TEMA 3. CONTROL TRANSCRIPCIONAL (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 32
Fecha de subida 15/11/2014
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 3: EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES II Els controls sobre l’expressió gènica poden ser de molts tipus: - Control transcripcional.
Control post-transcripcional.
Control post-traduccional.
CONTROL TRANSCRIPCIONAL Hi ha tres tipus: - Control per atenuació.
Control per alarmones i respostes globals.
Regulons i reguladors transcripcionals.
CONTROL PER ATENUACIÓ És un control que el que produeix és una terminació prematura de la transcripció. És un mecanisme que la cèl·lula utilitza quan nota que ja no necessita un determinat producte. Llavors deixa de transcriure els gens que el produïen.
- Control per atenuació dependent de traducció.
La zona implicada en l’atenuació s’ha de traduir.
Exemple 1: operó del triptòfan d’E. coli Aquest operó regula una unitat transcripcional que està formada per una sèrie de gens que codifiquen pels enzims necessaris per produir triptòfan. En una cèl·lula, quan les quantitats de triptòfan són altes, el transcrit que surt d’aquesta unitat transcripcional és curt, i no s’arriben a transcriure tots els gens que codifiquen per enzims per produir el triptòfan. Quan hi ha poc triptòfan a la cèl·lula, el transcrit és llarg, i sí que conté les regions codificants dels gens que codifiquen pels enzims que produeixen el triptòfan.
La qüestió d’això rau en quan podem parar la polimerasa.
La clau de tot el sistema es troba en una regió petita al costat de la regió promotora que rep el nom d’atenuador (per això es diu procés d’atenuació). En el cas de de l’operó triptòfan es tradueix el principi de la unitat, una regió molt petita que dóna lloc a un pèptid que s’anomena pèptid líder (pèptid trpL). Fins ara no s’ha descrit que aquest pèptid tingui alguna funció fora del procés d’atenuació. Al final de la seva seqüència, aquest pèptid incorpora dos triptòfans.
El triptòfan és un aminoàcid que s’utilitza poc en les proteïnes, per tant que el pèptid líder tingui dos triptòfans, i que a més estiguin seguits, sent tant petit és massa coincidència.
Dins la regió líder de al unitat transcripcional hi ha quatre regions palindròmiques entre elles. La regió 1 i 2 es poden plegar formant un loop, i també ho pot fer la 2 amb la 3, i la 3 amb la 4. És important veure que la regió palindròmica 1 coincideix amb la regió codificant pel pèptid líder.
La gràcia de la història està en que no tots els loops són iguals. El 3-4 acaba amb una estructura amb moltes UUUUU, això vol dir que és un loop terminador (el que fa és acabar la transcripció amb un mecanisme rho-independent).
En canvi, els loops 1-2 i 2-3 no tenen estructura de terminador, de manera que la RNApolimerasa no es veu afectada si aquests loops es formen. La RNA-polimerasa només es separa del DNA que està traduint si es forma el loop 3-4.
Què és el que fa que el loop 3-4 es formi o no? El sistema depèn de la presència de ribosomes en el transcrit. La RNA-polimerasa produeix l’RNA: llavors al principi es forma el loop 1-2. Això fa que la RNA-polimerasa vagi una mica més lenta, perquè un loop obstrueix una mica la sortida de RNA de dins seu, però continua, fins que surt de la RNA-polimerasa la regió RBS del pèptid líder.
Un ribosoma s’uneix a aquesta RBS i comença a traduir el transcrit que donarà lloc al pèptid líder. Si la concentració de triptòfan a la cèl·lula és alta, el ribosoma no tindrà cap problema per carregar dos tRNAs que tinguin triptòfan (recordem que el pèptid líder tenia dos triptòfans seguits), i podrà produir de forma normal aquest pèptid. Quan el ribosoma ha acabat de traduir el pèptid sense cap dificultat, arriba al codó stop i es desenganxa del RNA. Llavors queden lliures les dues regions 1 i 2, i formen un loop. En formar-se aquest loop, el 2-3 ja no es pot formar, així que s’acaba formant el 3-4. Llavors la transcripció s’acaba aquí, perquè aquest loop col·lapsa la RNA-polimerasa i no es transcriuen la resta de gens de la unitat transcripcional.
Si la concentració de triptòfan és baixa, al ribosoma que ha començat a traduir el pèptid líder li costarà trobar un tRNA carregat amb triptòfan, de manera que anirà més lent i es passarà més estona unit a la regió codificant pel pèptid, que és la mateixa que la regió palindròmica 1. Passarà suficient estona en aquesta regió com perquè ja hagin sortit del ribosoma les regions 2 i 3 i formin un loop. Llavors no es pot formar el loop 3-4, i la transcripció no s’acaba. La transcripció continua i es tradueixen els enzims necessaris per produir triptòfan, ja que justament la cèl·lula no en té.
Aquest mateix sistema també es troba en mols altres operons d’unitats transcripcionals relacionades amb la síntesi d’aminoàcids. Per exemple el pèptid líder de l’operó fenilanina té moltes fenilanines. I en els altres pèptids passa el mateix: Exemple 2: operó bgl (degradació β-glucòsids) Aquest forma part d’un conjunt de mecanismes d’atenuació dependents de traducció que presenten antiterminators (eviten l’acció del terminador).
La cèl·lula no produeix els enzims implicats en la degradació de β-glucòsids si no hi ha βglucòsids. I si n’hi ha però hi ha altre glúcids que donen més energia tampoc els produirà.
Quan no hi ha β-glucòsids a l’entorn de cultiu (medi que envolta els bacteris), la proteïna BglG (codificada pel gen bglG) es troba fosforilada en quatre punts. Llavors no passa res, ens trobem en una situació tranquil·la.
En l’operó hi ha dos terminadors transcripcionals al principi de la unitat transcripcional. Són zones que en el transcrit formaran loops que faran que la RNA-polimerasa es desuneixi del DNA.
En la situació “tranquil·la” que hem descrit, llavors, potser tindrem un transcrit fins al primer terminador, i com a molt fins al segon. Això vol dir que no es transcriuran els gens implicats en la degradació dels β-glucòsids.
Quan hi ha β-glucòsids hi ha una proteïna a la membrana que els incorpora a la cèl·lula. Però per poder incorporar qualsevol tipus de glúcids, aquests han d’estar fosforilats. La proteïna BglG, que tenia quatre fosfats (dues per cada subunitat) en perd un de cada subunitat i els dóna a la proteïna transportadora de la membrana. Aquesta els fa servir per fosforilar els β-glucòsids i que pugin entrar a la cèl·lula. Quan les dues subunitats de la proteïna BglG perden un fosfat cada una dimeritzen.
Quan està en conformació de dímer, la BglG és un antiterminador, perquè s’uneix al DNA i reconeix terminadors transcripcionals i, tal i com fa el ribosoma quan tradueix, s’uneix a la regió en la que es forma el loop de RNA i impedeix que es formi. Com el loop antiterminador no es pot formar, la transcripció no s’acaba i es produeix un transcrit llarg, que conté les regions codificants dels gens implicats en la degradació dels β-glucòsids, que justament és el substrat que s’està incorporant de forma massiva a la cèl·lula.
Els dos fosfats amb els que es queda la proteïna BglG ajuden aquesta a reconèixer si hi ha altres glúcids a la cèl·lula que es puguin fer servir en comptes dels β-glucòsids. Si n’hi ha d’altres, s’utilitzaran aquests abans que els β-glucòsids.
- Control per atenuació independent de traducció En aquest cas no és necessari que la zona implicada en l’atenuació es tradueixi.
Exemple 1: operó triptòfan de B. subtilis Tal i com passava en E. coli s’ha d’atenuar, i en els dos casos la presència de loops és important, però en aquest cas el sistema és diferent.
No hi ha pèptid líder, sinó una proteïna que es diu TRAP. La proteïna TRAP reconeix al regió líder del mRNA i s’hi uneix. La presència de TRAP indica que la cèl·lula té molt de triptòfan.
Quan TRAP s’uneix es forma el loop terminador, ja que les altres regions palindròmiques no les deixa lliures. Llavors no es transcriuen els gens que codifiquen per proteïnes per a la producció de triptòfan.
Si la proteïna TRAP no té triptòfan no és capaç de reconèixer la zona líder del mRNA on s’ha d’unir, i llavors no es forma el loop terminador. La RNA-polimerasa continua transcrivint i els gens que codifiquen pel enzims de producció de triptòfan s’expressen, que justament és el que es necessita, ja que la cèl·lula té deficiència d’aquest aminoàcid i per això TRAP no en tenia.
A més una cèl·lula es pot trobar en una situació més “estranya”: pot ser que hi hagi molt triptòfan però que les seves necessitats d’aquest aminoàcid siguin tant altes que el triptòfan existent no les cobreixi. Llavors s’ha de produir més triptòfan. Per això hi ha la proteïna antiTRAP. Aquesta s’uneix a TRAP quan té molt triptòfan en el seu interior, i evita que pugui interaccionar amb el mRNA.
Anti-TRAP es sintetitza quan hi ha tRNAs que tenen el codó del triptòfan però en realitat no estan carregats amb aquesta aminoàcid. Això vol dir que la cèl·lula està consumint molt triptòfan, i encara que n’hi hagi se’n necessita més.
Tant en bacteris grampositius com en bacteris gramnegatius el que importa és al presència de tRNAs de triptòfan buits.
Exemple 2: síntesi de l’aminoacil tRNA sintetasa Tyr a B. subtilis Aquest enzim és l’encarregat de carregar els aminoàcids als tRNAs. Reconeix el codó de cada tRNA i llavors sap l’aminoàcid que ha de carregar a la regió específica de càrrega d’aminoàcids.
Trobarem aquest enzim a la cèl·lula si hi ha tRNAs buits.
En aquest cas, en la unitat transcripcional que té els gens que codifiquen pels enzims que produeixen l’aminoacil tRNA sintetasa també trobem que el transcrit té dos loops terminadors.
Però ara la molècula que interacciona amb el mRNA i desfà els loops perquè es pugui continuar transcrivint la unitat és directament el tRNA.
Quan els tRNAs de la cèl·lula no tenen aminoàcids carregats, la seqüència on s’han de carregar aquests té homologia amb un loop de la regió líder de mRNA. Quan es forma aquest loop, no es pot formar el loop terminador, així que la unitat transcripcional es transcriu.
En comptes, quan els tRNAs estan carregats, la seqüència ja no s’uneix per homologia amb la regió líder, així que no es forma el loop d’abans i es pot formar el loop terminador. Llavors no hi ha transcripció.
Si el mRNA té Tbox vol dir que la unitat transcripcional està regulada per tRNAs, perquè és una regió conservada complementària dels tRNA.
L’operó triptòfan de Lactococcus també funciona així. Quan no hi ha triptòfan el tRNA no està carregat i fa que es formi un loop a la regió líder que evita que es formi el loop terminador: Exemple 3: Regulació síntesi de metionina En aquest cas el control depèn d’un riboswitch. Aquestes molècules estan formades per metabòlits units a mRNA, i s’encarreguen de formar els loops terminadors o de no formar-los.
La metionina s’uneix al mRNA i fa que aquest agafi una conformació diferent. Un riboswitch pot ser un nucleòtid, un aminoàcid, un glúcid... qualsevol metabòlit que canviï la conformació de la regió líder del mRNA per fer que es transcrigui o no.
Les respostes del mRNA al riboswitch són molt més ràpides que en els altres casos d’atenuació, ja que en aquest mecanisme no s’han de crear senyals, detectar-los i transmetre’ls a nivell gènic, ja que la molècula que es vol regular és la que actua directament sobre el mRNA.
CONTROL PER ALARMONES I RESPOSTES GLOBALS Què són les alarmones? Són molècules no proteíniques de baix pes molecular que estan involucrades en la regulació gènica. Tant la síntesi com la degradació de les alarmones estan catalitzades enzimàticament de manera que els seus nivells intracel·lulars poden ser alterats ràpidament en resposta a estímuls externs.
És a dir, segons els senyals externs que rep, la cèl·lula sintetitza o degrada alarmones.
Hi ha quatre alarmones: - ppGpp: tetrafosfat de guanosina.
cAMP: AMP cíclic.
Di-c-GMP: diguanilat cíclic.
Lactones.
- ppGpp: tetrafosfat de guanosina També s’anomenava Magis Spot perquè es van fer estudis d’extractes de cèl·lules que passaven d’un medi ric a un medi mínim. En fer aquest canvi deixaven d’expressar uns gens i n’expressaven més uns altres. Això es va veure que estava regulat per una molècula que apareixia i desapareixia cada cop que es canviava de medi. Per això se li va dir Magic Spot, perquè apareixia, després desapareixia, després tornava a aparèixer...
ppGpp actua en el metabolisme anabòlic (síntesi de noves molècules que la cèl·lula ha de sintetitzar per viure en un nou entorn). Per tant està relacionada amb els operons que codifiquen per les proteïnes necessàries per sintetitzar aminoàcids, nucleòtids, lípids... i qualsevol compost necessari perquè la cèl·lula sobrevisqui en un medi nou.
En resum, el que fa ppGpp és unir-se a la RNA-polimerasa canviant el patró de reconeixement dels promotors i modulant l’expressió gènica. Ara explicarem com ho fa.
ppGpp regula la resposta astringent. Aquesta resposta apareix quan la cèl·lula passa d’unes condicions molt òptimes a unes que no ho són gaire (de medi ric a medi mínim). És una resposta a una situació de crisi en la que s’han de fer “retallades” en el funcionament de la cèl·lula: en estar en un medi pobre ara s’han de racionalitzar molt bé els recursos que té, dedicant energia i recursos exclusivament a allò que sigui necessari sintetitzar.
Les respostes astringents es disparen quan passem d’un medi ric a un medi mínim, i també es disparen en absència del compost auxotròfic per una cèl·lula (si una cèl·lula té una auxotròfia d’una aminoàcid vol dir que no pot sintetitzar aquest aminoàcid, i per tant és necessari que aquest estigui en el medi per a què la cèl·lula es pugui desenvolupar). Per exemple, una cèl·lula ThyA- és auxòtrofa per la timina, perquè no la pot sintetitzar i necessita incorporar-la del medi.
Una cèl·lula auxòtrofa pel triptòfan activarà la resposta astringent quan en el medi no hi hagi triptòfan.
En què consisteix la resposta astringent? Es produeix ppGpp, i aquesta alarmona és el senyal perquè es bloquegi al síntesi de totes les proteïnes. Quan la producció de proteïnes ha parat, la cèl·lula pot reorganitzar els recursos: sobretot ara se’n dediquen a sintetitzar aminoàcids i a degradar proteïnes que no serveixen per res (això també és una font d’aminoàcids). També es disminueix la producció de ribosomes, per tenir els justos per produir les proteïnes necessàries, però no més.
A part de tot això augmentarà l’expressió dels gens anabòlics. L’únic que disminuirà és la producció de ribosomes.
Cicle del ppGpp: La cèl·lula controla la síntesi i la degradació d’alarmones. Les sintetitza ràpidament quan es troba en un medi mínim, i les elimina també ràpidament quan el moment crític ha passat.
En condicions d’estrès, a la cèl·lula trobem que hi ha SpoT, que és una proteïnes que genera ppGpp fosforilant les guanines amb fosfats provinents d’ATP. Quan no hi ha aminoàcids, RelA fa el mateix.
Quan la cèl·lula ja no està en una situació d’estrès, SpoT pot eleimnar els fosfats de ppGppi recuperar la guanina amb dos o tres fosfats (GDP o GTP). Aquest pas només el pot fer SpoT, no RelA.
Com es forma ppGpp? En una situació normal, els ribosomes de la cèl·lula van traduint, però arriba un moment en que la concentració d’aminoàcids ha disminuït massa.
Llavors hi ha bastants tRNAs que no estan carregats amb aminoàcids. Els ribosomes intenten incloure aquests tRNAs, però en veure que no porten cap aminoàcid els tornaran a deslliurar i quedaran parats sobre el mRNA fins a trobar un tRNA carregat.
Per tant quan falten aminoàcids els ribosomes van més lents o directament s’aturen. Això ho reconeix RelA (pot reconèixer tant l’alentiment dels ribosomes com tRNAs buits). RelA s’uneix als ribosomes, s’activa i comença a produir ppGpp.
Després de la resposta astringent ja hi haurà aminoàcids, així que es podran unir als ribosomes, aquests avançaran i ja no aniran lents. Llavors RelA se n’anirà dels ribosomes i no es produirà més ppGpp.
Mecanisme d’actuació de ppGpp: Té efectes directes i indirectes.
- Primer efecte directe: acció sobre l’accès de NTPs a la RNA-polimerasa.
La primera cosa que passa és que ppGpp, que és un ribonucleòtid, i per tant estaria destinat a entrar dins una RNA-polimerasa perquè aquesta el fes servir per sintetitzar mRNA. Però el fet de tenir 4 fosfats fa que quan entra dins aquest enzim fa com un tap i obtura el canal d’entrada de més nucleòtids. Això fa que ara els nucleòtids tinguin dificultats per entrar i que llavors la RNA-polimerasa disminueixi la seva velocitat, la qual cosa fa que se separi del DNA i s’aturi la seva transcripció. Amb això també s’atura la producció de proteïnes a tota la cèl·lula.
- Segon efecte directe: modulació del reconeixement de la regió promotora.
Després de separar totes les RNA-polimerases dels gens que estaven transcrivint, aquestes s’han de tornar a unir amb subunitats σ per poder tornar a començar la transcripció. ppGpp interactua amb un determinat tipus de subunitats σ, que llavors aconsegueixen tenir una unió molt forat amb el nucli de la RNA-polimerasa.
ppGpp s’uneix a una proteïna DksA, i aquesta, que es troba dins la RNA-polimerasa, afavoreix l’entrada de determinades subunitats σ, que afavoriran més uns promotors que uns altres. Això determinarà quins promotors es transcriuran més, i quins gens estaran més afavorits en aquestes situacions. Estaran afavorits els promotors de gens relacionats amb l’anabolisme de lípids, aminoàcids... I no estaran gens afavorits els promotors de gens que codifiquen per ribosomes.
- Primer efecte indirecte: augment de al disponibilitat de RNA-polimerasa.
Sense ppGpp els promotors forts tindran moltes RNA-polimerases transcrivint els seus gens, mentre que altres promotors no en tindran tantes. En el següent esquema podem veure que Prrn és el promotor de ribosomes, i Paa el d’aminoàcids. ppGpp fa que al principi la RNApolimerasa es desenganxi de tots els gens, i llavors canvien les subunitats σ fent que ara tinguin afinitat pels promotors dels gens que interessen, els d’anabolisme d’aminoàcids.
Aquí em de recordar que en els operons de rrnB també hi ha regions de discriminació ppGpp, que feien que es deixessin de sintetitzar rRNAs.
- Segon efecte indirecte: disminució de GTP.
Per produir RNAs és necessari tenir GTP. Com en les respostes astringents les guanines s’utilitzen per formar ppGpp i no GTP, no es podran produir RNAs.
Les guanines són els nucleòtids, juntament amb les adenines, amb els que normalment comencen els transcrits. Els transcrit que tinguin a la posició més una G, ara tindran una producció més lenta, perquè és difícil trobar GTP a la cèl·lula.
A la cèl·lula hi ha molts gens que comencen per G. Aquest fet ha estat evolutivament afavorit perquè precisament aquesta pausa que ha de fer la RNA-polimerasa per trobar un GTP té una funció en la resposta astringent.
- Tercer efecte indirecte: modulació de l’estabilitat de subunitats σ.
En una situació normal, en una cèl·lula les subunitats σ sempre s’estan sintetitzant i degradant equilibradament.
En al resposta astringent s’activa un promotor d’una proteïna que segresta la proteïna RssB (aquesta era la responsable de fer que es degradés un determinat tipus de subunitat σ). Llavors la concentració d’aquest determinat tipus de subunitat σ augmentarà respecte dels altres tipus, perquè tardarà més a ser degradada. Llavors s’expressaran més els gens que tinguin promotors òptims per aquest tipus de subunitat σ (gens implicats en l’anabolisme d’aminoàcids, lípids, nucleòtids...).
DUBTE!! – Si ppGpp bloquejava l’entrada de ribonucleòtids a la RNA-polimerasa com pot ser que després pugui transcriure? El que feia que les RNA-polimerases es desenganxessin dels gens que estaven traduint era que de sobte reduïen molt la seva velocitat a causa de que ppGpp obstruïa l’entrada de ribonucleòtids a l’enzim i llavors anaven més lentes. El que fa que la transcripció s’acabi és al reducció sobtada de velocitat, però això no vol dir que els ribonucleòtids no pugin entrar de cap manera a la RNA-polimerasa, simplement que ho tenen més difícil que abans i per això van més lents.
Després d’això, quan les RNA-polimerases tornin a començar a transcriure, des d’un principi ja aniran més lentes perquè ja tindran ppGpp, i no hi haurà cap disminució de la velocitat de transcripció, per tant no es pararà.
ppGpp també funciona com un senyal per activar altres sistemes. Per exemple, si la cèl·lula està en un entorn amb pocs nutrients, està bé sintetitzar antibiòtics per lluitar contra bacteris perquè aquests no li treguin el menjar.
També està bé que s’activin sistemes de latència, ja que potser s’acaben els recursos i s’ha d’entrar en un període d’aquest tipus.
També pot ser que s’activi el biofilm (forma de resistència) o que es tornin més virulents perquè es troba en un espai on els nutrients estan segrestats.
La Salmonella entèrica pot viure dins de macròfags, però allà no hi té nutrients. Això fa que s’activi una resposta astringent dins seu. Per aquest organisme el fet de notar que no hi ha nutrients vol dir que està dins un macròfag, llavors uns dels mecanismes que també s’activaran en la resposta astringent seran els mecanismes de patogenicitat.
- cAMP: AMP cíclic Promou l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme catabòlic. Per passar d’ATP a AMPc hi ha un enzim que s’anomena adenilat-ciclasa.
El control que fa el cAMP s’anomena repressió per catabòlit. Això vol dir que les cèl·lules, primer de tot, sempre degradaran la glucosa (ja que és el nutrient que els aporta més energia). Quan s’ha degradat la glucosa, la cèl·lula començarà a degradar altres sucres. Per tant hi ha d’haver un control sobre la síntesi d’enzims de la cèl·lula: primer només s’han de sintetitzar aquells relacionats amb la degradació de la glucosa, i després els relacionats amb la degradació d’altres sucres. D’aquest control és encarregat el cAMP.
La cèl·lula ha de regular la síntesi dels enzims relacionats amb la degradació dels sucres. D’alguna manera ha de rebre i transmetre senyals que informin de que primer s’han de sintetitzar els enzims per degradar la glucosa, i després enzims per degradar els altres sucres.
Perquè la cèl·lula pugui crear aquests senyals, primer ha de detectar si hi ha glucosa a la cèl·lula.
Quin és el senyal que la cèl·lula detecta i que fa que sàpiga la disponibilitat de glucosa? El cAMP.
Quan la cèl·lula detecti el cAMP activarà tot un sistema.
Explicació del gràfic: Aquest gràfic ens mostra la quantitat de βgalactosidasa present en un cultiu. Veiem com augmenta la quantitat quan al cultiu no afegim glucosa (no additions), perquè llavors ha de treure l’energia de la lactosa i per tant necessita aquest enzim per degradar-la.
Si afegim glucosa al cultiu, es para la síntesi de β-galactosidasa, perquè primer degradarà la glucosa. Al cap d’una estona, quan s’hagi acabat la glucosa, tornarà a expressar els gens per degradar altres sucres com la lactosa, i tornarà a sintetitzar βgalactosidasa.
Però veiem que si afegim cAMP, a més de glucosa, l’expressió de la β-galactosidasa és com si no hi hagués glucosa. Per tant arribem a la conclusió que quan hi ha cAMP la cèl·lula entén que no hi ha glucosa.
Relació entre cAMP i glucosa: Qualsevol sucre (com la glucosa) quan entre a l’interior de la cèl·lula ho fa en forma de sucrefosfat. Qui dóna aquest fosfat? El PEP (fosfoenolpiruvat) fosforila l’enzim I, i aquest al seu torn passa el fosfat a la proteïna rica en histidina, i aquesta el passa a la proteïna IIA, que és una proteïna molt important en aquest sistema. La proteïna IIA passa el fosfat a la proteïna IIB. Aquesta forma part del complex proteic encarregat de fer entrar la glucosa dins la cèl·lula (juntament amb l’enzim IIC), i és la proteïna que s’encarrega de passar-li el fosfat a la glucosa.
La proteïna IIA acaba donant el fosfat a la glucosa sempre que hi hagi aquest substrat. Si no hi ha glucosa, dóna el fosfat a l’adenilat-ciclasa, perquè aquest enzim pugui produir cAMP. Per tant quan hi ha glucosa al medi de cultiu, l’enzim IIA té més afinitat per l’enzim IIB, de manera que el fosfat acaba a al glucosa. En comptes, si no hi ha glucosa al medi de cultiu, l’equilibri es desplaça cap a l’altra banda i la proteïna IIA ja no té tanta afinitat amb la IIB, però com necessita donar el fosfat a alguna molècula perquè ella està inestable, el dóna a l’adenilat-ciclasa.
En resum, si no hi ha glucosa al medi de cultiu, es produiran altes concentracions de cAMP.
Però el cAMP sol no canvia el patró d’expressió dels gens. Per fer això necessita associar-se amb la proteïna CRP (o CAP). Ara, el complex cAMP-CRP pot interactuar amb el DNA, i activar una sèrie de gens. Activarà els gens relacionats amb la degradació d’altres sucres, com ara l’operó lactosa.
L’operó lactosa, en principi pot estar en dues situacions: que hi hagi lactosa al medi i que no.
Quan no hi hagi, tindrà una expressió basal, i quan hi hagi, tindrà una expressió alta. A més, pot ser que hi hagi glucosa en el medi.
Si no hi ha glucosa és el cas que acabem de descriure. Es forma el complex CRP-cAMP, que potencia la transcripció de l’operó lactosa. En el cas que tampoc hi hagi lactosa, com hi haurà un repressor unit a l’operó, l’expressió serà basal. En el cas que hi hagi lactosa, l’expressió serà alta perquè a part de que l’operó no estarà controlat pel repressor el complex CRP-cAMP potenciarà la transcripció d’aquest.
Si hi ha glucosa però no hi ha lactosa, l’operó tindrà els repressors units i a més no hi haurà el complex CRP-cAMP, per tant l’expressió serà encara més baixa que la basal. Si hi ha glucosa i lactosa, l’operó no tindrà els repressors però no hi haurà el complex CRP-cAMP, per la qual cosa hi haurà igualment poca transcripció, només una mica més que la basal.
L’acció que té el complex CRP-cAMP sobre l’operó és el següent. El complex no pot interaccionar en tots els llocs, sinó que interacciona només en unes caixes CRP. Quan s’ha unit a aquestes caixes, actua com un activador transcripcional, doblega el DNA de manera que ensenya més al regió promotora i facilita l’accés de la RNA-polimerasa.
També interacciona amb una subunitat de la RNA-polimerasa i li mostra on està la regió -10 del promotor perquè s’hi uneixi.
Exemples de gens regulats pel complex CRP-cAMP: Quins són els gens regulats per aquesta alarmona? Els implicats en la degradació de sucres, aminoàcids, β-glucòsids, nucleòtids... Tots aquests gens estan inhibits en presència de glucosa.
Per exemple també s’inhibeixen en presència de glucosa els gens implicats en la respiració.
També estan regulats per CRP-cAMP alguns gens relacionats amb resistències antibiòtiques, ja que estar en un medi sense glucosa vol dir estar en un medi on s’ha de competir pels recursos.
A més, el propi complex CRP-cAMP inhibeix la síntesi de més AMPc. És com una autoregulació. Hem de tenir en compte que la cèl·lula no pot destinar tota la seva adenina a crear cAMP, la cèl·lula també necessita ATP.
No tots els bacteris són iguals. A nivell molecular la resposta es pot orquestrar de maneres molt diferents.
Repressió per catabòlit a Bacillus El sistema de com es passa el fosfat a la glucosa, i l’entrada d’aquesta a la cèl·lula és igual, però el senyal és diferent.
En aquest cas l’alarmona que s’encarregarà de determinar la presència de glucosa serà la fructosa-1,6-bifosfat. Aquesta es forma quan es va degradant la glucosa en la glucòlisi. La fructosa-1,6-bifosfat, més les proteïnes riques en histidines, més la proteïna d’ancoratge equivalent a CRP formen un complex que farà de repressor sobre els gens associats al metabolisme catabòlic.
En aquest cas el sistema funciona a la inversa. Com l’alarmona augmenta amb la concentració de glucosa, ara el complex fa de repressor.
Repressió per catabòlit a Pseudomonas putida Pseudomonas és un microorganisme respirador de succinats i acetats. No tots els microorganismes tenen la glucosa com la seva font de carboni predilecta. Si són unes altres, com el cas de les Pseudomonas, les alarmones seran unes altres.
En aquest gènere és el modulador CRC el que s’encarrega del bloqueig de la traducció de gens de transport d’altres sucres si existeixen succinat i acetat al medi.
- Lactones: quòrum sensing El quòrum sensing és la comunicació entre bacteris. Els bacteris d’un mateix medi es relacionen entre elles, “parlen” a través de molècules. Uns deixen anar uns compostos que reben els altres, i aquests que els han rebut responen d’una manera determinada.
El fet que tots els bacteris d’un medi rebin les mateixes molècules i efectuïn la mateixa resposta s’anomena: actituds poblacionals de cultiu.
Ex: el comportament de les cèl·lules en funció de la densitat cel·lular. Les cèl·lules segreguen de forma constant una determinada molècula a l’exterior. La concentració d’aquesta molècula serà més gran quan hi hagi moltes cèl·lules al cultiu. Llavors les cèl·lules seran sensibles a aquestes molècules i actuaran totes d’una determinada manera. En aquest cas l’alarmona és la molècula que se segrega a l’exterior.
Les molècules estrella del quòrum sensing són les lactones, encara que diverses molècules d’aquest estil estan implicades en aquest tipus de resposta.
- Di-c-GMP: diguanilat cíclic Hi ha un altre nucleòtid, la guanina, que pot estar ciclat dues vegades per un enzim GGDEF, i llavors s’aconsegueix el di-c-GMP. Aquesta molècula és una alarmona per moltes senyals relacionades amb el quòrum sensing: la motilitat, la virulència, la creació d’un biofilm, la progressió del cicle cel·lular... S’ha observat que molts bacteris que es comuniquen per quòrum sensing tenen di-c-GMP.
Hi ha molts receptors i molècules que afecten a la concentració de di-c-GMP, i aquesta afecta alhora a reguladors transcripcionals que afecten al patró de funcionament de tota la cèl·lula.
REGULONS I REGULADORS TRANSCRIPCIONALS Un reguló està format per tot el conjunt de gens que estan sota el control d’un mateix regulador.
Una de les proteïnes regulades per aquest regulador (ex: proteïna B) pot ser alhora un regulador i per tant crear un altre reguló, per tant hi ha cascades de regulació.
Els gens regulats per la proteïna B es diria que formen del reguló general, però també part del reguló de la proteïna B. Aquest reguló general també es pot dir moduló.
Hi ha estímuls que arriben de fora la cèl·lula i afecten certs reguladors, de manera que afecten a l’expressió dels seus regulons. Si mirem els gens que s’activen o es reprimeixen després de que es rebi un estímul, és a dir la resposta de la cèl·lula a aquest estímul, tot això serà l’estimuló.
L’estimuló és el conjunt de gens que s’activen o s’inactiven en funció de l’estímul i els seus productes. Per tant, l’estimuló pot comprendre més d’un moduló o un reguló, és més gran.
A més, hem de tenir en compte que els estimulons i els regulons poden solapar-se entre ells, ja que un gen pot estar regulat per dos reguladors.
Els senyals són detectats per les cèl·lules per sistemes de dos components: - - Component de membrana: pot ser una proteïna o un complex de proteïnes. És la proteïna receptora, la que detecta la senyal. Quan hi ha un senyal, el transmet a dins la cèl·lula modificant un efector que hi ha al citosol.
Efector: transmet la senyal des del receptor de la membrana fins als gens. Ho fa en forma de cascada de fosforilacions. A vegades, l’efector pot ser ja un regulador transcripcional, però normalment hi ha una cascada de fosforilació (de més o menys passos) que acaba activant el regulador.
Les proteïnes que formen part dels sistemes de dos components normalment tenen un domini receptor i un altre efector. Cada component pot estar format per una subunitat o més.
Hi ha repressors transcripcionals i activadors. Els repressors inhibeixen la RNA-polimerasa actuant sobre el promotor. Els activadors estimulen la RNA-polimerasa.
A la regió up-stream normalment s’hi ancoren els activadors, i en la down-stream els repressors.
Les regions operadores són els llocs d’ancoratge dels repressors. Els operons poden ser tant per activadors com per repressors. A vegades hi ha proteïnes que poden actuar tant com a activadors com a repressors, ja que segons on s’uneixin del DNA (si tenen capacitat de reconèixer diferents seqüències) creen una torsió del DNA bona o dolenta perquè s’hi uneixi la RNA-polimerasa.
- Activadors.
Totes les proteïnes que estimulen l’expressió són activadors. Hi ha l’activació simple, quan l’activador s’uneix a l’operó i fa que es transcrigui, i la coactivació, quan un activador atrau a un altre perquè sense tots dos alhora no es pot estimular l’expressió.
Un activador pot tenir un paper “dual”: La proteïna que s’expressa gràcies a un activador, pot ser ella mateixa l’activador d’un altre gen, però també pot ser un repressor! Llavors, en el segon cas, si observéssim globalment l’efecte del primer activador, ens podria semblar que actua com un repressor, ja que no veiem els passos del mig. Però és un activador, el que passa és que activa la transcripció d’un repressor, no ens deixem enganyar! Recordem que els activadors només són activadors si es col·loquen al lloc que toca del DNA i donen la curvatura ideal al promotor, perquè s’hi pugui unir amb facilitat la RNA-polimerasa.
- Repressors.
Els repressors tenen diversos mecanismes d’acció: - Directament poden bloquejar la regió -10 o la -35, i així no deixen que s’hi uneixi la RNApolimerasa.
Poden unir-se en altres regions que no siguin cap d’aquestes dues però que creïn un plegament del DNA que no permeti a la RNA-polimerasa unir-s’hi.
Poden no reconèixer el DNA, però reconèixer i unir-se a proteïnes que estiguin unides al DNA (com activadors). Aquestes proteïnes estaven intentant posar el DNA en una torsió òptima perquè la RNA-polimerasa s’hi unís, i ara els repressors evitaran això.
- Tipus de control transcripcional.
El control negatiu és aquell en el que participa un repressor, i el positiu és aquell en el que participa un activador. En els dos casos hi pot haver un increment o una disminució de la producció gènica.
A més, parlem de control per inducció quan hi ha una proteïna, l’inductor, que s’uneix al repressor o a l’activador i fa que hi hagi transcripció (és a dir, en els repressors els separarà del DNA i en els activadors farà que s’uneixin). I parlem de repressió quan hi ha una proteïna, el corepressor, que s’uneix al repressor fent que aquest s’uneixi al DNA, o s’uneix a l’activador fent que aquest se separi del DNA, i llavors no hi hagi transcripció (o si n’hi hagi, però sigui basal).
En el control per inducció, la presència de l’inductor fa que hi hagi una expressió elevada, i si no hi és hi ha una expressió basal. En el control per repressió, la presència del co-repressor fa que hi hagi una expressió basal, i la seva absència fa que hi hagi una expressió elevada.
El fet de que els activadors i els repressors es desuneixin o s’uneixin al DNA quan hi hagi un inductor o un co-repressor s’explica perquè aquests últims, quan s’uneixen als repressors o als activadors, fan que pateixin canvis conformacionals, i que llavors ja no tinguin afinitat per les seqüències, o que en tinguin per unes altres.
Pot ser que el control negatiu amb co-repressor i el control positiu amb inducció sigui el mateix, si la proteïna és la mateixa, i quan té el co-repressor/inductor fa d’activador en uns gens i de repressor en uns altres.
Fins i tot pot ser que una mateixa proteïna sigui de control negatiu amb inducció i de control positiu amb inducció, si el que passa és que quan l’inductor s’uneix al repressor aquest té un canvi conformacional que fa que passi a reconèixer diferents seqüències del mateix operó però que en aquest cas funcioni com un activador. De la mateixa manera, una proteïna també pot participar alhora en el control negatiu per repressió i el control positiu per repressió.
OPERONS BACTERIANS Els catabòlics són els que tenen gens que codifiquen per enzims que participen en la degradació de compostos per obtenir energia. Els anabòlics són els que tenen gens que codifiquen per enzims que participen en la síntesi de productes.
Els operons catabòlics estan sota el control de la repressió per catabòlit, és a dir, estan controlats per CRP-cAMP. Per tant aquí parlaríem del moduló del CRP-cAMP, i l’estimuló seria l’estimuló de la glucosa.
Els operons anabòlics estan sota el control de la resposta astringent, és a dir, estan controlats per ppGpp. En aquest parlem del moduló del ppGpp, i per parlar de l’estimuló hauríem de dir que és l’estimuló de “la falta dels recursos òptims”.
OPERÓ LACTOSA Té un control negatiu per inducció. És un operó catabòlic, perquè codifica per enzims que degraden la lactosa, les β-galactosidases.
Per tant, l’operó lactosa és l’operó encarregat de la degradació de la lactosa. Té 3 cistrons en la unitat transcripcional: lacZ, lacY i lacA.
Hi ha un altre cistró, però que no es troba en la unitat transcripcional policistrònica. És el lacI, que codifica pel repressor transcripcional.
- lacZ: codifica per la β-galactosidasa. Aquest és l’enzim que separa la lactosa en galactosa i glucosa.
lacY: codifica per la permeasa que permet entrar la lactosa a la cèl·lula.
lacA: codifica per una acetilasa que no se sap ben bé quina és la seva funció. Si s’elimina no afecta al funcionament de la degradació de la lactosa.
Aquesta unitat policistrònica està regulada per un promotor que té una regió operadora.
L’operador és la caixa on interacciona el repressor transcripcional. L’operador també es pot anomena lacO.
En l’absència de lactosa, el LacI (repressor sintetitzat per lacI) s’uneix al DNA en lacO. Llavors la RNA-polimerasa s’unirà al promotor però no podrà transcriure. Hi ha un equilibri d’unió del repressor amb el DNA. Quan el repressor està unit a l’operador, el nivell de transcripció és basal, i hi ha una expressió basal de la proteïna.
Quan hi ha lactosa al medi i aquesta entra a la cèl·lula, s’uneix al repressor i fa que aquest pateixi un canvi conformacional, i ara no es pugui unit a lacO. Llavors ara la unitat transcripcional policistrònica es pot transcriure lliurement, hi ha molt transcrit i una alta producció de proteïna LacZ, LacY i LacA.
Llavors, com ara hi ha més permeases, la lactosa entra en quantitats massives dins la cèl·lula, i la β-galactosidasa l’hidrolitza. Quan s’ha degradat tota la lactosa, el repressor torna a la conformació normal perquè ja no té lactosa unida, es torna a unir a lacO i un altre cop la transcripció torna a estar a nivells basals.
Hi ha un anàleg de la lactosa, l’IPTG, que no és hidrolitzable per la β-galactosidasa. Però sí que pot interaccionar amb el repressor, així que sempre està unit al repressor perquè no s’hidrolitza mai, i permet que sempre hi hagi expressió alta de l’operó lactosa.
Això no té cap funció en la cèl·lula, de fet les cèl·lula no utilitzen IPTG per res. Només ens és útil a nosaltres, que ho utilitzem al laboratori per estudiar l’operó lactosa.
A vegades, podem trobar que hi hagi diverses regions lacO, de manera que s’hi poden unir diversos repressors alhora, i donar al promotor una torsió que encara faci més difícil a la RNApolimerasa la unió, i que per tant hi hagi encara menys transcripció que si només hi hagués un operador.
Mutacions en l’operó lactosa: - lacOc: operador lacO constitutiu, el repressor no s’hi pot unir, de manera que l’expressió serà constitutiva (sempre molt alta).
E. coli lacZ: quan veiem el nom de l’espècie i el gen darrere, vol dir que aquest gen és defectiu, produeix proteïnes no funcionals.
E. coli ΔlacZ: en aquest cas vol dir que aquest organisme ha sofert una deleció i ha perdut el gen lacZ.
lacIs: el repressor és insensible a la lactosa (insensible a l’inductor, i a altres senyals).
OPERÓ TRIPTÒFAN És el típic cas de regulació negativa per repressió. Està regulat per ppGpp i pel control d’atenuació (trpL). És un operó anabòlic.
Mentre al medi hi hagi poc triptòfan, l’expressió dels gens relacionats amb la síntesi del triptòfan serà total, es produirà tot el transcrit. Però si hi ha una gran concentració de triptòfan, la transcripció es bloquejarà (mirar control per atenuació) i el transcrit serà molt més curt. També està controlat per ppGpp perquè en ser un operó anabòlic forma part del control de la resposta astringent, de manera que estarà regulat en els casos que la cèl·lula es trobi en un medi amb pocs recursos.
El promotor de l’operó triptòfan està molt controlat, perquè sintetitzar triptòfan és una despesa massa gran com per fer-ho sense cap objectiu. Només se sintetitza triptòfan quan és realment necessari, sinó no cal gastar energia.
El promotor de l’operó triptòfan, o més aviat la regió -35 d’aquest, és una regió extraordinàriament forta, molt òptima per ser reconeguda per la RNA-polimerasa. Això vol dir que si no hi hagués controls, l’expressió de triptòfan seria extremadament alta. Això és un avantatge, perquè en el moment en que es necessiti triptòfan se sintetitzarà ràpidament i en grans quantitats.
De fet aquesta regió és tan bona que s’utilitza per fer promotors sintètics. Per introduir gens en una cèl·lula i que es puguin expressar es fan servir promotors sintètics. Molts d’aquests promotors tenen la regió -35 del promotor triptòfan. Concretament el promotor sintètic Ptac conté la regió -35 del promotor del triptòfan i la regió -10 de l’operó lactosa. D’aquesta manera, els operons que tinguin el promotor Ptac s’expressaran quan hi hagi lactosa al medi.
Mutacions en l’operó triptòfan: - - trpOc: operador constitutiu. No s’hi pot unir mai un repressor, per tant l’expressió és constitutiva (expressió molt alta sempre).
trpq: repressor d’alta afinitat. El repressor en aquest cas té molta més afinitat per l’operador. La constant d’afinitat és més alta que en situacions normals. Per tant, també es necessitarà més quantitat d’inductor per aconseguir la mateixa expressió que en condicions normals s’aconseguia amb menys concentració d’inductor.
trpRs: insensible al triptòfan. (Insensible a l’inductor).
OPERÓ ARABINOSA Un dels promotors més utilitzats per introduir gens en bacteris és el PBAD (com el Ptac, aquest és un promotor sintètic). Altres promotors no sintètics que s’utilitzen per això són el promotor de l’operó lactosa i el del triptòfan.
PBAD és el promotor de la unitat transcripcional que conté els gens araB, araA i araD, que conformen l’operó arabinosa. L’arabinosa és un sucre que entra a la cèl·lula, per tant aquest és un operó catabòlic, que codifica pels enzims que degraden aquest sucre. En ser un operó catabòlic, està regulat per CRP-cAMP. A més, té un control propi.
Hi ha un regulador transcripcional, AraC. El reguló AraC conté diferents unitats transcripcionals, en concret tres. Per una banda hi ha el promotor PBAD, que conté els tres gens esmentats anteriorment, també el promotor PE, que té el gen araE, i el promotor PFGH, que conté els gens araF, araG i araH. Com hi ha diverses unitats transcripcionals amb gens de degradació de l’arabinosa, no podem dir als promotors de totes elles Para, ja que sinó ens confondríem.
El reguló AraC regula la concentració d’arabinosa a la cèl·lula, i el que fa és controlar la concentració dels enzims necessaris per poder entrar l’arabinosa del cultiu a dins de la cèl·lula, i un cop estigui dins la cèl·lula, de degradar-la fins a poder-la fer entrar al cicle de Krebs.
El control d’AraC fa un control positiu (fa d’activador) per inducció en dos dels promotors. Però fa un control positiu-negatiu sobre el promotor PBAD, ja que també controla com a repressor (a més de com a activador) l’expressió d’aquesta unitat transcripcional. En aquest cas fa un control negatiu per repressió, a més del control positiu. De fet, farà un control positiu o negatiu en funció de la presència d’arabinosa en la cèl·lula.
AraC fa de repressor sobre el promotor del seu propi gen.
El regulador AraC té dos dominis, un d’ancoratge a l’arabinosa i un d’interacció amb el DNA.
Quan la concentració d’arabinosa a la cèl·lula és molt baixa, aquest regulador és capaç d’interaccionar amb si mateix (ja que no pot interaccionar amb arabinosa) i generar un dímer.
Aquest dímer pot bloquejar l’accés de la RNA-polimerasa al promotor PBAD. 7 El regulador AraC es pot ancorar al DNA encara que no tingui arabinosa, perquè aquest dímer es pot continuar unint a les regions operadores, si n’hi ha dos i es troben a la distància correcta.
Llavors, les regions promotores queden bloquejades i la RNA-polimerasa no pot reconèixer el promotor, per tant no pot transcriure i en aquesta unitat transcripcional l’expressió és basal.
Però això només passa en PBAD. En els altres promotors AraC només fa d’activador quan hi ha arabinosa, perquè quan no n’hi ha, no tenen la distància correcta entre operadors perquè el dímer d’AraC s’hi pugui unir i pugi fer de repressor.
Si hi ha arabinosa al medi, aquesta interacciona amb AraC, i AraC pateix un canvi conformacional, i ara ja no pot formar un dímer. Ara forma un complex amb l’arabinosa que és capaç de reconèixer una regió d’interacció en PBAD i en els altres promotors. Ara, AraC ajuda a la RNA-polimerasa a unir-se al DNA, per tant fa d’activador, incrementa l’expressió del sistema, indueix a la transcripció.
Per tant, veiem que AraC pot fer d’activador en tots els promotors, però només pot fer de repressor en el PBAD perquè és l’únic promotor on les regions operadores tenen una distància òptima entre elles perquè s’hi pugui unir el dímer d’AraC.
Quan un regulador, com AraC, té una acció dual, és a dir que pot actuar tant com a activador com a repressor, parlem d’una acció activadora i d’una acció anti-activadora (no repressora).
L’expressió basal de les unitats transcripcionals amb aquest tipus de control és molt baixa, però quan l’anti-activador passa a fer d’activador, l’expressió és molt alta.
Com en tots els operons, hi ha una acumulació de processos, ja que a més d’aquest control, també hi ha el de CRP-cAMP, en ser un operó catabòlic.
...