents a les primeres, formen un complex amb els fragments de crRNA Cada fragment s’acomplexa amb les proteïnes Cas i forma un complex Aquest complex actua com a reconeixement de seqüencies: si entra un fag com l’anterior, les proteïnes que s’han fet l’hibriden i degraden el DNA.
Hi ha 3 (ara 5) maneres de fer el RNA Cada espaiador en forma de RNA s’acomplexa en les proteïnes Cas → actua com a reconeixement de seqüències estranyes → s’hibrida i talla el DNA → el degrada i es protegeix.
Resum: Hi ha 2 moments: - Creació de la immunitat amb la integració - Reconeixement de seqüència i degradació del estrany Depenen del tipus de RNA hi ha mes o menys proteïnes i cada proteïna o grup de proteïnes te diferent funció.
21 CTRIGUERO Aplicació a aquest descobriment: Amb aquets sistema, per qualsevol DNA de qualsevol organisme, si en sabem la seqüencia, podem dissenyar un oligonucleòtid complementari i si això esta conjugat a aquets, es tallaria?? ? Podries canviar un gen qualsevol que tu vulguis (Dilema ètic) Per traslladar això al laboratori: El primer pas no ens serveix, el que ens interessa es el 2n pas.
Hi ha 2 dels 5 tipus que només tenen 1 proteïna: El que s’utilitza és el Cas9 → podem clonar-lo i transformar-lo en una cèl·lula perquè produeixi aquesta proteïna o be sintetitzar i donar la proteïna directament Amb el Cpf1 (type 5) també s’està fent.
A part de la proteïna necessitem dissenyar el RNA perquè s’acomplexi amb la proteïna Cas9 .
· Com passa a la natura: crRNA es talla en diferents trossos i necessita una regió transactivadora del crRNA de manera que a cada fragemtn que es genera s’hi ha d’unir el tracrRNA sinó no esta actiu.
Es requereix el transcrRNA perquè s’acomplexi amb cadascun dels crRNA i s’activin i es puguin acomplexar amb la Cas9 per poder funcionar de manera normal.
Per utilitzar-ho a nivell biotecnològic: - Clonar el gen del Cas9 - Clonar el RNA Van dissenyar una seqüencia amb un crRNA (espaiador→ on vulguem actuar) i a continuació un fragment de la zona de repetició amb la part del transcrRNA De manera que quan es transcriu es transcriu tot alhora i obtenim el gRNA (guia) Podem escurçar part de la repetició i part del RNA transactivador 22 CTRIGUERO Que es pot fer utilitzant aquest sistema: A i B: podem causar insercions i delecions i reemplaçaments gracies a aquest sistema C: També podem causar delecions grans i rea ordenaments gènics → això seria utilitzant 2 RNA guies amb la corresponent proteïna → permet unirse a dos llocs diferents del genoma (actues en 2 llocs alhora) i depenen de com ho dissenyis aquest fragment pot ser mes gran o mes curt.
D, E i F: La Cas9 te unida proteïnes diferents - D: Domini d’activació - E: domini efector - F: fluorescent D: Han creat una proteïna de fusió: clonar la proteïna Cas9 i afegir un domini d’activació o inactivació gènica→ quan s’expressa tenim el Cas9 amb el domini afegit Això permet activar o inactivar gens → i activem el lloc que volem Altres aplicacions: E: teràpia gènica: els fragments clonats els tenim dins de virus i el que es fa es injectar a ratolins → expressaran després el que hem clonat (problemes; en alguns casos va funcionar be però en altres va causar tumors) G: modulació epigenètica: modificant el DNA actuar H: Quan el domini que lliguem a la cas9 és una proteïna fluorescents, ens serveix per visualitzar on està aquell gen o aquella regió genòmica.
23 CTRIGUERO Per millorar la producció: TRANSCRIPTÒMICA Ex: es va fer un microorganisme productor de riboflavina Fer metagenomica del mRNA i fer extraccions a diferents temps (en comptes d’extreure DNA, extreuen mRNA) Riboflavina es metabòlit secundari Van agafar mostres de mRNA abans de començar a créixer, a la fase exponencial i a la fase estacionaria Al fina obtens múltiples seqüencies de mRNA → s’han de comparar a la base de dades i veus a que es correspon.
En alguns casos no sabràs a quin gen correspon o quina funció te Ens els 3 temps diferents podem trobar les diferencies que hi ha en quant a seqüencies i en quantitat.
Al final podem tenir una llista on es mostra com augmenta o disminueix.
Tindràs molta info per veure com actuar a nivell de modificació genètica Els que es veu que augmenten, molts d’ells estaran lligats a la producció → S’ha de veure si activant aquests gens augmentarem la producció També podem inactivar els que molesten per la producció 24 CTRIGUERO TEMA 5: FÀBRIQUES CEL·LULARS MICROBIANES De proteïnes heteròlogues =proteïnes que s’estan expressant en un organisme diferent al original.
Sobretot pèptids i proteïnes humanes: Hi ha moltes i el seu ús es molt generalitzat Al principi es feia a partir d’origen animal o plasma humà però PROBLEMES: - És caríssim - La concentració es baixa (és la que hi ha de manera natural) - Purificació difícil, hi ha moltes altres coses.
- Poden haver-hi diferencies i que no es pugui utilitzar en humans.
- Pot haver-hi contaminacions víriques.
Després ja en microorganismes → E.coli - Genètica, fisiologia, bq , etc molt ben coneguda en E.coli - Els bacteris creixen molt ràpid i el cultiu es molt més econòmic.
AVANTATGES EXPRESSIÓ EN E.coli - Sabem manipular perfectament genèticament E.coli - Sabem transferir gens de manera molt eficient - Disposem de molts vectors específics de clonatge i expressió - Facilitat en la recuperació i purificació del producte d’expressió.
INCONVENIENTS: - Introns: els gens Eucariotes tenen Introns, en procariotes no existeixen. Si clonem una proteïna humana, no obtindrem la proteïna que volem perquè el sistema genètic no esta preparat per eliminar introns. → Hem de clonar el cDNA - Nivells baixos d’expressió (transcripció i traducció) pot ser per: o El promotor: hem d’ajustar molt be quin promotor utilitzem perquè s’expressi més aquell gen.
o Ús del codó: La cèl·lula ha de reconèixer els codons amb el tRNA. Depenent de la espècie pot ser que no tingui tots els tRNA i hi ha codons que no els fan servir → pot ser que el cDNA que clonem tingui codons que al ficar-lo en E.coli no els reconeixi. → Solucions:  Manipular el gen clonat i canviar aquell codó pel que ens interessa (s’ha de saber en cada sp quina freqüència d’us de codons té i l’adaptes al millor (normalment amb un canvi de nucleòtid canvies el codó, però seguim tenint el mateix aa))  Clonar el gen que codifica pel tRNA que no te.
o Pèrdua del plasmidi o algun altre vector de clonació: en ocasions entra en competència el fet de voler produir una proteïna que a la cèl·lula no li aporta res o li molesta.
- Modificacions postraduccionals: Les modificacions postraduccionals no son gaire elevades en els bacteris (pot necessitar acilacions, glicosilacions, etc.) - Formació de cossos d’inclusió: Acumula la proteïna formant agregats.
- Secreció: l’ideal és que produeixi aquella proteïna i que després la secreti fora de la cèl·lula. Però normalment l’acumula dins de la cèl·lula o al periplasma.
25 CTRIGUERO SOQUES MUTANTS Les soques que s’utilitzen per produir proteïnes heteròlogues són soques determinades que son mutants →que s’han modificat per no tenir altres problemes com per exemple: - Mutants de sistemes de restricció i modificació - Sistemes de recombinació El que es fa és que el DNA quedi metilat en determinats llocs → modifica el DNA Per altre part produeix uns enzims de restricció que no actua en el propi DNA (perquè està metilat), però si que actuaria en el vector de clonació. Per que això no passi es fan mutants per evitar que degradi el vector de clonatge Recombinació: NO volem que el vector de clonatge es recombini i s’integri al DNA.
El que volem es que es repliqui de manera autònoma i com més copies millor (mes copies mes producció) → Les soques que s’utilitzen ja estan adaptades a aquesta producció TRANSFERENCIA HORITZONTAL D’INFORMACIÓ GENÈTICA 3 mecanismes: - TRANSFORMACIÓ: captar DNA lliure - CONJUGACIO: una cèl·lula donadora te un plasmidi combinatiu i transfereix el plasmidi a una altre cèl·lula (les 2 acaben tenint el plasmidi) - TRANSDUCCIÓ: Utilitzant virus 26 CTRIGUERO VECTORS DE CLONATGE: · PLASMIDIS Depenent del vector de clonatge podem clonar un fragment més o menys gran En els plasmidis es pot arribar a 15 kb La seqüencia del plasmidi sencer és coneguda i també coneixem el mapa de restriccions de qualsevol plasmidi.
Quan fem una clonació i després transformació, volem saber si realment s’ha adquirit aquell fragment o no Per distingir: - Mitjançant ANTIBIÒTICS: si clonem al mig del gen de resistència a la tetraciclina, serà sensible a la tetraciclina.
Si l’han adquirit sense el fragment clonat seran resistents als 2 antibiòtics - Sistema de la X-GAL: Es clona en un gen de la β-galactosidasa → en condicions normals (si adquireix el vector però no el fragment) creixen en x-gal i són blaves→ en un medi de cultiu amb x-gal, quan actua la β-galactosidasa, dona una coloració blanca → si No s’ha conat les colònies son blaves i si Sí que ha clonat son blanques 27 CTRIGUERO · FAG λ Aquí el fragment pot ser una mica mes gran (20kb) Limitacions: Si clonem un gen en un genoma víric, no podem clonar-lo i ja esta, si augmentem la longitud del genoma, després no es podrà ficar dins la càpsida.
Hem de trobar la manera de clonar-lo però sense augmentar la longitud del gen→ es fa SUBSTITUINT: s’elimina la Regió b (no interfereix en la replicació) i la Recombinació (no ens interessa que funcioni com a Fag→ no s’integrarà) Si NO s’ha clonat→ fa un cicle Lisogen Si s’ha clonat, farà un cicle lític perquè li hem eliminat la capacitat d’integrar-se al cromosoma.
Quan es multiplica el virus, anirà produint les proteïnes que volem→ lisa al bacteri i la proteïna quedarà al medi.
Després haurem d’eliminar els virus, però la proteïna ja la tenim fora.
· FAGMIDIS Híbrid entre plasmidi i bacteriòfag 28 CTRIGUERO · COSMIDIS Accepten major quantitat de DNA clonat (fins a 45 kb) La paraula ve de plasmidi i cos =lloc dels virus Són plasmidis que tenen en la seva construcció llocs Cos = llocs que permeten encabir el genoma d’un virus dins de la seva càpsida.
Funciona com un plasmidi normal (també te resistència a antibiòtic) però alhora de transformar in vitro l’hem de encapsular dins de la càpsida d’un virus gracies a aquests llocs Cos Si posem proteïna de virus amb el cosmidi de manera espontània es forma la càpsida al final Es fa una infecció artificial (la càpsida es vírica però el genoma no, és el cosmidi) · BACs (50-300kb) És com un plasmidi gegant i no serveix massa per expressar molt una cosa.
Quan s’utilitzen plasmidi el que és convenient és que tinguem varies còpies, contra més còpies, mes produirem, i amb aquest sistema seria impossible.
29 CTRIGUERO A part de tenir el gen clonat per produir una proteïna, es sol utilitzar una PROTEÏNA DE FUSIÓ PROTEÏNA DE FUSIÓ A part de tenir clonat el gen dissenyem la regió que és codificant El nostre gen d’interès està en algun punt de la regió codificant, però hi ha més parts: - TAG= etiqueta= marcar la proteïna i ajudarà a la purificació. Tant pot estar davant o darrere del gen - Interessa tenir un lloc de reconeixement per a separar entre la part que es tag i la part que es gen - SP= pèptid senyal → ens servirà per a guiar aquesta proteïna de fusió cap a la membrana, espai periplàsmic o al exterior cel·lular.
SP—tag—gen Tall Hem de disposar de llocs de tall: - Si en el gen tenim codificada la Prolina, el Tag hauria d’acabar amb Aspàrtic de manera que a pH àcid puguem tallar l’enllaç - Si volem tallar Trypsina, haurem de tenir Arg o Lys - Etc. (Taula) Hi ha diferents tipus de tag per purificar Ex: Cua d’histidina → s’uneix a Ni en la columna → imidazole per eluir columna 30 CTRIGUERO A part de la purificació també poden ajudar a la secreció i a que NO es degradi la proteïna.
La cel pot reaccionar contra el pèptid estrany degradant-lo i contra més llarg, més difícil és. Amb la proteïna de fusió el fem més gran.
Quan s’ha produït la proteïna de fusió, hem de tenir en compte que hi haurà algunes que es pleguin correctament de manera espontània, però altres necessiten de la ajuda d’altres proteïnes (xaperones) Cada espècie te les seves xaperones i entre eucariotes i procariotes tenen poques similituds → pot ser que no trobem la xaperona que necessitem El mal plegament de proteïnes fa que sigui més probable la formació d’agregats o cossos d’inclusió.
COSSOS INCLUSIÓ Avantatge: - Com ja tenim la proteïna agregada, és més fàcil de purificar Inconvenient: - Si la proteïna la volem com a fàrmac, ens interessa que estigui el més soluble possible perquè estigui biodisponible i es reparteixi be pel torrent sanguini.
Per evitar que es formin els cossos d’inclusió: - De manera preventiva: utilitzant xaperones → sobreexpressar les xaperones pròpies de la cèl·lula → ajudem a que no es formin els agregats.
- O solubilitzar-la després: o Aminoàcids o Polimers o Sucres o Desnaturant o Canvis de pH Una cèl·lula pot tenir cos d’inclusió i ser funcional · SUMO= Small Ubiquitin-like Modifiers → Ubiquitina de baix pes molecular Les ubiqüitines tenen diverses funcions: entre altres coses ajuden a la expressió d’algunes proteïnes i també actuen com a xaperones.
La SUMO és pròpia d’eucariotes, però no existeix en procariotes → Es pot utilitzar la proteïna SUMO en una proteïna de fusió com a prevenció de la formació de cossos d’inclusió Al costat del gen d’interès es posa la SUMO i una cua d’histidina → ho clonem i ho transformem en E.coli → es va veure que millorava la solubilitat i la expressió de les proteïnes 31 CTRIGUERO Quan la proteïna de fusió s’ha produït: Hem d’obtenir de manera aïllada la nostra proteïna Al passar-la per columna de níquel la proteïna de fusió queda lligada a la columna (per la cua d’histidines) Després tractament amb una proteasa que tallen justament en el carboni terminal de la proteïna SUMO → ja tenim el SUMO separat de la nostra proteïna.
La resta del pèptid de fusió està a la columna→ es passa imidazole i s’allibera la resta → així la columna queda regenerada.
INSULINA Primera proteïna heteròloga que es va aconseguir sintetitzar El gen que codifica per la insulina té 3 fragments: Leader, A, B i C (pre-pro-insulina) Insulina= B i A units per ponts disulfur Produïm per una part el pèptid A i per l’altre el pèptid B i després els ajuntem: - En paral·lel tenim 2 cultius→ uns E.coli amb el gen A i uns E.coli amb el B - Quan ja s’ha produït s’ha de separar= es fa amb un tractament de bromur de cianogen.
- Quan ja temin les 2 port purificades→ es barregen les 2 i es fan els ponts disulfur.
Una Alternativa→ simplifica i millora la producció: Es va saber que la insulina es plegava correctament espontàniament i que hi ha proteases que actuen per tallar els fragments que no es volen 32 CTRIGUERO EXPRESSIÓ EN Saccharomyces cerevisiar AVANTATGES: - Coneixem molt bé el metabolisme (domini de les fermentacions) - Major rendiment que E. coli - Facilitat en la recuperació i purificació del producte - Te modificacions postraduccionals més riques que en E. coli - Es secreten al exterior INCONVENIENTS: - La transformació és més difícil en llevats que en bacteris - Hi ha pocs vectors específics de clonatge i expressió per llevats - Introns - Sistema de glicosilació peculiar Exemple: VACUNA DE L’HBV (hepatitis B) S’ha clonat l’antigen de superfície del virus de la Hepatitis B I es produeix en Saccharomyces El virus te càpsida i embolcall → en aquest embolcall és on estan els antígens de superfície Aquest antigen pot formar unes partícules que per dins estan buides Per clonar: Van fer un híbrid entre plasmidi bacterià i el plasmidi propi del Saccharomyces= 2μ Del 2μ es va conservar l’origen de replicació Van clonar l’antigen del gen de la hepatitis B Per veure si s’havia clonat o no, es va utilitzar una soca autòtrofa al triptòfan (sense triptòfan no creix) Van posar gen Triptòfan Nomes creixeran les que tinguin suficients còpies del plasmidi (si no tenen prou copies de plasmidi, tindran poc triptòfan i tampoc creixeran, necessiten molt) Al centrifugar i lisar les cèl·lules podem purificar l’antigen → al final tenim partícules amb agregats de proteïnes (Ag) Millores: Un altre plasmidi que millora la producció: - Canvi de promotor - Canvi de cultiu del llevat Van passar de 25 μg/L a 200μg/L 33 CTRIGUERO ALTRES: Hem parlat de E. coli i Saccharomyces Però hi ha altres microorganismes que s’utilitzen: - Pseudomonas - Bacillus subtilis - Lactoccocus lactis - Streptomyces - Corynebacterium També altres llevats: - Pichia pasotirs - Hansenula polymorpha - Kluyveromyces lactis - Yarrowia lipolytica - Schizosaccharomyces pombe - Arxula adeninivorans Floridures també s’utilitzen: - Aspergillus - Penicillium - Rhizopus - Trichoderma A part també es fa en cultius de línies cel·lulars eucariotes de: - Plantes - Insectes: utilitzen per introduir el vector Baculovirus - Mamífers (s’intenta evitar, perquè se sol treballar amb cels tumorals) A més molts necessiten factors de creixement Sèrum boví fetal (SBF) → problemes de bioseguretat El que si que està tenint èxit són cels d’ovari de hàmster xinés 34 CTRIGUERO TEMA 6 - EL MEDI DE CULTIU INDUSTRIAL Hem de fer cas de la bibliografia.
També Mimetisme biològic= fer el mateix que passa en la vida d’una cèl·lula No es el mateix una cèl·lula bacteriana, que una d’un llevat o floridura.
- Bacteris tenen mes nitrogen, més proteïnes i mes àcids nucleics → els requeriments seran diferents A l’hora de dissenyar un medi de cultiu i pensant en grans volums : - Medis de cultius DEFINITS: o Quina concentració o Quin pH o Etc.
Exemple: Però això per grans volums resulta car→ el preu del producte ha de poder ser car.
- Medis COMPLEXOS: aprofitem el subproducte d’alguna altre industria Nutrients en medis Complexos: o Fonts de carboni:  Sucres: midó, panis (glucosa), melassa (sacarosa) ...
 Olis: vegetals, carn, peix, vegetals...
o Fonts de Nitrogen:  Orgànic: Agricultura  Proteïnes (de la llet o del xerigot)  Industria cervesera: llevat  Subproductes de carn i peix o Sals minerals: Hem de mirar si s’ha de suplementar amb altres sals  Nitrats, fosfats, carbonats i altres.
o Factors de creixement  Vitamines B, aminoacids 35 CTRIGUERO Altres components del medi: - Potser hem de fer un tractament enzimàtic previ per si els nutrients no son fàcilment assimilables → amilases, cel·lulases, proteases → digestió de les molècules mes grans.
- Antiescumejant (olis, polipropilenglicol, silicona) - Si utilitzem olis com a font de carboni→ Emulsionants → perquè s’homogenin be les gotetes - Agents quelants pels metalls tòxics Paràmetres fisicoquímics: El bioreactor i el medi al principi han de ser estèrils - Altes temperatures poden fer que precipitin alguns dels components i no ho volem.
- També pot passar que surtin aminosucres Per evitar-ho → esterilitzar per separat diferents components del medi i després ajuntar-ho - Control de pH - Aeració - Agitació per homogeneïtzar el medi - Pressió - Temps que deixem en funcionament el bioreactor - Pot aparèixer Aigua oxigenada, que el fan els microorganismes, i és tòxic, és un oxidant → es pot afegir al medi catalasa per trencar la molècula.
Quan utilitzem subproductes d’altres industries, aquesta matèria primera la hem de tenir assegurada durant tot l’any - Disponibilitat - Fluctuació del preu - Variabilitat en el medi Normalment en medis no podem extrapolar el que fem al laboratori per després a gran escala→ haurem de fer modificacions.
36 CTRIGUERO TEMES 7 i 8 – BIOREACTOIRS I CANVIS A GRAN ESCALA Paràmetres clau en el canvi d’escala: - Fisiologia microbiana - Cultiu - Transferència del calor - Transferència de massa - Productes · FISIOLOGIA MICROBIANA: - L’inòcul ha de ser entre el 0,1 i el 5% del volum total - Per inocular 150mil litres → haurem d’anar fent escalat i anar augmentat el volum de l’inòcul → fins que puguem inocular el bioreactor - Les poblacions que utilitzem son molt elevades→ hem de tenir cura amb la estabilitat genètica → a major temps de cultiu i a major població→ fa que siguin mes possibles les mutacions espontànies.
- També influeix com es el microorganisme en quant a mida i forma (morfologia) - També hem de conèixer be la cinètica de creixementVeure que el microorganisme sigui viable en tot aquest temps .
· CREIXEMENT Hem de saber la corba de creixement i saber si ens interessa la fase exponencial o la fase estacionaria També hem de tenir en comte que a major concentració de nutrient s’obté més massa, però arriba un moment que es satura i no pot processar tant nutrient → produirà el màxim però per molt nutrient que afegeixi no el farà servir.
A major concentració de substracte, la velocitat de creixement augmenta fins que es satura · CULTIU - Nutrients: característiques (sòlid, líquid..), concentració, solubilitat - Esterilització - Problema si es forma bromera (espuma) → per prevenir-ho com a molt s’utilitza el 70% del volum del bioreactor.
- Control de T, pH, P, DO i temps · TRANSFERÈNCIA DE CALOR: El bioreactor tendeix a augmentar la seva temperatura per: - Reaccions exotèrmiques (el creixement dels microorganismes genera calor) - Si tenim mecanisme d’agitació mecànica, la mateixa agitació genera calor Hem de controlar la temperatura i fer que sigui constant → s’utilitzen sistemes de refrigeració També intervenen els sistemes d’agitació (distribueix la temperatura homogèniament) i els sistemes d’aeració 37 CTRIGUERO · TRASNFERENCAI DE MASSA Fase gasosa: si la cel requereix oxigen, les bombolles d’oxigen han d’estar disponibles per la cel Fase liquida: nutrients i metabòlits Fase sòlida: cels i substrats sòlids (depenent del medi de cultiu) Depèn de: - Geometria del bioreactor - Sistemes de mescla i aeració - Solució del nutrient - Com és el microorganisme - Agent antiescumejant - Temperatura SEGUIMENT BIOREACTOR Per fer seguiment bioreactor→ paràmetres físics químics i biològics Tindrem sondes o preses de mostra per anar seguint el funcionament del bioreactor · Físics imprescindibles: - Temps - Temperatura - Bromera (si es forma massa problema) - Agitació - Bombolles de gas · Químics: - pH - Oxigen dissolt en el cultiu - Nitrogen - Etc.
· Biològic: - Biomassa (alíquotes) - Mirar si va augmentant la terbolesa (monitoritzat per DO) → el cultiu ha de ser prou transparent - Viabilitat de cèl·lules - Taxa de consum d’oxigen - Taxa de producció de CO2 - Veure quant DNA, proteïnes, RNA, hi ha (conforme creix la població, creixerà tot ) PRODUCTES - Concentració esperada - Rendiment - Estabilitat - Recollida - Qualitat (purificació) 38 CTRIGUERO BIOREACTORS 2 tipus: - Verticals = Tancs d’agitació - Horitzontals = tubulars En els tubulars podem tenir les diferents fases del creixement Depenent del flux i la llargada, el temps que circula d’un costat al altre → al principi tindrem la fase d’adaptació al medi → cap al altre extrem fase exponencial fins fase estacionaria.
La majora de bioreactors son tancs d’agitació. Es distingeixen per la manera d’homogeneïtzar el medi: - Mecànica - Bombolleig - Circulació d’aire Es poden combinar SISTEMES DE CULTIU: com els podem fer funcionar: - Tancat o discontinu: el que més es fa al laboratori→ del inici al final no fem res, ho deixem incubant → gràfica esquerra - Semicontinu: el medi que hi ha inicial no te tots els nutrients, només una part. A intervals de temps diferent, es va introduint més medi de cultiu → el rendiment del cultiu millora (GRAFICA DRETA) → s’aconsegueix més biomassa i més producte.
39 CTRIGUERO - OBERT o CONTINU: es va afegint medi de cultiu tota l’estona El volum es constant, el que no es constant es el flux d’entrada de nutrient.
A la part d’abaix és on més producte hi ha → conforme anem recollint tindrem producte i cèl·lules (recollim el mateix volum que entra) Aquest tipus de cultiu està en FASE EXPONENCIAL sempre! Podem controlar el FLUX → a mes flux mes ràpid estarà funcionant fins que s’arriba a un punt: si va massa ràpid es fa un rentat, ens quedem sens cèl·lules.
S’ha de controlar molt be la velocitat del flux AVANTATGES CULTIU CONTINU: - Podem utilitzar bioreactors de mides mes petites perquè la producció és continua.
- L’equipament de tot també es menor - Disminució dels períodes d’aturada - El producte és més uniforme INCONVENINETS: - No serveix per a producció de metabòlits secundaris perquè estem sempre en fase exponencial - Disminució del rendiment al llarg del temps (es poden perdre els vectors , mutacions..) - Esta mes exposat a les contaminacions - Poden parèixer variacions en el medi de cultiu que disminueixin la productivitat.
40 CTRIGUERO BLOC 2 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL TEMA 2.1 - PLANTES COM A EINA BIOTECNOLOGICA: BIOTEC VEGETAL: Plantes per obtenir algo (fàrmacs, fitofàrmacs) També es una ciència És una tècnica però també te algo de ciència Biotecnologia vegetal te 2 pilars: - Cultiu in vitro - Enginyeria genètica i metabòlica Fitofàrmacs= fàrmacs que procedeixen de les plantes, que estan sintetitzats per les plantes.
Ex: Taxol - Cultiu de arbres Per tractar un pacient de càncer es necessiten molts arbres de 60 anys per obtenir el taxol - Sintesi química: en el cas del taxol es inviable perquè son molts passos de síntesi Producció biotecnològica: no son vies alternatives, poden ser complementaries Reactiu amb cels dintre que produeixen el taxol Obtenció actual: extraure un precursor de les fulles i a partir d’aquí si que es viable fer algunes vies de síntesi química Organismes vius tenen un tipus de metabolisme primari-> reaccions metabòliques que porten al desenvolupament, creixement i reproducció Plantes: per reaccionar amb l’ambient, fan altres reaccions metabòliques = Metabolisme secundari - Defensa - Atraure pol·linitzadors - Combatre estrès (hídric...) Compostos met 2a  3 blocs: - ALCALOIDES - POLIFENOLS - TERPENS La majoria de rutes de met 2a venen de rutes de met 1a.
Els compostos de met 2a tenen una activitat farmacològica que podem utilitzar.
Exemples: - Cemtella asiàtica-> Te centellosidos: Asiaticoside ->cicatritzant, promotors de la síntesi de col·làgens.
(són TERPENS) - Catharanthus roseus-> Vinblastina - ...
Amb biotec s’intenta augmentar la producció del que la planta ja fa.
41 CTRIGUERO SISTEMES DE PRODUCCIO BIOTEC: - Cultius cel·lulars o Suspensió o Immobilitzades - Cultiu d’òrgans: o Arrels  Ginseng  Lignans o Brots o El cultiu de fulles no s’ha aconseguit A més cels més producció -> volem molta biomassa AVANTATGES DELS CULTIUS CEL·LULARS: - Tecnologia no contaminants - No genera residus - Possibilitat de cultivar el producte desitjat en qualsevol part del mon amb un estricte control de la producció i de la qualitat - No es necessari l’us d’herbicides i pesticides - No existeixen problemes climàtics ecològics o geopolítics - Cicles de cultiu de setmanes de duració i no d’anys com en la planta sencera.
CULTIUS DE SUSPENSIONS CEL·LULARS: · INDUCCIÓ DEL CALLO: Branca del arbre -> S’ha d’esterilitzar -> Escollim l’EXPLANT= part de la planta que posaré en cultiu  INDUCCIÓ DE TEIXIT DE “CALLO” Es talla el “callo” i s’aïlla-> van creixent i formen biomassa-> contra mes cels tingui, mes producció hi haurà.
El callo es va tallant i es va cultivant a part per tenir mes biomassa Composicions de Medi de cultiu - Pel taxol: Medi B5 o Gambor - Altres: MS Medi: - - Macronutrients Micronutrients Sacarosa (font de C) Aminoàcids i vitamines (font de N) Reguladores del creixement (auxines i/o citoquinines) o Auxines: una que s’utilitza molt és la 2,4-D perquè permet obtenir els callos FRIABLES = callos on les cels no estan molt compactes, les cels es disgreguen amb facilitat.
Gelificant Callo quan ja te biomassa, el col·loco en un pot en medi líquid en agitació a la foscor -> les cels es van disgregant quedarà una suspensió cel·lular.
Després es pot passar a nivell de bioreactor -> producció industrial del compost que sigui.
42 CTRIGUERO SISTEMES D’OPTIMITZACIÓ DE LA PRODUCCIÓ · SELECCIÓ de línies cel·lulars altament productives: - Selecció de plantes -> s’agafa la mes productiva - Seleccionem el millor explant : es fa en funció de la biomassa-> s’escull l’explant que produeixi més biomassa.
- Selecció dels callos -> mirem quin es el mes productiu - Es fan cèl·lules en suspensió del callo més productiu -> les cels son clòniques i haurien de ser totes igual, però es pot mirar si hi ha algunes millors, també es fa selecció.
· OPTIMITZACIÓ dels medis de creixement i producció · Adició de PRECURSORS biosintètics -> ajudar a la planta (no fa falta que consumeixi les seves fonts de carboni) · Afegir ELICITORS: - Ciclodextrines - Hasmonato? · Estimular la ALLIBERACIÓ del compost d’interès al Medi de cultiu-> si l’eliminen fa que produeixin més.
A vegades el que es fa es fer una Extensió cel·lular i es seleccionen línies cel·lulars altament productives.
ESTIMUL DE LA CAPACITAT: Estratègia per obtenir més producte final Quan la cel sintetitza un compost, arriba un moment que sintetitza i emmagatzema a la vacuola perquè no li sigui tòxica.
En el cultiu in vitro hem estat incrementant la producció -> arribarà un moment que tindrà excés i dona una senyal a un dels precursors i es para el procés = Retroinhibició per producte No ens interessa.
El que es fa és PERMEABILITZAR les membranes: tant la citoplasmàtica com la de la vacuola -> el producte va a la vacuola i passa al medi de cultiu -> la cel no detecta que tingui excés i la síntesi no es para mai.
Avantatge: - Les cels sempre sintetitzen - Es molt mes fàcil extreure el producte d’interès del medi de cultiu.
ÉS un CULTIU CONTINU Quan no es pot permeabilitzar i el producte queda dintre -> s’han de triturar les cels (extracció molt més costosa: es mesclen moltes coses).
Et quedes sense cèl·lules, hauràs de tornar a començar el cultiu.
És un Sistema DISCONTINU Sempre s’intenta fer cultius continus Per fer la Permeabilització: - Mètodes químics o Isopropanol o DMSO o Quitosan 43 CTRIGUERO - Mètodes físics: o Ultrasons o Electroporació (corrent intensa i curta) o Separació ionoforètica (corrent mes baixa però mantinguda) A vegades s’aconsegueix la Alliberació, però sinó haurem de fer cultiu discontinu.
PERQUE SI LES CELS SON CLÒNIQUES POT HAVER-HI DIFERENCIES? - VARIACIÓ SOMACLONAL: el cultiu in vitro porta a que algunes de les cels clòniques pateixin una mutació genòmica. -> a vegades porten a que hi hagi una major o pitjor producció. Per això es fa screening per veure si hi ha algunes que en produeixin més - Canvis FISIOLÒGICS: deguts a la presència en el medi de certs factors. Reverteixen quan es separa el factor inductor del medi - Canvis EPIGENÈTICS: NO reverteixen pel canvi de les condicions del medi. No son deguts a una mutació, sinó a una activació de gens prèviament inactius. Només es trasmeten via mitosis o divisió cel·lular.
- Canvis GENÈTICS o MUTACIÓ (aquí podria estar la variació somaclonal): son canvis estables i eredables via meiosi, via sexual.
OPTIMITZACIÓ A la fase estacionaria és on es dona la màxima producció de metabòlits secundaris Si aconseguim un cultiu on tinguem màxima producció de biomassa i després tenim un medi òptim per la producció´-> tindríem un rendiment màxim.
Això es pot aconseguir amb un CULTIU EN 2 FASES: - Un cultiu de creixement - Un cultiu de producció.
Optimitzem tant el medi de creixement com el medi de producció.
44 CTRIGUERO Per optimitzar els cultius es juga amb: - Nutrients o Minerals-> el que mes pot afectar és:  Relació Carboni- Nitrogen  Límit de Nitrogen i Fosfat (són situacions estressants-> s’activarà la producció de metabòlits secundaris) o Fonts de C (sucres) -> normalment s’utilitza sacarosa. (s’ha de provar quin va millor depenent del cultiu) - Reguladors de creixement o fitohormones (PGRs) o Auxines:  AIA  ANA  2,4-D (molt efectiu en promoure el creixement-> hormona adequada en la primera fase, però no pel cultiu de producció) o Citoquinines Quan volem optimitzar els nivells de hormones, el que fem es fer una combinació -> múltiples assajos fins que tinguem combinació de concentracions optimes pel creixement o òptimes per la producció.
- Factors ambientals-> també afecten al creixement i productivitat o Llum o Temperatura o Agitació Un cop tenim el medi òptim de creixement, altres factors que poden ajudar a la producció son la addició de: - PRECURSORS - ELICITORS · PRECURSORS: Son intermediaris de les rutes metabòliques Contra mes pròxim i menys ramificacions hi hagi entre el precursor i el producte que volem, serà millor.
Contra mes pròxim estigui al producte final serà més complex estructuralment (serà mes car) No ha de ser tòxic per la planta.
El precursor també ens serveix per identificar línies altament productives · ELICITORS: Compostos que indueixen processos de defensa de la planta -> porta a increment de producció de met 2a.
Incrementa la producció de met 2a: - ELICITORS BIÒTICS (són els que més s’utilitzen) o Jasmonato o Metiljasmonato o Quitosano o Ac. Araquidònic - ELICITORS ABIÒTICS: o UV o pH o Estrès osmòtic o Lesions o Metalls pesants 45 CTRIGUERO Quan afegim elicitors s’ha de tenir en compte: - Especificitat del elicitor (no tots els elicitors condueixen a la producció de tots els compostos) - Concentració (s’ha de trobar la concentració òptima) - Temps d’aplicació - Moment de l’aplicació Exemple sikonina S’utilitza en cosmètica i coma cicatritzant Te color vermell FONT NATUAL - Arrel de 5 a 7 anys - Contingut: 1-2% - Cost: 4500$/kg vs PRODUCCIÓ BIOTECNOLÒGICA - 9+14 dies - 0,4 kg/dia - 4000$ /kg Cels en agitació-> compte amb els bioreactors que s’utilitzen, es poden trencar les cels I implica mobilitzar gran quantitat de massa CEL·LULES IMMOBILITZADES: Cels en suspensió-> les immobilitzen per: - MICROENCAPSULACIÓ: les submergeixen en un gel Agents gelificants: o Alginats o Carragenines o Agarosa - ADHESIÓ: Les cels queden adherides a matrius inerts o Espuma de poliuretano o Fibra de vidre hueca AVANTATGES: - Les cels alliberen el compost al medi de cultiu - Es molt mes fàcil addicionar qualsevol compost al medi de cultiu Es important que el compost es produeixi exclusivament en la fase ESTACIONARIA Si es produeix en fase de creixement no podem immobilitzar-les, no creixeran.
AVANTATGES CULTIUS CELS IMMOBILITZADES: - Procés de forma continua (si el producte s’allibera al medi de cultiu) - Permeten fer canvis en el medi i addicionar determinats compostos d’una forma més fàcil.
- La biomassa la podem rejuvenecer per perfusió - El temps que passa entre creixement i producció es curt - Es pot tenir la mateixa productivitat amb menys biomassa (us eficient) - La matriu inert permet que hi hagi contacte entre elles i hi ha diferenciació bioquímica o estructural requerida.
46 CTRIGUERO SISTEMES DE PRODUCCIÓ - Cel·lular o Suspensions o Immobilitzades - Òrgans o Arrels o Borts (parts aèries) CULTIUS D’ORGANS S’ha de tenir present on es sintetitza el compost d’interès Els metabòlits secundaris no sempre s’acumulen al lloc on es produeixen · CULTIUS D’ARRELS Són òrgan molt actiu En alguns casos es requereix una diferenciació d’òrgans i en aquests casos no es poden produir en cultius cel·lulars -> per això es fan cultius d’arrels Tindràs metabòlits que en la planta sencera es sintetitza a la arrel.
Alguns dels compostos que es sintetitzen a les arrels es pot fer també per cultius cel·lulars, però hi ha alguns que no.
Arrels normals creixen molt lentament Si afegim Auxines creixen més, però disminueix la productivitat de compostos 2a Quan la plana es infectada per Agrobacterium rhizogenes -> es produeix la formació de moltes arrels = Síndrome de les arrels en cabellera.
Agrobacterium rhizogenes -> Plàsmid Ri (inductor d’arrels): te part de DNA que es transfereix a la cel vegetal (T-DNA) Al T-DNA del bacteri hi ha gens implicats en la síntesi de Auxines Gens: iaaM i iaaH Hi ha altres gens : ROL A, B o C - rolA: incrementa la sensibilitat de les cels a auxina -> amb menor quantitat d’auxines, tindrem major efecte.
- rolB: codifica un enzim implicat en la hidròlisi de conjugats de Auxines. (formes conjugades son formes de reserva o de transport-> son formes inactives i només quan s’hidrolitzen son actives) - rolC: actua sobre la hidròlisi de conjugats de citoquinines: sempre hi ha d’haver un balanç entre auxines i citoquinines.
Podem tenir ARRELS TRANSFORMADES que podran créixer en un medi sense adició d’hormones.
A partir d’aquí s’han de fer clons, aïllar-los i seleccionar-los per la seva producció i creixement.
Un cop tenim els clons seleccionats -> Optimitzar els medis de cultiu perquè siguin els mes productiu possible: - Factors extern: temperatura, llum i agitació - Nutrients, font de C, N - NO hormones (ja creixen sense necessitat d’hormones) - Podem afegir precursors i elicitors.
47 CTRIGUERO El que ens interessa és que el compost s’excreti al medi -> considerarem la addició de substancies permeabilitzants.
Un cop tenim optimitzat podem passar a Escalar en bioreactors.
AVANTATGES DELS CULTIUS D’ARRELS TRANSFORMADES - Ràpid creixement en medis sense fitohormones - Reproductibles i predictibles a nivells de producte no alterat químicament - Estabilitat genètica durant períodes de cultiu perllongats - Cultiu a gran escala sense pèrdua de la capacitat biosintètica.
TEMA 2.2 – ESCALAT EN BIOREACTORS ESCALAT EN BIOREACTORS: S’han de regular diferents condicions Els paràmetres que controlem son els mateixos que en bioreactors microbians però seran de valors diferents - Agitació: 100 rmp - Aireació -> Pressió parcial d’oxigen: 50% O2 - Temperatura: 25 ºC - Espuma - pH: 5,6-5,8 DIFERENCIA CULTIUS MICROBIANS – CULTIUS CELS VEGETALS 48 CTRIGUERO CULTIU EN BIOREACTORS: · ADAPTACIONS PER CÈL·LULES No podem fer agitació mecànica amb pala perquè es trenquen les cels Amb moltes pales, hèlix o raqueta hi ha menys dany però seguiran trencant les cels Es fa Agitació per Aire: - Columna de borboteig: Problema: quan son molt grans, la pressió d’aire que s’ha d’exercir es molt gran i poden arribar a danyar les cels - Airlift: hi ha 2 tubs Al tub intern es on estan les cels L’aire puja per fora i baixa per dins -> es produeix aeració però no s’exerceix tota la pressió sobre les cels i no les danya.
Bioreactors tipo wave: bossa amb moviment de vaiven ESCALAT: Comencem en bioreactor petit i després passem a mes gran El que s’ha de considerar es la relació altura/diàmetre - Agitació mecànica interessa relació altura diàmetre baixa - Agitació Airlift: interessa relació altura/diàmetre elevada ADAPTACIÓ DELS BIOREACTORIS AL CULTIU D’ARRELS Inconvenients: Arrels creixen amb .... -> si l’arrel es trenca nomes creixerà la part qe te ...? S’ha de protegir > es separa el sistema d’agitació del espai on esta al cultiu Arrels tenen gravitisme positiu-> han de tenir un punt d’anclatge Sistemes de immobilització - Immobilització en espuma de poliuretà - Immobilització en una malla-> Sistema de goteig Spray-bioreactor: que les arrels estiguin humides i alhora aportar nutrients Tmb s’ha de considerar el moment de la sembra en el bioreactor: S’ha de mantenir la esterilitat! Hi ha sistemes per evitar que es contamini - Sistemes de sembra: o Precultiu o Transport o Carga - Encaixar columna de barboteig a un bioreactor mes gran 49 CTRIGUERO SISTEMES DE PRODUCCIÓ INDUSTRIAL - Sistema discontinu Sistema continu SISTEMA DISCONTINU: tinc en un bioreactor les cels o arrels, creixen i produeixen -> extrec tota la biomassa i a part de la biomassa faig una extracció per tenir el compost d’interès i tornes a començar SISTEMA CONTINU: no s’ha de parar el cultiu, es va introduint medi nou i recupero el medi on estarà el compost d’interès-> Això implica que el producte s’ha d’excretar al medi de cultiu.
Podem tenir compostos que de forma natural ja es van alliberant al medi de cultiu o bé si no s’alliberen es pot afegir un agent permeabilitzant.
- Els que s’alliberen de forma natural: els que en condicions de planta sencera, tendeixen a alliberar-se al espai extracel·lular per evitar la toxicitat - Els que van a vacuola no s’alliberaran de manera natural. -> haurem de permabilitzar la membrana plasmàtica i la membrana vacuolar. (no sempre es pot aconseguir) Si el compost es va alliberant al medi, hi haurà un moment que el medi es satura i es deixa d’alliberar el compost d’interès Per solucionar-ho: posar al medi de cultiu substancies que siguin capaces d’absorbir el metabòlit = Resines d’intercanvi iònic (AMBERLITA) En cultius cel·lulars s’ha de tenir en compte la SINCRONITZACIÓ de les cels: quan arribem al màxim de la fase exponencial, en la fase estacionaria, es quan es comença la producció.
En un cultiu de cels no totes les cels estaran en la mateixa fase cel·lular -> si arribem a la fase estacionaria amb totes les cels alhora, tindre màxim de producció.
Per sincronitzar: afegir una droga (AFIDICOLINA) -> para el cicle cel·lular al inici de la Fase S (fase on es produeix la duplicació del material) -> Totes les cels les tindrem en fases G1 o G2 Quan afegeixo més nutrients, totes les cels entren en un creixement alhora - > totes arribaran al màxim alhora.
Sincronització important en els cultius en 2 FASES CULTIU DE 2 FASES A ESCALA INDUSTRIAL - - - Tanc de creixement -> cels creixen-> quan arribem al màxim, part es transfereixen a un tanc de filtrat Tanc de filtrat -> es filtren i s’elimina el medi de cultiu i s’afegeix el medi de producció Tanc de producció: Medi optimitzat per la producció del compost d’interès.
El compost s’anirà secretant a medi de cultiu.
50 CTRIGUERO Diferencies entre cultiu de cels en suspensió i d’arrels transformades RESUM SEQÜÈNCIA D’ETAPES REQUERIDES PER OPTIMITZAR LA PRODUCCIÓ DE MET 2a (Tema 2.3 no ho fem) 51 CTRIGUERO TEMA 2.4 – ENGINYERIA METABÒLICA ENGINYERIA METABÒLICA DE PLANTES: Modificar rutes metabòliques que ja es donen en la planta No confondre amb: PRODUCCIÓ DE PROT RECOMBINANTS EN PLANTES: normalment es humana en una planta produir una proteïna que Redireccionem reaccions enzimàtiques que es donen en la planta i que porten als compostos d’interès -> es fa sempre per millorar la producció de compostos d’interès.
També podem regular la degradació de compostos (si faig que es degradi menys, estic incrementant la concentració del compost d’interès) També es pot produir nous compostos en un organisme Manipulació de les rutes metabòliques: S’ha de tenir en compte diferents aspectes: - S’ha de conèixer les rutes metabòliques secundaries. Son molt ramificades, molt complexes i conèixerles bé es saber tots els intermediaris, enzims, especificitat dels enzims, compartimentació.
Si no es coneix tot això no es podrà canviar la ruta.
S’ha de saber on s’ha d’acumular el compost.
Aquest aspecte limita el poder aplicar tècniques d’enginyeria genètica per produir determinats compostos, perquè no se sap tot - S’ha de conèixer la funció que tenen els metabòlits secundaris en la planta -> la funció condiciona la expressió dels gens que codifiquen pels enzims.
Sabem que els metabòlits secundaris son per relacionar-se amb l’entorn, nomes els produeix en determinades situacions.
- Clonació dels gens.
OBJECTIUS DE LA ENGINYERIA METABÒLICA Molt variats - Plantes mes tolerants a patògens, insectes, etc.
- Incrementar la producció de compostos que tinguin interès en farmàcia o Augmentar nivells de fotoquímics: drogues, saboritzants, ....
o Produir-los en una espècie vegetal que no els produïa.
- Us alimentari-> incrementar la producció de compostos que tinguin efecte beneficiós per la salut (vitamines, etc.) 52 CTRIGUERO FACTORS QUE CONTROLEN EL FLUX DE CARBONI FINS EL PRODUCTE D’INTERÉS EN UNA RUTA METABÒLICA Modificar als fluxes metabòlics en una ruta metabòlica Producte d’interès: $ Estratègies generals per manipular les vies metabòliques: - Pot haver-hi una etapa flux-limitant -> s’acumularà un intermediari i no aconseguirem el producte final Podem sobreexpresar els enzims limitants de flux -> més enzim i la etapa es donarà en major proporció - Les rutes metabòliques secundaries son ramificades-> pot ser que en alguns casos hi hagi processos de retroinhibició (M o E inhibeix l’enzim que produiex K) i al final no es produeix.
El que es pot fer és introduir gens que siguin similars al precursor de K, però que siguin insensibles a la retroinhibició - Inhibir la expressió de determinats gens que estiguin implicats en la degradació o catabolisme del producte d’interès. -> s’acumularà mes producte d’interès També hi ha rutes competitives-> bloqueig de rutes competitives perquè el flux metabòlic es dirigeixi al compost d’interès.
- Per inhibir rutes: bloquejat amb gens antisentit, CRIPR-Cas, etc.
53 CTRIGUERO MÈTODES TRANSFORMACIÓ · BOMBARDEIX AMB MICROPARTÍCULES Partícules d’or envoltades amb DNA que disparem sobre un teixit vegetal provocant porus molt petits que no ens alteren les cèl·lules (no perden viabilitat) Pot utilitzar-se en moltes espècies (qualsevol tipus de teixit) Les partícules han de travessar també la membrana nuclear per arribar al nucli i això passa pocs cops bé.
S’ha utilitzat en transgènics -> Blat de moro Bt (Bioinsecticida)  Catalunya i Aragó en són pioners.
Els microprojectils es disparen amb pistola de gens o canó de gens per mitjà d’heli comprimit sobre el teixit vegetal que serà col·locat a diferents distàncies depenent de la seva duresa · VECTORS NATURALS: Per mitja de Agrobacterium tumefaciens (També es possible amb A. rhizogenes) es substitueix el seu T-DNA pel T-DNA que ens interessa És un Gram+ del terra que infecta naturalment les plantes causant protuberàncies = SÍNDROME AGALLA EN CORONA El tumor segueix creixent encara que eliminem A. tumefaciens això vol dir que s’ha transferit algo de la cèl·lula vegetal.
El plasmid Ti (inductor de tumor)-> fragment de DNA que es transmet i s’incerta en el genoma de la cèl·lula vegetal (t-DNA) El tumor es produeix perquè en el Plasmid Ti tenim el T-DNA, que es transfereix > Està delimitat per fragments de 25 pb repetitius que s’anomenen SEQÜÈNCIES BORDE (LB i RB) i s’incerirà en la cèl·lula vegetal.
També hi ha els GENS VIR que regulen el procés de transferència tot i que NO entren en el genoma.
T-DNA: Tenim gens que codifiquen síntesi d’AUXINES i CITOQUININES  Divisió i extensió de les cels amb formació de teixit diferenciat.
GENS VIR: A-G gens implicats en la transferència Estan en un Operó (Operó Vir): Vir A i Vir G Tenen una expressió constitutiva (Encara que no infecti aquests gens s’expressen) La resta fe Gens Vir són induïbles-> Nomes s’expressen quan infectem (en presencia d’hoste) Vir A i Vir G: regulen l’expressió de la resta de gens Vir.
Quan Agrobacteruim infecta la planta, s’alliberen substàncies fenòliques (Acetosyringona) per protegir-se  seran rebuts com a senyal pel gen Vir A (la seva proteïna) en la membrana bacteriana.
Vir A te un domini quinasa a l’interior de la membrana i s’autofosforila i fosforilarà al Vir G quedant activada la seva expressió Vir G activat serà l’activador transcripcional de la resta de gens vir Quan tots els gens vir s’activen, s’escindirà el T-DNA de la resta del plàsmid i es transferirà en la cèl·lula vegetal i finalment circularà pel citoplasma fins al nucli (els ajudaran gens Chv per reconeixement de la senyal 54 CTRIGUERO GENS VIR: - Vir D2: endonucleasa que reconeix les seqüencies BORDE, que separa el T-DNA i s’uneix a l’extem 5’ d’aquest de forma cvoalent -> es qeudarà fins que s’incorpori al nucli de la cèl·lula vegetal  Protecció en front hexonucleases) - Vir D1: Helicasa per tallar i separar el T-DNA - Vir E2: S’uneix a la cadena de T-DNA i l’envolta durant el procés de transferència per protegir-lo.  COMPLEX T - Vir B1 i altres (B11 i D4): Formen túnel o proteïna transportadors que permet la transferència del DNA entre cèl·lules  COMPLEX T que arriba a la cèl·lula vegetal protegir enfront hexonucleases.
Vir D2 i Vir E2 reconeixen proteïnes vegetals que són de transport (senyalització nuclear) i permet l’arribada del T-DNA al nucli T- DNA - Gens Auxines i Citoquinines = creixement autònom - Localitzat entre LB i RB (seqüencies borde) - El podem substituir per el Gen d’interès que estigui contingut entre els gens borde i seran establement inserits i transferits - Marcador de selecció -> indicarà si la cèl·lula esta transformada o no.
El plàsmid Ti és molt gran i difícil de controlar. S’han dissenyar plasmidis més petitis amb els que poguem treballar en el laboratori Vectors: - BINARIS: tenen 2 plasmids El Ti està desarmat, sense gens oncogènics (auxines...) -> Els gens vir estaran en un altre plàsmid - COINTEGRATIUS: Tenen gens Vir + seqüencies borde El sistema Binari es el més utilitzat perquè els plasmids són mes petits En els vectors Binaris tenim: - Plasmid amb gens vir - Plasmid Ti d’Agrobacterium (només amb sequencies borde) que té un MCS (Multiple cloning side) + DNA cromosòmic que serà amb el queinfectarem la planta.
55 CTRIGUERO GEN D’INTERÈS A INTRODUIR = TRANSGEN: Un gen consta de 3 parts: - Promotor - Regio codificant - Terminador Promotor: Regula la expressió del gen Determina on, quan i en quina quantitat s’expressarà el gen.
El mòdul d’expressió, que son aquestes 3 parts, es poden obtenir per separat, poden tenir orígens diferents.
EXEMPLE: - REGIÓ CODIFICADORA: por provenir d’un gen vegetal /bacterià - PROMOTOR: por venir d’un gen de vrus vegetal - TERMINADOR: pot venir de qualsevol lloc Sobretot jugarem a canviar els 2 primers A més del gen d’interès amb el promotor i el terminador, tmb afegiré al T-DNA un gen marcador per poder seleccionar les cels que realment s’han transformat.
Gens marcadors son gens que codifiquen una substancia o una proteïna que permet a les cels vegetals viure enfront un agent selectiu (un antibiòtic o un herbicida) Exemples de Resistencies: - A Kanamicina - A higromicina - A metotrexat - A basta (herbicida) EXPRESSIÓ GENÈTICA PROGRAMADA El Promotor regula la expressió del gen La expressió genètica està programada No totes les cels realitzen els mateixos processos -> expressió especifica d’uns gens determinats en cada tipus cel·lular.
La programació de la expressió depèn del promotor Tenim: - Promotors CONSTITUTIUS: el gen que esta sota el control d’aqueus promotors, s’expressarà SEMPRE En plantes no hi ha - NO CONSTITUTIUS: o ESPECÍFICS de determinats teixits o òrgans. (exemple: gen per la fotosíntesi-> nomes en fulles) o Específics que nomes esta en certs ESTADIS DE DESENVOLUPAMENT de la planta (ex: durant la maduració del fruit, flors...) o INDUIBLES: nomes s’expressen en unes condicions determinades. Aquí estan molts dels gens del metabolisme secundari Per expressar de forma constitutiva un gen en una planta-> s’ha de recórrer a gens que no son de plantes: - 35SCaMV: del virus del mosaic de la coliflor - O de Agrobacterium: promotors nos i ocs (síntesi de opines) 56 CTRIGUERO PROMOTORS INDUÏBLES: Interessa utilitzar-los nomes quan la planta ja s’ha desenvolupat Hi ha 2 tipus: - Sistemes derivats de plantes: promotors de gens que responen a determinades senyals ambientals o be responen a diferents estats de desenvolupament - No derivats de plantes: Són independents dels processos normals de la planta, necessitant aplicació de substàncies específiques que indueixin la expressió Sistemes derivats de plantes: Elements CIS -> Fan que la DNA polimerasa sigui mes o menys activa Perquè els elements CIS siguin actius es necessari que s’uneixin Factors de transcripció = proteïnes nuclears que s’uneixen als elements CIS i els activen -> això fa que es reguli la activitat de la DNA polimerasa i s’activi o es reprimeixi la activitat del gen Sistemes NO derivats de plantes: Són independents dels processos normals de la planta Son promotors que es basen en utilitzar el promotor 35S i modificarlo afegint-li un lloc d’unió a un factor de transcripció (es bloqueja el receptor del promotor 35S) El gen es transfereix a la pantà però no s’expressa. Nomes s’expressarà quan el promotor sigui actiu, i nomes s’activarà quan el factor de transcripció s’uneixi al element que hem afegit Això passarà quan es tracta amb etanol (induïbles per alcohol) o bé Esteroide o Coure (Induïbles per esteroide o coure) Requereix la adició d’una substancia externa Característiques requerides: - No ha d’haver expressió de la transgen en absència del inductor - Que sigui específic a etanol i no respongui a qualsevol alcohol - La inducció es doni ràpidament després de la aplicació del inductor - Que es pari ràpidament quan es retira l’agent inductor - El inductor no ha de ser tòxic - El inductor no ha de modificar l’expressió de ningun altre gen en la planta.
Abans de introduir un gen en la planta tmb hem de tenir en compte la COMPARTIMENTACIÓ DE LES PROTEÏNES: Que una proteïna vagi a un lloc o altre ve determinada per seqüencies d’aa especifiques de la mateix proteïna Poden anar: - Via de secreció: localització co-traduccional - Nucli - Altres orgànuls: plasts, meroxisoma, mitocondria.
57 CTRIGUERO SI vull que la meva proteïna vagi a plast haure d’afegir una seqüencia de transit en l’extrem amino que dirigiran la proteïna cap a on jo vull (es pot ficar per exemple el gen de la subunitat petita de la rubisco perquè se que experimenta aquets procés) REGENERACIÓ DE LA PLANTA TRANSGÈNICA - Transformació per Agrobactrium o per Biolística Per que es desenvolupi teixit de callo i es regeneri nova planta -> s’afegeixen aux i cit S’ha de posar tmb un agent de selecció (kanamicina, basta... depenent del gen marcador que hagi utilitzat) Formació de brots aeris (amb mes medi amb cit) -> quan ja tinc part aèria ho passes a un altre medi i poses aux perquè surtin les arrels A mes s’ha d’afegir un antibiòtic: Cefotaxima o Claforan perquè no creixin els Agrobactrium un cop han infectat la planta Factors que controlen el flux de carboni..
Si inhibim procés de catabolisme o el pas que porta a una ruta competitiva, s’incrementa la quantitat de producte d’interès.
En aquest cas el que fem es SILENCIAR un gen endogen de la planta Si utilitzem tecnologia ANTISENTIT-> quan es transcrigui produirà una hebra de mRNA complementaria al mRNA endogen-> es formarà un RNA de doble cadena -> no podrà donar proteïnes, es degradarà, donarà microRNA Els microRNA s’uniran als de cadena senzilla i encara es silenciarà més.
L’altre manera d’incrementar els nivells de producte d’interès era incrementant els enzims limitant de flux Podem sobreexpressar el gen però hi haurà alguns problemes, perquè les rutes metabòliques secundaries son complexes i potser afecta altres rutes Quan s’utilitza la sobreexpressio d’un únic gen, el que es fa es utilitzar gens heteròlegs (d’una altre sp vegetal) per que no porti a fenomen de silenciament o supressió Ex: producció de escopolamina En Atropa belladona te 0,3% d’alcaloides. Si li poses H6H es forma molta més escopolamina.
FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ: Tots els gens que porten a la síntesi d’un determinat compost secundari, es donen en situacions determinades.
Tots els gens implicats en las síntesi d’aquell compost es donaran quan es doni la situació-> els seus promotors tindran elements CIS molt semblant o comuns.
Als elements CIS s’uniran els mateixos factors transcripcionals. Si conec els factors transcripcionals, sobreexpressant aquest factors podré activar tots els gens de la ruta encara que no els conegui.
La sopbreexpressio de factors transcripcionals podria ser una solució pels gens que son desconeguts.
58 CTRIGUERO BIOSÍNTESI DE FLAVONOIDES Son polifenols-> tenen activitat antioxidant (major contra mes grups OH tenen a la molècula) Son de biosíntesi mixta-> intervenen 2 rutes biosintètiques Condensació de 3 molècules de Malonil-CoA (ruta de...? )amb 1 de Cumaroi-CoA (ruta fenilpropanol) -> es formes les Chalcones -> Flavanones -> Digidroflavonols -> poden formar-se Flavonols o Antoccianines i tensn condensats Hi ha 4 enzims implicats: CHS, CHI, F3H, FLS Els Flavonols s’acumulen a la pell dels fruits (incrementen a mesura que madura el fruit) Per incrementar els nivells de flavonoides: estudiar si esta relacionat amb la expressió dels gens que codifiquen els 4 enzims que estan implicats.
L’enzim CHI (xalcona isomerasa) és el que limita -> si augmentem aquest gen, augmentar al producció de favonols Es fa amb un gen heteròleg CHI de petúnia L’objectiu seria incrementar els flavonoides en la polpa o pericarpi del fruit i no nomes a la pell.
La expressió dels 4 gens son indetectables en el pericarpi Per produir flavonols al pericarpi, hauríem d’expressar els 4 gens (cada un amb el seu promotor i el terminador - Promotor 35S = Constitutiu - Promotor PE8: induïble -> s’expressa nomes en fruits i durant la maduració.
S’alternen promotors constitutius amb induïbles perquè ens interessa que el compost s’acumuli nomes al fruit, nomes on la planta els acumula normalment. (a mes es la part que s’utilitza en alimentació) SI tens molts cops la mateixa seq repetida en un fragment curt, la probabilitat de que es produeixin processo de silensiament son mes elevades.
Per això es convenient utilitzar promotors diferents.
Gens Lc i C1 codifiquen per factors transcripcionals que activen la ruta de tots aquets gens -> podré tenir acumulació de flavonols en tot el fruit 59 CTRIGUERO ANTOCIANINES i ANTOCIANIDINES Son les responsables dels colors vermells dels fruits Son antioxidants.
La ruta era la mateixa però a partir del Dihidroflavonol actuen 2 enzims més.
Es el mateix però seria amb 5 enzims Si introdueixo 2 factors transcripcionals sota el promotor E8 -> hi haurà canvi de color.
BIOSÍNTSESI DE CAROTENOIDES Alguns tenen activitat antioxidant El beta-carotè es la pro-Vit A Son tetraterpens (40C) Es sintetitzen al cloroplast per la via del MEV? A partir de GGPP -> es dimeritza -> es forma fitoé= precursor de tots els tetraterpens Fitoè-> Licopè (responsable color vermell) -> Es cicla als extrems i es formen els Carotens (depenent de la ciclasa que actua tenim diferents carotens) Beta-Caroté-> pro-Vit A Xantines: color groc Arròs daurat-> arròs que conte beta-carotè Partint de GGPP tenim 4 enzims Hi ha un enzim bacterià crt1 que passa directament de fitoè a licopè (fa lo de les dos desaturases) Promotor específic de llavors: Gt1p A aphIV és un marcador Es posa un fragment entre el promotor i el crt1: pèptid de transit a cloroplast (Tp).
El gen crt1 es d’origen bacterià i no tenen una senyal de direccionalment que ho porti al cloroplast, l’haure d’afegir jo.
Utilitzant aquesta estratègia no s’obté gaire concentració de beta-carotè en l’arros.
Es fa sense el lys: S’introdueix nomes el Psy i el crt1 i SSU(pèptid de transit a cloroplasts) Psy de narciso-> 6microg/g Canviar algun dels gens per veure Es porben psy de diferents especies vegetals -> en el cas d’arròs i blat s’obtenen resultats semblant. Com arròs es el propi, s’utilitza blat per que sigui heteròleg Acumulen molt mes beta-carotè: 31 micrograms La enginyeria de carotenoides s’utilitza en altres.
Hi ha altres gens del erwinia que ens permet saltar-nos passos de la ruta biosintetica 60 CTRIGUERO Ex: en llavors de Colza-> gen crtB de bacteris + pèptid de transit Contingut de beta carote eleva 330 vegades més Tmb en patata Amb un sol gen bateria aconseguim incrementar tota la ruta Un altre cas de enginyeria metabòlica de carotenoides: En contes d’activar la biosíntesi, inactivant la degradació o una ruta metabòlica competitiva.
Depenent de la ciclasa que actuï es forma el beta-carote o un altre Una manera d’incrementar el betacarote seria inhibir el LCY-e Seria posant el LYC-e en antisentit -> es formarà el complementari-> mRNA de doble cadena, es degradarà.
Zeaxantina en patata: S’acumulen xantofil·les perquè inhibim un enzims que esta implicat en el catabolisme TEMA 2.5 – PRODUCCIO DE PROTEÏNES TERAPÈUTIQUES EN PLANTES 3a generació de transgènics: plantes productores de proteïnes, compostos que beneficien en la salut..
(benefici pel consumidor) Produir una proteïna determinada Hem de conèixer el gen que codifica per la proteïna Ha de ser proteïna humà Poden ser vacunes, reactius de diagnòstic o medicaments Es fa perquè hi ha gran demanda de proteïnes recombinant a escala industrial.
Les proteïnes recombinant actualment: - Es produeixen en cultius de bacteris, llevats (43%) - Insectes - Mamífers (57%) Inconvenients: - Cost (infraestructures, etc.) - Escalabilitat - Seguretat Com alternativa-> la planta com a plataforma per produir-> PLANTA COM BIOFACTORIA AVANTATGES: - Escala a nivell agrícola-> menys cost - No hi ha risc de contaminació amb endotoxines o patògens humans - Plantes son cels eucariotes-> poden fer modificacions post-traduccionals (glucosilacions similars a les de mamífers i es poden polimeritzar les proteïnes polimèriques) 61 CTRIGUERO SISTEMES DE PRODUCCIO DE PROTEÏNES Criteris: - Biològic: s’ha de produir la proteïna activa i en quantitat suficient com per que sigui rentable - Econòmic: cost total i el temps que porta portar-ho a mercat, entre altres coses.
Aspectes més importants: - Nivell d’expressió: plantes poc - Secreció possible - Modificacions post-traduccionals: si en plantes, no en bacteris o Glucosilacions: si en plantes o Plegament de els proteïnes: en bacteris i llevats s’ha de fer despres de la purificació o Unió de prot multimeriques: es pot donar en plantes - Riscos de contaminació per patògens: molts pocs riscos en plantes.
- Temps de producció: mes ràpid que eucariotes - Cost: mes baix q en cels animals PRODUCTES FARMACÈUTICS PRODUITS EN PLANTES - Vacunes Ac Algunes proteïnes terapèutiques i intermediaris o Substitutius de sang o Proteïnes pel tractament de malalties PLATAFORMES I TECNOLOGIES Plataformes: - Cultiu de cèl·lules o òrgans: bioreactors amb un medi de cultiu definit - Plantes senceres: sòl o cultiu hidropònics (hivernacles per confinament) Tecnologies: - Transformació estable: Agrobacterium, o per biolística - Transformació transitòria: bactèria, virus o vectors híbrids - Transformació de cloroplasts ASPECTES CRÍTICS: - Glucosilació: no sempre es idèntica en plantes i mamífers, però hi ha mecanismes per modificar-ho.
Temps: optimització del esquema de producció DSP: etapes de processament de la proteïna per extreure-la i purificar-la del cultiu Rendiment: Per considerar que el sistema es competitiu front els altres, hem d’arribar a com a mínim 1% de proteïna soluble total ESTRATÈGIES “BIOPHARMING” - Planta sencera-> gran quantitat de proteïna, però hi ha problemes de conservació Ex: tabac, alfalfa - Expressió especifica en teixit -> utilitzem llavors o tubercles (òrgans de reserva) de per si ja acumulen gran quantitat de proteïnes estables -> s’emmagatzemen les proteïnes durant llargs períodes de temps 62 CTRIGUERO COMPARTIMENTACIÓ: Hi ha senyals que envien les proteïnes a diferents compartiments Es important per la glucosilació de les proteïnes -> nomes es fa a uns compartiments determinats: - Reticle endoplasmàtic - Golgi - Vacuola Les proteïnes que van a RE segueixen via Co-traduccional -> quan es van sintetitzant, es van quedant al interior del RE Del RE per vesícules va al golgi i a vacuoles Tot esta direccionat per senyals d’aa - - Via per defecte o Default pathway: si no tenen res mes o Modificacions post-traduccionals o Arribaran al exterior (paret) Si tenen un tag de HDEL -> queden retingudes al RE Si tenen un seqüencia senyal per anar a la vacuola, aniran a la vacuola IMPACTE GLUCOSILACIÓ: - Afecta a la estabilitat de la proteïna - Direccionalment subcellular - Immunogenicitat - Farmacocinètica - Activitat biològica Estrategies per controlar glucosilació: - Localització subcel·lular : per prevenir la adició de sucres no desitjat - Glucoenginyeria: evitar que s’addicionin sucres vegetals o reemplaçar els sucres vegetals per altres.
GLUCOSILACIÓ: La glucosilació comença al RE Quan apareix una Asn, al extrem amino s’afegeix un N-oligosacarid RE: actuen 2 glucosidases i una monosidasa que treuen les glucoses del final i una manosa Passa al Golgi: actuen manosidases i treuen 3 mannoses més Fins aquí igual animals i plantes En el cas d’animals: - S’afegeixen galactosa i acid sialicopor Plantes: S’afegeixen xilosa i fucosa En llavors es formen cossos proteics i la glicosilació queda com en els animals Dirigint les proteïnes recombinants al RE utilitzant la etiqueta del tetrapèptid KDEL i derivats similars, s’evita la addició de oligosacàrids de tipus complex al aparell de Golgi, assegurant que totes les proteïnes que s’expressin amb oligosacàrids rics en manosa, comuns en tots els eucariotes 63 CTRIGUERO PLANTES PRODUCTORES DE PROTEÏNES TERAPEUTIQUES GLUCOCEREBROSIDASA Es un enzim lisosomal-> la seva deficiència provoca malaltia rara: Malaltia de Gaucher L’enzim s’obtenia a partir de placenta humana -> medicament mes car que existia al mercat Actualment es fa en cultius de pastanaga: S’ha aconseguit que la proteïna sigui extremadament activa si es produeix a la vacuola.
Acumulació a la Vacuola: Els N- oligosacàrids de tipus manosa promouen interaccions amb macròfags Si es fa amb cels de mamífers, els oligosacàrids tenen àcid siàlic que interfereixen en la interacció amb els macròfags. S’ha d’eliminar l’àcid siàlic i encareix el procés Producció en plantes: 1r: introduir vector en el que tinguem la construcció amb les diferents parts: - Regió codificant que ens porti a la proteïna d’interès - Control d’un promotor. Pot ser constituïu -> 35S - Fragments que activen la expressió dels gens (TMV) - Pèptid senyal que la porti al RE - Volem que vagi a vacuoles-> senyal de direccionalment a vacuola - Terminador 2n: Expressió de glucocerebrosidasa amb glucosilació de plantes Avantatges: - no necessita posteriors modificacions - No risc de virus - Plataforma fàcil d’escalar VACUNES ORALS Vacunes: - Cepas de virus o bacteris vius, atenuats o inactius - Parts aïllades o simples proteïnes dels patògens En vacunes hem de mantenir cadena de fred.
Plantes: - Sistema de producció de proteïnes dels patògens - A més pot ser vehicle de distribució de vacunes (menjar planta per immunitzar-se) o Problema: quina es la dosi? Menjar un plàtan, mig..? Vacunes comestibles: - No es necessiten xeringues - No requereix purificació Producció: - Les plantes transgèniques productores creixen en el lloc d’administtració - Els cultius es basen en llavors obtingudes de cultius anteriors - No existeixen despeses de transport - NO es necessita cadena de fred (sobretot important per països subdesenvolupats) ->Activen tant immunitat associada a mucosa com sistèmica 64 CTRIGUERO El problema està en la dosificació Dosis mes o menys controlades si els aliments es processen: pastes, pures, farines o sucs Tmb es pot acumular de forma estable en teixits de reserva (llavors...) Son mes resistents a la digestió-> augmenta temps de contacte amb les cels del sistema immune.
PLANTIBODIES Anticossos monoclonals produïts en plantes Es poden produir en gran quantitats Producció de immunoglobulina A de secreció Representa un 60% de les Ig Te 4 components que han d’estar ensamblats per tenir proteïna activa Protecció enfront a diferents patògens per les regions variables Podem produir els Ac en cels animals o cels vegetals En cels animals: dels 4 components, 3 es formen en plasma i 1 al epiteli -> l’ensamblatge es fa a la matriu cel·lular. L’ensamblatge nomes es fa en cels CHO que portin els 4 transgens En plantes: poden expressar nivells elevats dels 4 components i es poden ensamblar fàcilment.
TÈCNIQUES PER SIMPLIFICAR LES ETAPES DE PURIFICACIÓ Es millor en llavors En plantes podem trobar: fibres, olis, proteïnes vegetals molt abundants que poden contaminar la d’interès o metabòlits tòxics Per tenir la proteïna purificada: utilitzar sistema de cossos lipídics recombinants Cossos lipídics vesícula amb líquid. La membrana te lípids i una proteïna: Oleosina recombinant -> si a un dels extrems li uneixo la proteïna recombinant i un lloc de reconeixement de proteases Ho introdueixo a la planta-> es formen cossos lipídics i els oleosines seran recombinants Al fer la extracció, simplement per separació de fase aquosa i fase oliosa, puc separar la meva proteïna (que estarà a la fase oliosa) Quan afegeixo la proteasa, es trenca i la proteïna passa a la fracció soluble -> al final la tindre a la fase aquosa (es procés fàcil d’escalar, nomes implica centrifugació) AVANTATGES DE LA ACUMULACIÓ EN LLAVORS DE LES PROTEÏNES TERAPÈUTIQUES: - Ausencia de patògens endògens i pràcticament ausencia de fenols (la eliminació de fenols i endo- i mico- toxines és necessària pels assajos clínics en humans - Tenen una limitada gamma de proteïnes - Les proteïnes es queden inalterades, convertint a les llavors en un bon sistema d’emmagatzematge i distribució - No es requereix un processament immediat i es pot purificar amb facilitat (tecnologia oleosina/cossos lipídics) 65 CTRIGUERO BLOC 3 - MEDICAMENTS OBTINGUTS PER BIOTECNOLOGIA TEMA 3.1 – INTRODUCCIÓ EVOLUCIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA 1953 → es va seqüenciar el DNA Punt clau: als 80-90 → Insulina i Hormona del creixement → teràpia substitutiva MEDICAMENTS BIOTECNOLOGICS: “Según la Agencia Europea del Medicamento (EMA), los medicamentos biotecnológicos, también denominados fármacos biotec, pueden ser proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales, vectores para el transporte de material genético, fragmentos de anticuerpo, ácidos 6 nucleicos, oligonucleótidos antisentido, vacunas, etc. que comparten la característica de ser productos medicinales obtenidos a partir de técnicas de biotecnologia (r-DNA, expresión génica controlada, métodos basados en anticuerpos, etc.).
→ Son productes medicinals obtinguts per tècniques de biotecnologia Actualment: El 20% dels medicaments innovadors són biotecnològics El 50% dels assajos clínics són amb medicaments biotecnològics Partim de cèl·lules→ fem manipulació genètica→ les cels es produiran en un tanc de fermentació → PURIFICACIÓ (molt important) → obtenim el p.a. per fer el medicament PRODUCTES APROVATS En aquest moment hi ha 221 productes aprovats de la part biotecnològica (al 2015 eren 193) D’aquestes molècules, la majoria les produïm amb la tècnica del DNA recombinant Els productes biotecnològics tenen un preu més car.
Cada vegada surten mes productes perquè: - Cada vegada hi ha més BIOSIMILARS (com els genèrics però de productes biotecnològics) - Moltes companyies estan traient productes per malalties rares.
Totes les ventes tenen creixement positiu al llarg dels anys.
És una industria amb futur Es comença la recerca en universitats i centres de recerca → després la empresa la compra i continuen.
66 CTRIGUERO Productes que més es venen biotecnològics: MEDICAMENTS OBTINGUTS PER BIOTECNOLOGIA Característiques diferencials: !! El producte és el procés: el procés influeix tant en el producte que obtinc, que qualsevol petit canvi pot provocar que tinguem un producte diferent (pot no tenir activitat terapèutica, reaccions immunogeniques..) A partir de materials de partida ( línies cel·lulars, nutrients, ..) → fermentació → crixement de les cèl·lules → purificació→ API En aquests processos necessitem temperatura, nutrients, etc. → qualsevol canvi ens pot provocar producte incorrecte.
Purificació normalment amb columnes cromatogràfiques PROCESSOS: Necessiten molt de control de procés Necessitem control exhaustiu de totes les fases → normalment utilitzarem tècniques PAT (Tecnologies analítiques del procés) Directament les sondes ja estan als reactors i es controlen tots els paràmetres.
En el moment que una dada no es la que ha de ser, per exemple augmenta el pH, la maquina afegeix un producte per ajustar-ho→ sempre és el que ha de ser Són productes més complexos que els químics i qualsevol petit canvi pot tenir un efecte crític El procés és el producte!! 67 CTRIGUERO PRODUCTES BIOTECNOLOGICS vs FARMACS TIPICS: Biotec: - Els produïm per purificació - Material de partida variable - Molts controls de procés durant el procés - El test final és molt mes complex - Procés específic del producte Per obtenir grams o kg de producte Fàrmacs típics: - Per formulació - Materials molt establerts - Es fan controls però menys - Molt mes simple (HPLC, espectrofotometria...
- Es pot generalitzar més.
- 500, 1000kg, etc.
Els productes Biotecnològics: -Són molècules molt mes grans → mes problemes per dosificar-les -Estructura complexa -Productes heterogenis -No es compren del tot la seva activitat -Poden donar respostes immunes amb impacte clínic important ESTRUCTURA PROTEÏNA - Estructura primària= una cadena de AA units per enllaços peptídics → enllaços forts→ no tindrem problemes de que es degradi - Estructura secundaria: formada per ponts d’H (enllaços febles) → vigilar que no es perdin els ponts d’H, per no perdre l’activitat de la proteïna) - Terciària: Moltes modificacions post-traduccionals, enllaços diferents..
- Quaternària: combinació de diferents proteïnes terciàries.
El procés no pot influir en afectar la estructura de la proteïna CARACTERÍSTIQUES DIFERENCIALS: PER PROPIETATS FQ INDESITJABLES - Tenen solubilitat molt variable o Alguns son tant solubles que tenen baixa absorció o Alguns son insolubles i s‘ha de donar volums molt grans - Baixa biodisponibilitat - Estabilitat limitada - Són difícils de caracteritzar: dependrà de les característiques que tingui el fabricant o Estructura tridimensional o modificacions o Perfils d’impureses Aquests productes no estan a farmacopea.
Punt isoelèctric→ pH al que un polianfolit te càrrega neta zero. El concepte es particularment interessant en els aminoàcids i en les proteïnes. A aquest valor de pH la solubilitat de la substància és casi nul·la.
S’ha d’anar treballant amb els pk...
68 CTRIGUERO DIFERÈNCIES FARMACOLÒGIQUES: Biotec: Molècules petites (síntesi): - Productes molt dirigits - Poc dirigits (es distribueixen) - Específics d’espècies - Espècie independent - Mecanisme acció pleiotropic - Mec d’acció Totalment específic (més clar) (Te múltiples manifestacions) - Degradació proteolítica - Metabolisme - Immunogenicitat - No immunogenicitat - Farmacologia exagerada (reaccions) - Toxicologia relacionada amb metabòlits o similars - Farmacodinamia retardada i prolongada - PK/PD TIPUS DE MEDICAMENTS BIOTEC: - Proteïnes obtingudes per enginyeria genètica o DNA recombinant Anticossos monoclonals Fragments d’anticossos Vacunes Etc.
La investigació en biotecnologia farmacèutica es dirigeix cap a : - Recerca de noves molècules amb finalitat diagnostica i terapèutica - Estudi de noves indicacions terapèutiques - Amb molècules que ja estan comercialitzades, Millorar el seu RENDIMENT Ex: Hormona del creixement: es va seqüenciar al 57, al 78 es va fer la 1a molècula amb mètode de DNA recombinant, 2000→ surt forma farmacèutica d’alliberació prolongada; ara: genèrics o biosimilars.
Totes aquestes millores les fa al departament de desenvolupament galènic.
TEMA 3.2 - FORMULACIÓ DE PROTEÏNES RECOMBNANTS PROBLIMÀTIQUES: - Tenen poca estabilitat fisicoquímica (són molècules grans amb molt grups funcionals que poden reaccionar amb els excipients o amb la formulació) L’activitat depèn de la seva estructura 2a, 3a, 4a → depenen d’enllaços dèbils → si la nostra actuació trenca aquests enllaços, perdrem la estructura → perdríem activitat de la molècula Baixa estabilitat en condicions d’emmagatzematge normals.
Tenen Baixa biodisponibilitat→ son massa grans com per ser absorbides i com tenen molts grups funcionals, al tracte gastrointestinal es degrada pels enzims.
Tot i això podem tenir resposta terapèutica.
- Aclariment plasmàtic→ la semivida dels productes es curta (proteòlisi, etc.) Per les petites: la eliminació pel ronyo es molt alta - Són difícils d’obtenir en gran quantitat.
→ Per tal que tinguin efecte terapèutic cal conservar la integritat de la molècula i minimitzar l’efecte immunològic.
69 CTRIGUERO ESTABILITAT: - INESTABILITAT FÍSICA: o el factor que més influeix es la temperatura (tant ALTES com BAIXES) o agitació o Exposició al aire o Absorció parets envàs Per arreglar lo de la temperatura els tindrem entre 2 i 4 ºC - INESTABILITAT QUÍMICS: és irreversible o Principal factor: pH → pot trencar els enllaços peptídic i és un factor determinant de la solubilitat de les proteïnes o Medi oxidant o reductor !!→La formulació no es pot generalitzar per als productes biotecnològics, s’ha d’estudiar individualment.
PROBLEMES IN-VIVO - Inactivació oral → es degrada Parenteral: o Moltes proteïnes són insolubles→ adsorció en venes Degradació al fetge Degradació deguda a la proteòlisi→ també inactivarà les proteïnes Una administració subcutània ens pot provocar una pèrdua fins a 80% de la dosi (s’ha de tenir en compte) Toxicitat Proteïnes petites es filtren molt ràpidament pel ronyó.
Degradació proteolítica: Es trenquen els enllaços proteolítics Petites quantitats dels enzims ens poden reduir la activitat biològica.
Proteases: serina, cisteïna, Aspartic, Metaloproteases.
PROBLEMES IN-VITRO: · Processos No-covalents: - Es pot desnaturalitzar la proteïna (canvi de pH, agitació...) Hem de fer proves per saber les situacions que provoquen la desnaturalització - Adsorció sobre les parets del envàs - Agregació - Precipitació · Processos sobre enllaços covalents: - Hidròlisi del enllaç de la amida (es el +important) - Es poden trencar les cadenes La desaminació passa amb altes temperatures i pH extrems - Reaccions d’oxidació - Fragmentació - Isomerització 70 CTRIGUERO ESTRATÈGIES DE FORMULACIÓ Podem treballar en: - Conservació - Formulació (sobre la pròpia molècula) - Forma farmacèutica (utilitzar forma farmacèutica que afavoreixin la conservació del pa.) 1. CONSERVACIÓ: - Refrigeració - Envasat - Podem afegir additius o excipients - Liofilització · REFRIGERACIÓ Les baixes temperatures redueixen el creixement dels microorganismes, També redueix la adsorció en l’envàs La majoria s’han de conservar en nevera entre 2 i 8ºC També es pot congelar, però hem de confirmar que el procés de congelació i descongelació no ens desnaturalitzi la proteïna.
Ex: insulina: - No aguanta la congelació - Mes de 8 ºC es comença a degradar.
· CONSERVACIÓ DEL ENVAS: El millor material d’envasat es el vidre amb parets llises : és quan hi ha menys adsorció sobre les parets.
La majoria de productes s’envasen en plàstics amb coadjuvants, etc.
Hem de fer estudis de compatibilitat.
Es recomana treballar amb envasos opacs per reduir la influencia de la llum.
Per reduir influencia del aire es treballa amb envasos que no permeten l’entrada d’aire o amb gasos inerts.
Posem el que posem sempre hem de fer un control · ADDITIUS, EXCIPIENTS...
Des de punt de vista microbiològic: - En xarops→ sucres o dextrans per desplaçar l’aigua - Si es parenteral (majoria) ha de ser estèril Mètodes per esterilitzar producte: o Autoclau (en general no aguanten tanta calor) o Filtració esterilitzant (filtres són de polímers que poden provocar adsorció de la proteïna en el filtre) o Radiacions ionitzants (mutacions, no es bon mètode) o FABRICACIÓ ASÈPTICA - Si son productes multidosis → posar conservants Estabilitzants: - Zn a la insulina o poliols - Glicina per protegir contra la calor - Més important: sèrum d’albúmina (ens ajuda a resistir temperatures i pH, estabilitza conformació proteïna i preveu de que s’adsorbeixi al envàs 71 CTRIGUERO Sempre hem de fer la compatibilitat d’excipients amb el nostre API Altres excipients: - Antioxidants - Agents quelants - Tensioactius iònics - Agents osmòtics - Reguladors del pH · LIOFILITZACIÓ Sublimació→ assecat primari → assecat secundari Es fa un producte amb molt baixa humitat → assegura estabilitat Sempre es fa liofilització per evitar degradacions Ho haurem de combinar tot per garantir almenys 2 anys de caducitat En la liofilització hem d’afegir crioprotectors → La majoria de productes estan liofilitzats.
2. FORMULACIÓ El primer que hem de plantejar es la via d‘administració La majoria de productes biotecnològics son per via parenteral La 2a seria la nasal i pulmonar Per últim la oral.
Per augmentar estabilitat : - Mico o nanocàpsules - Fer formes d’alliberació modificada Objectius cínics per dissenyar formes farmacèutiques d’alliberació modificada: - Augmentar l’interval d’administració→ per millorar l’adherència terapèutica EXEMPLE: insulina -Insulina amorfa (natural→ 5 min) -Insulina cristal·lina → si es combina amb altres productes i manipulacions, podem modular la alliberació de la insulina i adaptar-la al que vulguem→ tenim insulines de molt rapida alliberació o molt lenta o INSULINA ULTRARAPIDA: es canvia una prolina per una Asp o INSULINA ALLIBERACIÓ LENTA: Dintre de la massa cristal·lina de insulina tenim molècules de Zinc → fa que es vagi alliberant poc a poc els hexàmers, despreses dímers i després monòmers es el que s’absorbeix.
Insulina glargina és la que dura mes - Disminució fluctuacions nivells plasmàtics → tenir biodisponibilitat sempre més estable o Insulina nasal (biodisp. 7%) o Insulina pulmonar (10%) Ja és suficient per tenir la dosi terapèutica - Controlar el lloc d’alliberació 72 CTRIGUERO ESTRATEGIES DE FORMULACIÓ: - Canvis estructurals sobre la molècula - Modificar-la amb els excipients - Tècniques d’encapsulació → per protegir-lo 1. CANVIS ESTRUCTURALS - Modificació de la estructura primària o substituir algun aa per disminuir la oxidació o Produir mes enllaços disulfur o Canvis de forma, grandària...
- Afegir proteoglicà → tindràs anàleg amb millors condicions d’estabilitat Bloqueig temporal de les proteases o sistema bomba D-glyco proteïna - Afegir substàncies bioaddesives → s’adhereixen a la mucosa del tracte gastrointestinal → Facilitarem que hi hagi la possible difusió.
I també evites la degradació pels enzims.
→ PEG-ilació: Afegir cadenes de polietilenglicol (co-solvent) → és hidrofilic, no tòxic i no te carrega Quan el combino amb la meva proteïna obtinc un conjugat que fa que: - Disminueixi la seva immunogenicitat - S’incrementa la solubilitat i estabilitat - Disminueix les pèrdues Es guanya de 4 a 400 vegades d’estabilitat  produeixen un impediment estèric i no permeten que els enzims entrin i degradin a la proteïna Micel·les Polietilenglicol i part hidrofòbica → fer la micel·la i després introduir la proteïna dins la micel·la → allarguem molt més la estabilitat del producte Es fa amb reactors Les biomolècules conjugades tenen propietats fisicoquímiques diferents a les originals.
Hem provocat: - Canvis NO conformacions - Que tinguin capacitat d’unió electrostàtica - Estem variant la hidrofovicitat - Impediments estèrics - Canvis en els valors de pK - Canvis en el punt isoelèctric Tot això provoca: - Enrederament en l’aclariment renal - Major estabilitat - Menors efectes adversos degut a que el PEG Problema: el PEG no es biodegradable 73 CTRIGUERO EXMPLE: interferó alfa Va canviant la alliberació La PEGilació va ser punt d’inflexió amb la formulació de les proteïnes.
La majoria de productes comercialitats estan amb el PEG ALTERNATIVES A LA PEG-ilació - ÀCID POLISIALIC - Hidroxietilmidó - Fosdorilcolina - ..
Van superar els problemes del PEG: - Menor immunogenicitat - Major via mitja - Modulació de l’absorció als teixits, biodistribució i eliminació plasmàtica per teràpies cròniques.
- Millor estabilitat enfront l’agregació.
Conjugació de pèptids i proteïnes Per allargar la biodisponibilitat Com mes cadenes de àcid siàlic, l’hematòcrit és millor  Augemntes la biodisponibilitat i estabilitat Altres canvis: Proteïna + anticòs TÈCNICA DE FUSIÓ AMB PROTEÏNES: Gen de la proteïna que ens interessa + un gen amb una part de proteïna estable que ens interessi→ quan es transcriu i tradueix, ja tenim la proteïna combinada i unida Ex: sèrum d’albúmina AVANTATGE: - El seu procés de purificació serà més senzill (només tindrem una) - Més econòmic (fer un procés en comptes de 2) 74 CTRIGUERO 2. EXCIPIENTS · EXCIPIENTS TRANSPORTADORS Quan el nostre fàrmac es posa en contacte amb els excipients, es provoca un canvi Reversible Aquest canvi fa que vulgui travessar la membrana biològica. Un cop la ha travessat, els excipients es desacoblen i ja tenim la forma activa un altre cop per que actuï.
· EXCIPIENTS PERMEABILITZANTS Ens ajuden a fer forats a la membrana plasmàtica: Exemles: - AAS, derivats salicilats - Quelants metàl·lics (EDTA) - Àcids grassos o sals biliars - Tensioactius - Ionoforesi - Etc.
· EXCIPIENTS INHIBIDORS DE LES PROTEASES: Inhibeix les proteases que hi ha al organisme Ex: Si tenim moltes serines→ posarem Benzamidina que inhibeix la serine proteasa Pepstatin A → Aspartic proteases EDTA → metalloproteases ...
3. MICROENCAPSULACIÓ Micro o nanopartícules S’absorbiran per diferents mecanismes: persorció, endocitosi, transport paracel·lular i a través del teixit limfoide associat al budell (GALP).
Si es IV ha de ser sempre mes petit de 0,5 μm Ideal: al voltant de 100 nm APLICACIONS: - Alliberació prolongada - El polímer esta protegint la proteïna(protecció química i física) - Ens ajuda a vehiculitzar el fàrmac TIPUS de MICROPARTICULES (>1 μm) - Microcapsula: p.a. actiu a dins d’una matriu de polímer - Microesfera: p.a. + matriu polimèrica La majoria de comercialitzats son microesferes NANOPARTICULES: entre 1 i 100 nm LIPOSOMES: entre 80 i 100 nm - Unilaminars petits - Unilaminars grans - Multilaminar gran.
75 CTRIGUERO LIPOSOMES - Convencional: producte hidròfil estarà al centre, si es lipòfil, estarà a la capa - STEALTH: se’ls hi ha afegit cadenes de PEG → per allargar el temps de vida = Amb aclariment lent - Immunoliposomes - Catiònic: estan carregats positivament → en interessa quan volem vehiculitzar determinades molècules. Tenim la lipofectina: a un pH de 6,5 provoca carrega +. → va be per vehiculitzar DNA o altres substancies carregades negativament.
- Liposoma DOPE: Resisteixen la fagocitosi dels macròfags (x100) En general els STEALTH, liposomes peglicats de antineoplàstics, han demostrat millores clíniques.
ENCAPSULACIÓ: Per fer microesferes hem de fer un polímer, aquest pot ser: - Biodegradable (gelatina, PLGA) - No biodegradable(PEG, polietilen co-vinil acetat...) Per fer les micro/nano-partícules: - A vegades temperatures altes, quantitats altes de tensioactiu o barreges de dissolvents → poden afectar a la estabilitat de la proteïna Obtenció: - Evaporació del dissolvent - Polimerització in situ - Spray-drying Lo ideal es que siguin biodegradables, però també hi ha biocompatibles i no-tòxics POLIMERS No biodegradables (si biocompatibles): per fer implants→ després es retiren.
- PLA - Silicones - Copolimers de l’òxid d’etilè i acetat de vinil - Poluretans 76 CTRIGUERO POLIMERS BIODEGRADABLES - PLGA - Copolímers metil-vinil-éter i anhídrid maleic - Poliortoésters - Poliaminoàcids POLÍMERS HIDROSOLUBLES: - Derivats cel·lulòsics - Chitosan - Dextrans - Acrilats - Acrilamides - PEGS POLIMERS Tots deriven del àcid polilàctic glicòlic ??? MECANISME D’ALLIBERACIÓ DELS POLIMERS: - Difusió - Degradació del polímer - Combinació de degradació i difusió · DIFUSIÓ: A temperatura ambient baixa (10-20ºC) el polímer esta en forma liquida, però amb canvi de temperatura passa a Gel Injectarem el producte a temperatura ambient (soluble) → un cop esta en contacte amb la temperatura fisiològica, la solució gelifica i es forma un dipòsit de gel→ a partir d’aquí anirà difonent el nostre medicament.
Podem tenir Hidrogels que també s’inflaran en canvis de pH, força iònica, solvent, pressió o aplicació de camps elèctrics (podem tenir diferents hidrogels) Un altre exemple: Insulina protegida per una capa Aquest polímer quan esta a pH 7,4 esta inflat i està tancat El polímer te Polymethacrylic acid i Polyethylene glycol i un enzim (glucosa oxidasa) Quan a nivell sanguini hi ha glucosa, la glucosa es degradada per l’enzim glucosa oxidasa → Baixa el pH→ el polímer reacciona, es desinfla i deixa passar les molècules de insulina.
· DEGRADACIÓ: - Per hidròlisi: en contacte amb aigua reaccionen amb grups funcionals, es degrada el polímer - Degradació enzimàtica: proteases, etc.
· Sistema RESERVORI - hidrogel Tenim cadenes del polímer enganxades amb les nostres nanopartícules→ es van alliberant.
77 CTRIGUERO 3. ALLIBERACIÓ – FORMES FARMACÈUTIQUES La via majoritària és la via parenteral, la segona: pulmonar i nasal · ADMINISTRACIÓ ORAL DE P.A. BIOTECNOLÒGICS Baixa biodisponibilitat La majoria es degrada en el medi àcid i per les peptidases intestinals Tenen poca permeabilitat en la paret GI degut a: - Important grandària molecular - Càrrega elèctrica - Alta polaritat Factors fisiològics: temps de transit GI, la dilució i les interaccions amb components dels aliments Efecte de primer pas.
EXEMPLES FORMULACIONS ORALS - MICROCAPSULES BIODEGRADABLES: Hormones creixement, inulina, calcitonina, interferó-α, al·lergògen.
- Vacunes orals per febre tifoides i febres del viatger, vacuna tètanus - Comprimits mucoadhesius/dispersables: (GI-MAPS®) - Insulina oral aplicant formació de conjugats amb petits polímers, per l’empresa NOBEX (fase I) · També a nivell de mucosa bucal · ADMINISTRACIÓ PARENTERAL DE P.A BIOTEC -Es la via habitual d’administració dels ppaa biotecnològics. Dins la via parenteral, la preferent és la via endovenosa (IV), seguida de la via subcutània (SC).
-Els pèptids i les proteïnes s’eliminen de l’organisme per metabolisme i excreció. La naturalesa dels processos de biotransformació es troba molt condicionada pel pes molecular del pa .
-El PROBLEMA de la via parenteral és, per tant, el ràpid aclariment plasmàtic, la qual cosa obliga a formular per a modificar el perfil farmacocinètic.
EXEMPLES: - GONAPEPTUL® DEPOT Agent de suspensió separat de les Microcapsules de alliberació perllongada API: Triptorelin acetatt (glàndula pituitaria cervell) - Pólvores extemporanis per a suspensió injectable. Via Intramuscular.
o Prevear 13 jeringa precargada 0,5ml/aguja Vacuna antineumocócica polisacaridica o Monocid 1h IM, polvos para solución inyectable Antibiòtic beta-lactàmic del grup cefalosporines - Solució injectable. Via subcutània o Forsteo 1 pluma precargada. Hormona paraitroidea Tractament de pacients amb risc de fractura òssia per osteoporosi o Lantus Optisel 100 UI 5 plumas 3ml.
Insulina glargina o Prolia 60 mg solució injectable en xeringa precarregada Risc de fractures òssies en dones post menopàusiques i homes amb càncer de pròstata.
78 CTRIGUERO · ADMINISTRACIÓ PULMONAR Alternativa a la via oral Tenim una superfície molt gran de mucosa → Augmenta la absorció de forma ràpida a nivell d’alvèols.
Bona biodisponibilitat (No hi ha efecte de 1r pas) → Pèptids de 10 aa tenen Biodisponibilitat del 100%.
Grandària partícula: - 2-4μm : IDEAL - > 4 μm (~ 10 μm) queden en la part alta del tracte respiratori - < 2 μm (~ 0,5 – 1 μm) al expirar, el peceint les extreu, No s’absorbeixen.
INCONVENIENTS: - Deposicions (toxicitat) per l’elevat numero de macròfags en pulmons - Reproductibilitat de dosi dolenta.
Desenvolupament de Dispositius que administren dosis altes! - INHALADORS POLS: la dosi ja esta separada per l’administració - INSULINA: bona via però hem de fer servir excipients específics (estabilitzadors peptídic, inhibidors proteases... etc.
EXUBERA®= primera Insulina en pols (retirada) - INSULINA LÍQUIDA = Nebulitzadors però també tenia problemes de reproductibilitat ARADIGM® → Una dosi precarregada per cada administració.
· ADMINISTRACIÓ NASAL Molta circulació en la mucosa nasal PROBLEMA: en la mucosa hi ha enzims degradatius, caldrà treballar amb excipients Per les neurones olfactives arriben substàncies al SNC com neuropèptids! Exemple: - CALCITONINA INTRANASAL→ Absorció semblant a la parenteral · ADMINISTRACIÓ RECTAL Evitem metabolisme del 1r pas, augemnta la absorció, etc.
Hi ha estudis d’insulina, s’hi està treballant · ADMINISTRACIÓ OCULAR Implants de tipus lentilla que afavoreix l’absorció per mucosa ocular.
S’hi esta treballant molt.
· ADMINISTRACIÓ TRANSDÈRMICA (PEGATS) Molt utilitzats en cosmètica= dispositius amb agulles que trenquen la barrera de la pell perquè puguin travessar les proteïnes.
79 CTRIGUERO PEGATS amb IOTOPORESI → Amb corrent elèctric de baix voltatge Amb el diferencial de càrrega la proteïna que està ionitzada es mourà d’un pol a l’altre, absorbint-se pel vas sanguini IMPLANT SUBCUTANI: basat en la bomba osmòtica S’infla una capa osmòtica per l’entrada d’aigua i per pressió s’allibera el p.a.
BOMBA DE PROTEÏNES Dispositiu elèctric programat amb la velocitat de difusió i la quantitat de proteïna alliberada S’implanta a la part greixosa de l’abdomen i es programa des de fora.
FUTURE DELIVERY BIOCÀPSULES Encapsulació de cèl·lules secretores d’insulina dins d’un polímer (membranes semipermeables) que No permeten l’entrada d’Anticossos però Sí la sortida d’insulina→ Es regularia a partir de la quantitat de glucosa que travessa la membrana.
TEMA 3.3 – REGISTRE DE MEDICAMENTS BIOTECNOLÒGICS Cal llegir la llei on s’exposa que cal especial cura en: - La seva caracterització (els grups de la proteïna) - Sobredosi* - Que siguin estables - Que hi hagi compatibilitat entre p.a., excipients, plàstic...
- Que sigui actiu biològicament.
*SOBREDOSI: mai podem sobredosificar el p.a a nivell d’indñustria per assegurar que arribi a la data de caducitat Només es pot dur a terme en vacunes i ha d’estar molt justificat.
Registre però normal.
TEMA 3.4 – ESTUDIS D’ESTABILITAT DE MEDICAMENTS BIOTECNOLÒGICS ICHQ5C: Específica per a productes biotecnològics - Atenció a modificacions d’activitat biològica Atenció a conformació molecular Atenció a la degradació per factors ambientals Cal fer assaigs de tota mena: a temps real, a llarg termini, condicions reals.
Aquesta ICH és d’aplicació per: - Proteïnes - Activadors del plasminògen - Citocines - Anticossos monoclonals - Eritropoetines - Factors plasmàtics i sanguinis - Insulines - Vacunes constituïdes per proteïnes i polipèptis ben caracteritzats No cal en: antibiòtics, extrets al·lergènics, heparines, vitamines o sang sencera 80 CTRIGUERO CONDICIONS ESTABILITAT: · API - Almenys 3 lots d’escala industrial representatius (el producte és el procés) → Pots presentar dades pilot però no valdran pel vistiplau - Mínim 6 mesos de dades - Estabilitat respecte envàs (definitiu) i tancament.
· PRODUCTE INTERMIG - Si alguna de les fases és problemàtica farem un estudi.
· PRODUCTE FINAL - Fer servir diferents lots d’API per veure’n l’estabilitat - Atenció a identitat (aspecte, estèril, quantificació excipients...), Puresa i Potència.
- Criteris de mostreig: o Matriu de mostreig: agafar els extrems de condicions a mateixa dosi i envàs, podem dir que les centrals estaran bé o malament en comparació als resultats dels extrems.
En diferents presentacions · Temperatura · Estrès · Llum · Envàs · Humitat · Fer assaig en horitzontal per mirar l’estabilitat del material del tap que molts cops és diferent a la resta del envàs.
· Temps de mostreig - Menusal fins a 3 primers mesos - Cada 3 mesos fins el 1r any - Cada 6 mesos fins el 2n any - Cada 24 mesos per sempre.
81 CTRIGUERO TEMA 3.5 – COMPLIANCE Compliment de GMPs - Lots clínicsnen instal·lacions que compleixin GMPs - Lots comercials a nivell indsutrail FDA: 21CFR part 600 EUROPA: GMP productes químics + ANNEX II (especial productes biotecnològics) PROCEDIMENTS GMPs 1. Disseny i construcció correcta d’equipaments i facilitats 2. Seguir instruccions i procediments escrits 3. Documentar el treball 4. Validació de treball (sempre mateix resultat de producte = mateix procediment) 5. Monitorització dels equipaments 6. Escriure pas per pas els procediments i les instruccions 7. Dissenyar, desenvolupar i demostrar competències de treball 8. Protecció contra contaminació 9. Control de components i processos de producció relacionats 10. Auditories periòdiques MANUFACTURACIÓ Zones estèrils + aigua per injectables (requeriments específics biotecnològics.
TEMA 3.6 - Similituds i diferències dels medicaments biotecnològics i els més clàssics. Medicaments biotecnològics aprovats per les autoritats reguladores MEDICAMENTS BIOTECNOLOGICS -Hi ha més de 200 teràpies biotecnològiques disponibles -4 de cada 5 teràpies en desenvolupament es basen en la biotecnologia -En aquest moment hi ha més de 1000 assajos clínics i d’aquests bastants (<300) en fase avançada -325 milions de pacients han estat tractats per malalties greus amb biomedicines.
MEDICAMENTS: S’intenta buscar millors formes d’administrar.
I+D Estudis clínics -> en humans: - Fase I - Fase II - Fase II - Aprovació per les agencies reguladors - Fase IV o post-comercialització La famacovigilacia agafa TOTES les fases del desenvolupament (però en la Fase IV té un paper molt important.) Qualsevol medicament autoritzat ha d’haver tingut assajos clínics 82 CTRIGUERO Assignació del factor d’estudi-> és el Medicament (No el fàrmac) L’investigador CONTROLA la assignació del factor d’estudi= abans no s’estava prenent el medicament Aleatorització (molt important) Si no son aleatoris-> no assaig Fase I-> No hem de veure eficàcia Fase II i II: EFICÀCIA = en condicions controlades Fase IV: EFECTIVITAT= condicions No controlades MARC REGULADOR Mercats més importants: - FDA -> per comercialitzar a EEUU - EMA-> comercialitzar a Europa ICH En medicaments biotecnològics obligatòriament el procediment d’autorització és el procediment centralitzat  Per a tots els Estat membres de la UE al mateix temps Procediments centralitzats també obligats per: - Orphan medicine - Advanced therapy medicines - Tractament VIH La Agencia te 7 comitès científics - PRAC→ farmacovigilacia (cada cop més important) - Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) - Committee for Medicinal Products for Veterinary Use (CVMP) - Committee for Orphan Medicinal Products (COMP) - Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC) - Pediatric Committee (PDCO) - Committee for Advanced Therapies (CAT) Al final hem de tenir seguretat i eficàcia I que la relació risc-benefici sigui positiva 83 CTRIGUERO Un cop el medicament està autoritat es fa un document EPAR = avaluació publica sobre un medicament És un informe que inclou TOT: des de etiquetatge, desenvolupament, etc.
MEDICAMENTS I EVOLUCIÓ DE LA SEVA APLICACIÓ A LA PRÀCTICA CLÍNICA - Hi ha diferents tipus de medicaments procedents d’origen biotecnològic - Diferents malalties o indicacions terapèutiques per les quals existeixen medicaments d’origen biotecnològic autoritzats (principalment càncer) - Més d’una indicació MALALTIES MES FREQÜENTS: - Càncer - Infeccions - Malalties autoimmunes - Cardiovasculars - Neurològiques.
TIPUS: - mAB (Anticossos monoclonals) (Ex: Eculizumab, Ofatumumab) Vacunes Proteïnes/ Hormones recombinants Teràpia cel·lular Teràpia gènica SIMILITUDS DIFERENCIES BIOTEC/CLÀSSIC Sobreot: via d’amdinistració Molt cars 84 CTRIGUERO Nº DE PARTICIPANTS HABITUALS EN ELS EECC Es necessari aprox uns 3.000 pacients per poder detectar una RAM que tingui una incidència d’aparició baixa RAM de tipus B (Bizarre) Els medicaments biològics portaran el Triangle negre invertit → Seguiment alternatiu addicional El triangle també el porten: - Medicaments amb nova substància activa - Que s’hagin aprovat aprovacions condicionals → sense acabar l’estudi del tot.
- Qualsevol medicament que decideixi el PRAC per qüestions de seguretat - Quan es necessiten estudis addicionals.
La etiqueta de biotecnològic no necessàriament significa innovació! REGLA DELS 5 ANYS Es necessita període de 5 anys per conèixer realment els aspectes de seguretat.
A no ser que sigui un fàrmac que no tingui altre alternativa, que en necessiti urgentment.
EX: · Infiximab: Any 2000: apareix risc de infecció tuberculosa associada a infliximab 2002→ Apareix advertència en la fitxa tècnica per evitar la RAM Drotrecogin alfa: es va veure que no era eficaç → es va retirar CAUSES QUE S’ASSOCIEN A MODIFICAR LA SEGURETAT DE PRODUCTE BIOTECNOLÒGIC: - Canvis en el procés de fabricació o Canvi d’excipient Formació d’agregats Potencial per la immunogenicitat Resposta farmacològica exagerada Canvi d’espècie Medicaments biotecnològic són innovació, però també hi ha coses que no son innovadores.
IMPACTE ECONÒMIC 2005: Representaven un 30% del gest en medicament en hospitals del nostre entorn (excloses vacunes) 2008: la mitat dels 10 fàrmacs líders en ventes eren biotec 2014: 7 dels 10 fàrmacs líders mundials en ventes són biotecnològics i suposen un 75% del impacte d’aquest grup.
85 CTRIGUERO MEDICAMENT BIOLÒGIC: Medicament que conté un o més principis actius sintetitzats o derivats d’una font biològica (fluids o teixits humans o animals, microorganismes, etc.) Aquests medicaments poden produir-se per diferents tècniques: - Directament per l’organisme viu (ex: factors de coagulació extrets i purificats de plasma humà) - Per biosíntesi en cèl·lules vegetals o animals, bacteris, llevats i virus mitjançant tècniques de biologia molecular o biotecnològiques que impliquen la manipulació de material genètic.
BIOSIMILARS Medicament biològic similar a un altre ja existent, el medicament referència/innovador, que es desenvolupa d’acord a estrictes requisits exigits per la agència reguladors corresponent.
Similar= No podem comprovar que és Idèntic El que fem es demostrar la comparabilitat MEDICAMENT BIOTEC: Medicament que conte un o mes p.a. sintetitzats o derivats d’una font biològica Tècniques: - Directament del organisme viu - Biosíntesi en cels vegetals o animals DESENVOLUPAMENT D’UN MEDICAMENT BIOTECNOLÒGIC: La majoria son proteïnes grans i complexes (desenvolupament complicat) Qualsevol canvi en el procés de fabricació pot donar lloc a diferencies Les variacions estructurals entre 2 medicaments biotec de un mateix p.a. es poden produir entre: - 2 innovadors obtinguts de diferents línies cel·lulars - Entre un medicament d’abans i després de fer modificacions en el seu procés de fabricació - Entre un biosimilar i el seu innovador.
El procés és el producte COMPARABILITAT: concepte científic que es refereix al exercici de comparar tots els aspectes Moleculars i clínics entre dos productes biològics.
La EMA exigirà la Comparabilitat BIOSIMILITUD: Terme legal que expressa la comparabilitat entre un biosimilar i el producte de referència.
Per establir la comparabilitat entre 2 medicaments biotec: 1. Demostrar que la qualitat és similar mitjançant DADES PRECLÍNIQUES Dades comparatives de la Caracterització molecular i biològica dels dos productes 2. Si indiquen que no hi ha diferencies → passem a la fase CLÍNICA Exigeix Fase I i Fase III La EMA exigeix als biosimilars assajos clínics comparatiu en front al producte de referencia (estudis de no inferioritat) 86 CTRIGUERO Diferencies BIOSIMILAR, GENERIC IMMUNOGENICITAT Es el que mes preocupa→ no es la mateixa estructura i s’ha de comprovar al immunogenicitat La EMA dispon de directrius especifiques de les proteïnes terapèutiques i de MAB Descriuen com avaluar la immunogenicitat en cada un dels productes, ja siguin innovadors o biosimilars.
En el cas dels BIOSIMILARS→ la immnogenicitat ha de ser comparada tant in vitro, com en assajos pre-clínics i clínics.
El pla de gestió de riscos post-autorització, de tots els medicaments biològics, inclou vigilar i revisat les dades registrades sobre reaccions immunològiques.
EXTRAPOLACIÓ D’INDICACIONS El biosimilar s’ha de comprovar en cada una de les indicacions? EMA→ depèn En general No es necessari si ho demostres o justifiques de manera científica: Ex: demostrar que el mecanisme d’acció i/o e receptor que participen en les indicacions extrapolades son el mateix Aquest aspecte es contem`pla en les guies especifiques per cada biosimilar o en el EPAR dl biosibilar en qüestió INTERCAMBIABILITAT La EMA no fa referencia→ criteri autoritats sanitàries de cada país La FDA sí (et diu si es intercambiable o no) A Espanya: Només s’aplica als medicaments que es dispensen a la oficina de farmàcia → NO podríem canviar ningun medicament biològic.
87 CTRIGUERO En l’àmbit hospitalari és mes fàcil→ hi ha una guia de medicament que s’utilitzen al hospital.
Quan no existeixi una comissió especifica per la selecció d medicaments a nivell nacional o autonòmic, cada centre decideix que fer.
Al 2015 hi havia 19 Biosimilars Actualment hi ha 4 més MERCAT BIOSIMILAS Es pensa que es redueix el cost en fort al innovador un 30% La utilització de fàrmacs biosimilars suposarà un estalvi pel nostre sistema sanitari que incidirà fonamentalment en el gest hopsitalari i de forma global a la sostenibilitat del SNS.
Perquè pugui haver-hi biosimilar, s’ha d’haver acabat la Patent MEDICAMENTS ORFES Medicament que no es desenvolupa per la industria farmacèutica per raons econòmiques, però que respon a necessitats de salut pública.
DESIGNACIÓ D’UN MEDICAMENT COM A ORFE: El laboratori o promotor que ha de fer un medicament orfe, sol·licita a la EMA si li atorga la designació com a medicament orfe.
La designació es abans de la producció del medicament perquè comporta una sèrie de incentius.
Perquè la EMA concedeixi s’han de complir les 3: - Que sigui per al diagnòstic, prevenció o tractament de una malaltia que amenaci la vida o comporti una incapacitat crònica - Que la prevalença sigui menor de 5/10.000 als UE o que resulti improbable la comercialització del medicament generi ingressos insuficients per justificar la inversió necessària per desenvolupar-los (malalties de països pobres: malària, etc.) - Que no existeixi cap teràpia satisfactòria autoritzada per la malaltia (que sigui el 1r) o, d’existir, el medicament aportarà un benefici considerable als que pateixen la malaltia.
Ex: Tobramicina PUNTS A CONSIDERAR - La consideració de medicament orfe es una qualificació oficial, atorgada per les autoritats - El criteri diferenciador d’un medicament orfe es de tipus comercial: no s’espera que els ingressos després de la comercialització compensin els costos.
- El citeri de que el medicament aportarà un benefici considerable als que pateixen la malaltia a vegades no es compleix, ja que la designació de medicament orgue és ANTERIOR al desenvolupament clínic.
- En realitat, són les indicacions d’un medicament les que poden considerar-se “orfes”, donat que un medicament desenvolupat per tractar una malaltia freqüent pot declarar-se orfe per una altre indicació.
Ex: ketoconazol: es antifúngic, però en el síndrome de Cushing és un medicament orfe.
Normalment el concepte de medicament orfe s’associa a malaltia rara, però també es per malalties desatingudes (països pobres) 88 CTRIGUERO REGULACIÓ - Els primers van ser la FDA de EEUU Orphan Drugs Act Es va definit malaltia rara a les que afectessin a <200.000 individues a EEUU.
Avui: prevalença de 6,3/10.000 habitants - Despres Japó i Australia van publicar normes similars 1999 → Europa o Procediments per declarar determinats medicament com orfes o Incentiu per FOMENTAR la seva investigació, desenvolupament i autorització.
 Committe for Orphan Medicinal products (COMP), específic per les designacions de medicaments orfes.
- INCENTIUS: - Asistencia de la EMA en la elaboració de protocols de investigació Tasses reduïdes per les sol·licituds Accés a finançament pública per la investigació Patent de 10 any El període de exclusivitat s’allarga 2 anys més si amb el medicament s’ha desenvolupat un programa d’investigació pediàtric acordat amb la EMA, idependentment de que, al final, s’obtingui o no la indicació en nens.
DESENVOLUPAMENT El problema es els pocs pacients que hi ha EMA diu que no t’obliga a utilitzar un disseny al assaig clínic: utilitzar dissenys que millor vagin EXEMPLES DISSENYS: - Creuats: Els mateixos pacients reben el tractament i el control.
Comparació Intraindividu - Un sol pacient: Rep alternativament en una seqüència aleatòria el tractament i el control i s’evaluen els resultats de cada un.
- Controls històrics: Administrar el tractament a tots els pacients inclosos i comparar el resultat amb pacients que van patir la malaltia i van ser seguits en un temps anterior.
No son els dissenys clàssics que es fan normalment, quan es te molta mes població CONDICIONS D’AUTORITZACIÓ - Normal Condicional: Quan les dades no són encara completes. El TAC està obligat a fer estudis addicionals i la autorització es renova anualment fins que s’hagin completat els estudis → llavors es passa a tenir una autorització Normal.
- Sota circumstàncies excepcionals: Quan el TAC pugui demostrar que no es possible subministrar dades completes sobre la eficàcia i la seguretat del medicament per al que es sol·licita autorització. La informació s’evalua anualment per revaluar el balanç benefici-risc.
89 CTRIGUERO SEGURETAT: El PRAC decideix quins medicaments orfes porten el triangle negre invertit (seguiment addicional) El que si hi ha son programes de seguiment post autorització El numero d’assignacions es molt mes gran que els que s’autoritzen per comercialitzar.
Exemple: Eculizumab ELEVAT PREU - Estratègies de Malalties Rares → hi ha un apartat sobre medicaments orfes Informes de Posicionament Terapèutic (IPT): valoren grau d’aportació terapèutica i si concorda amb el preu CONTRACTE DE RISC COMPARTIT Es pot aplicar a nivell de comunitat autònoma Quan ja es decideix preu, cada comunitat diu que paga en salud - Sobre resultats financers: Per exempe, les rebaixes de preu en funció del volum de consum o el establiment de un màxim de gest en el SNS i que el laboratori torni el que ho superi.
- Sobre resultats clínics: Jo et pago el medicament si obtinc resultats en el pacient L’elevat preu dels medicaments orfes els fa candidats als contractes de risc compartit que poden fer-se a nivell nacional, regional o de centre.
90 CTRIGUERO HEMATOPOIESIS Responsable de que en la medul·la òssia, que després de processos de diferenciació, maduració, etc. al final tenim uns nivells d’eritròcits, glòbuls blanc, plaquetes...
“Mecanisme fisiològic responsable de la formació continuada dels diferents tipus de cèl·lules hematopoètiques, que els manté dins dels límits de normalitat en sang perifèrica” Inclou: - Proliferació - Diferenciació - Maduració - Mobilització Es desenvolupa en medul·la òssia Hi ha diferents rutes a partir d’una cèl·lula mare totipotent - Ruta mieloide: a partir d’una cèl·lula germinal mieloide s’obtenen altres poblacions de cèl·lules formades de colònies (CFU), que donaran lloc a cèl·lules sanguines madures.
- Ruta limfoide - Ruta NK REGULACIÓ En l’home adult, a la medul·la òssia Mitjançant mecanismes de gran complexitat i mediats pels Factors de creixement hematopoietic (o factors estimulants de colònies (CSF)) i per factors inhibitoris.
FACTOR DE CREIXEMENT HEMATOPOIETIC = Factor estimulant de colònies - Un d’aquests factors es la ERITROPOETINA = EPO (és fisiològic) Si algu te insuficiència renal crònica, no podrien sintetitzar-la - Factor de creixement de colònies de granulòcits (G-CSF) Factors de creixement de colònies de macròfags-granulòcits (GM-CSF) Altres: - Factors de creixement de colònies de macròfags (M-CSF) - Tromobopyetina (TPO) - Etc NATURALESA: Glucoproteïnes: Es distingeixen per: - Seqüencia d’aa - Glucosilació (unió de carbohidrat) Tenen ponts disulfur entre cisteïna-cisteïna que confereixen una configuració tridimensional necessària per la activitat biològica.
El nom de cada factor deriva de la cèl·lula diana predominant.
91 CTRIGUERO →Eritropoetina Humana recombinant = MEDICAMENT Fisiologic: 92 CTRIGUERO FACTORS DE CREIXEMENT HEMATOPOÈTIC RECOMBINANT = medicament Producció: S’obtenen per tecnologia del DNA recombinant MEDICAMENT BIOTECNOLOGIC → Factors de creixement hematopoètics recombinants autoritzats a la UE: CSF de granulocits recombinants (rHuG-CSF) - Filgrastin - Pegfilgrastin - Lipegfilgrastin EPO humana recombinant (rHuEPO) - Eritropoetina humana recombinant o epoetina (alfa, beta, theta) - Epoetina beta peglida - Darbepoetina alfa Ex: filgrastin Molt semblant al fisiològic PEro ara ja no es efecte biològic, és efecte terapèutic (perquè és un medicament) Per pacients amb quimioteràpia-> es un coadjuvant, ajuda a que la quimio sigui efectiva Quimioterapia es mielosupressora-> provoca que puguin tenir infeccions i a més reducció i retas de la dosi (redueix efectivitat quimio) (esquema DIAPO) Filgrastin-> preveu infecció i evita tot això (tractament coadjuvant) + PEG= Pegfilgrastrin-> millor Lipegfilgrastim 93 ...

Comprar Previsualizar