tema 2 javier (1) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 26/06/2017
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ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) El año clave es el 2010: primeras secuencias completas del genoma nuclear de homininos antiguos. Se detectó una mezcla neandertal en todas las poblaciones excepto en los africanos.
En el mismo año se publicó la secuencia nucleotídica de un humano antiguo (diez mil años de antigüedad, individuo de origen esquimal). Se consiguió obtener la secuencia de un homininio extinto que se encontró en una cueva de Siberia, y se observó que era un grupo muy similar a los neandertales y se vio que se había mezclado con un grupo que podría ser el antecesor de los melanesios (solo se observa restos de ese genoma en los melanesios actuales) Primeros resultados del Proyecto 1000 Genomas Otras secuencias completas de genoma y exomas humanos Genoma- wide SNP data:   HapMp big three: Europeos, Chinos Han y Yoruba Muchas otras poblaciones de interés antropológico Gracias al gran descenso de los costes y del tiempo necesario para generar estos tipos de datos Objetivo: investigar el pasado (historia demográfica de las poblaciones:     Origen de las poblaciones Migraciones Mezcla Cambios en el tamaño poblacional Antes de disponer de genoma-wide data (GWD), estudio de las poblaciones humanas basadas en loci genéticos individuales (mtDNA y NRY):   Proporcionan información valiosa Limitaciones en inferencia de parámetros básicos de la historia demográfica GWD proporcionan información de un enorme número de loci independientes: permite obtener interferencias demográficas más detalladas y por lo tanto una visión más precisa del pasado Modelo de historia demográfica basados en: a) uno o muy pocos loci: modelos muy sencillos b) GWD: modelos mucho más complejos (más realistas) TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 1 Interferencia de parámetros demográficos: tiempos de divergencia (T), migración (m), magnitudes y antigüedad de cuellos de botellas o bottlenecks (b y tb) o de expansiones poblacionales (g) e incluso mezcla con los homininos extintos Análisis de ADN antiguo revolucionado por el desarrollo de las técnicas de secuenciación y genotipado masivo Loci genéticos individuales (mtDNA o NRY) versus genomas completos de neardentales (coverage 1.3 – fols) de un grupo de hominio de Siberia (Desinovans; coverage 1.9-fold) y de humanos antiguos Estos datos han proporcionado información muy importante a problemas clásicos de la antropología. Por ejemplo: número de dispersiones de la especie humana desde África SECUENCIACIÓN DELATO RENDIMIENTO (NEXT GENERATION SEQUENCING: NGS) DE GENOMAS ANTIGUOS ADN de organismos muertos se degrada fácilmente Sin embargo, parte de este ADN puede sobrevivir durante más de 100.000 años en condiciones favorables (frío, temperatura estable, ambiente seco) Análisis de ADN antiguo  gran potencial para proporcionar información en la composición genética de poblaciones de organismos extintos      Interferencia de relaciones filogenéticas Tiempo de divergencia Estructura poblacional Hibridaciones Patrones filogeográficos TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 2 También se pueden estudiar cuestiones adaptativas: cambios funcionales y adaptaciones influenciadas por cambios ambientales de organismos extintos o actuales ADNA antiguo  material complicado por varios factores: 1. mezcla compleja de ADN procedente de varias fuentes  ADN endógeno  ADN microbiano  ADN ambiental de los organismos que rodean al fósil  ADN procedente de contaminación humana durante y tras la recogida del fósil 2. Bajo tamaño medio de los fragmentos de ADN (normalmente por debajo de 70 bp) 3. Cantidades de ADN extremadamente bajas 4. ADN modificado químicamente que provoca incorporación de nucleótidos erróneos durante la amplificación y secuenciación del ADN Criterios utilizados para asegurar la autenticidad de los resultados:   Replicas independientes de los análisis Protocolos de laboratorio destinados a evitar la contaminación de muestras y experimentos: o Estancias y trajes estériles o Uso de lejía y luz UV para degradar contaminantes potenciales (sobre todo DNA humano contemporáneo) o Separación física de zonas de trabajo con ADN antiguo y moderno Cantidad limitada de material fósil  las estrategias clásicas de PCR proporcionan muy poca cantidad de información (una pocas Kb) El ADN-mt era el candidato perfecto para ser analizado a partir de muestras antiguas (elevado número de copias por célula y elevada variabilidad) Utilidad limitada por ser un locus único y de herencia uniparental materno Secuenciación de alto rendimiento: existen varias plataformas de secuenciación Disminución progresiva de los costes hasta 2010. Estabilización por falta de competencia para Illumina En el caso del ADN antiguo suele estar muy fragmentado por lo que no es necesario hacer el proceso de fragmentación como si fuese contemporáneo. Se añaden adaptadores que se van a unir a los extremos de los fragmentos. Una vez que tenemos eso se aumenta la temperatura para que se produzca la desnaturalización. A esa muestra se le añade una enorme cantidad de micropartículas que llevan ligadas en su superficie una enorme cantidad de pequeños fragmentos que va a ser complementaria a los adaptadores. La reacción se produce en unas condiciones que hacen que en la inmensa mayoría de los casos solo un fragmento se una a una micropartícula. Cuando uno de los fragmentos se une se bloquea la unión del resto de TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 3 fragmentos. Vamos a tener un millón y medio de partículas a las cuales hay unidas un fragmento de ADN. Una vez que se produce esta unión lo que se hace es añadir una emulsión oleosa que va a haber reactivos de PCR. Esta mezcla lo que hace es formar una micela alrededor de cada una de las micropartículas. Se produce una reacción de amplificación en cada una de estas partículas (se forma una burbuja donde en el interior queda la micropartícula y los reactivos de PCR), se hacen diferentes ciclos como en una PCR normal.
Partimos de un único fragmento y mediante PCR en el interior de esa micela se va a producir una amplificación de ese fragmento de ADN, se pueden llegar a tener hasta dos millones de copias del fragmento original.
A continuación se van a cargar todas esas micropartículas en una nanoplaca que tiene unos nanopocillos y en cada uno de ellos solo cabe una micropartícula. Lo que va a ocurrir en este nanopocillo es un proceso de secuenciación. Vamos a realizar una secuenciación de ese fragmento de ADN que hay en esa micropartícula. En cada nanopocilo vamos a tener una microparticula con las múltiples copias del fragmento y una serie de reactivos para el proceso de secuenciación, en este caso mediane pirosecuenciación, y otra serie de partículas que llevan dos enzimas como la sulfurilasa y la liceferasa. En el interior de ese nanopocillo se va producir la pirosecuenciación.
Primero tenemos que añadir un primer. La adicción de los nucleótidos va a ser secuencial (añadimos de uno en uno). Se añade el primer nucleótido, en este caso una timina, y se va a unir a la adenina. Cuando e uenn dos nucleótidos se libera una molécula de pirofosfato. Esta molécula de pirofosfato es clave porque va a ser captada por uno de los enzimas, la sulfurilasa que lo que va a hacer es transformar el pirofosfato en ATP y se libera ATP. El otro enzima es capaz de transformar la energía del ATP en luz, va a emitir luz. Si hubiera una adenina se produciría lo mismo, pero en este caso no. Así que pasa un tiempo se retira el primer nucleótido y se añade un segundo nucleótido, en este caso una segunda adenina. Intenta unirse en el siguiente punto pero no puede en este caso porque no es complementario. Se retira este segundo nucleótido, y se pasa a la citosina y esta si que puede unirse al siguiente nucleótido, y la reacción es la misma que en el primer caso. Y se vuelve a hacer lo mismo, se retira y se añade otro nucleótido. Va a ser complementaria por lo tanto se van a producir las reacciones, en este caso tres emisiones de luz. Todo esto se va haciendo secuencialmente, sobre unas 100 veces. A partir de los resultados de cada uno de los ciclos tenemos una serie de resultados. A medida que va a aumentando la intensidad de la luz es proporcional al número de nucleótido iguales seguidos. Hay un software que va a leer estas placas, va leyendo los picos de luz de cada ciclo Estamos haciendo 100 ciclos por lo tanto lo máximo que podemos obtener son 400 pares de bases, por eso lo de utilizar fragmentos cortos Han ocurrido un millón se secuenciaciones, porque el proceso ha ocurrido en toda la placa.
Vamos a tener un millón de fragmentos de ADN de ese individuo. Normalmente los fragmentos que vamos a obtener son fragmentos que se solapan unos con otros. ¿Pero como sabemos cómo va? Esto se logra gracias a que hay zonas de solapamiento. Se puede generar un mapa de ese genoma. El software va a “formar el puzle” TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 4 ...