Resum tema 5 (2a part) (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia molecular
Año del apunte 2016
Páginas 4
Fecha de subida 15/04/2016
Descargas 22
Subido por

Vista previa del texto

RESUM BIOLOGIA MOLECULAR TEMA 5: MÈTODES D’AÏLLAMENT I PURIFICACIÓ (2a part) Tècniques preparatives i tècniques analítiques 1. Localitzar determinades seqüències de DNA (aïllar un d’aquests fragments). Comparar ≠ ssp. tallant amb la diana de restricció Alu.
2. Estimar el grau de similitud o diferència entre gens relacionats (similitud entre gens).
3. Analitzar cromosomes (fer mapa dels fragments) Punts de restricció es poden utilitzar com a marcadors dins un cromosoma.
RFLPs  polimorfismes de ≠ mides, tractament per enzims de restricció.
(blot és transferència)   Necessitem un genoma I una sonda: àcid nucleic monocatenari, aparellament específic a una determinada seqüència i té algun element que permeti ser detectada (monocatenària).
DNA genòmic s’ha de digerir amb enzims de restricció. Es fa un gel d’agarosa. No es veuen bandes diferenciades, sinó un gradient de bandes (fragments més grans i més petits) ja que el DNA genòmic és molt gran.
Es cobreix el gel amb NaOH (pH 12) que desnaturalitza el DNA (monocatenari).
Membrana de nylon amb porus petits on quedaran els fragments de DNA. A sobre paper de filtre i un pes, el nylon absorbirà el NaOH que farà pujar el DNA. Les bandes quedaran transferides en el nylon, separat pel seu PM.
Llum UV trenca les molècules i genera àtoms molt reactius que fixaran el DNA al nylon.
S’utilitza la sonda marcada normalment radioactivament.
  Si al nylon no hi ha la cadena complementaria a la sonda, no s’hi unirà Si tenim la seqüència complementària, aquests s’aparellarà  film d’autoradiografia  si el gen està fragmentat es veuran les bandes amb les que està hibridant la sonda, però potser no es veuran tots els fragments. Radioactiva: permet detectar molt poca quantitat de sonda.
No sabrem el PM del gen, sinó el PM de les bandes que han hibridar amb la sonda.
Per detectar la presència d’un determinat gen o seqüència.
si hi ha un fragment marcat identifica que sí que hi ha el gen. Trobar les diferents combinacions possibles per diferenciar individus.
Anàlisi per veure si un determinat teixit està expressant un det. gen.
Amb RNA. L’mRNA es purifica amb DNAsa per cromatografia d’afinitat amb la cua de poli-A.
Gel d’agarosa. El RNA té zones amb estructura secundària, com més compacte és el DNA més fàcilment avança a través del gel.
Agent desnaturalitzant (formamida), perquè el RNA no tingui estructura secundària.
Presència o no de ≠ bandes. Si no apareix banda és que la cèl·lula no està expressant el gen.
1 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Construcció de sondes.
Sonda degenerada: conjunt de sondes que produeixen les ≠ combinacions possibles de la seqüència.
Enzims que transfereixen a un nucleòtid un grup P radioactiu. Només es marca radioactivament un sol fosfat.
  Si només afecta un grup P, es marcarà el ƴ (gamma), el que ens transfereix.
Si transferim el nuclòtid, el P marcat serà l’α.
MARCATGE INTERN Els nucleòtids marcats són els de dins de la sonda.
Tractem el DNA amb DNAsa I (endonucleasa) i Mg2+ que és un cofactor (talla a l’atzar), l’enzim talla les dues cadenes de manera independent. Provoca osques dins el DNA (segment sencer) i afegim DNA polimerasa I (reparar el forat) de síntesi de la cadena de 5’  3’.
Necessita deoxinucleòtids (incorpora els radioactius), tindrem la sonda marcada radioactivament. El que es marca és el fosfat α perquè incorpora el nucleòtid. Trossos de DNA marcats radioactivament complementaris al gen.
Un oligonucleòtid no és una sonda perquè no està marcat.
Conjunt d’encebadors que sintetitzen la seqüència a l’atzar (a cada posició es pot unir qualsevol dels 4 nucleòtids).
Es desnaturalitza el DNA i s’afegeixen els encebadors. S’utilitza Klenow és una polimerasa que no té activitat exonucleasa 5’  3’ (no degrada).
Avantatge: per probabilitat algun d’aquests encebadors s’unirà amb el gen (hibridació total o parcial).
Tindrem un motlle, encebador i Klenow. Afegim dNTP radioactius, fosfat α està marcat perquè és el que farà l’enllaç fosfodièster.
Cal enzims de restricció per deixar extrems 5’ monocatenaris (cohesius), tenim un motlle i un encebador. Klenow reomplirà l’osca amb nucleòtids radioactius de 5’  3’.
fosfatasa alcalina eliminarà els extrems fosfats de 5’, perquè només podem fosforilar (afegir fosfats) a 5’. Queden grups hidroxils (OH) a 3’ i 5’.
Polinucleòtid quinasa i ATP, que és el que transfereix el grup fosfat ƴ radioactiu al polinucleòtid, s’incorpora a 5’.
El gen es talla amb enzims de restricció (perquè és molt gran) però llavors només estaran marcat 2 extrems de la SONDA. Aquests dos fragments hibridaran amb el gen que busquem i així el podrem detectar.
2 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Utilitzem RNA com a sonda, transcripció amb RNApol i ribonucleòtids radioactius.
Hem de tenir el gen clonat i controlat per un promotor fort.
Llisat de reticulosit: és un tipus de cèl·lules, llisat i tenim tots els cofactors perquè el RNApol pugui funcionar.
Serveix per RNA, ssDNA i dsDNA.
Cal transferasa terminal: DNApol que no necessita motlle, afegeix nucleòtids a l’atzar en 3’, treballa millor en cadena senzilla. Per el dsDNA caldrà digerir-los amb un enzim de restricció que deixi els extrems cohesius (monocatenari).
La transferasa terminal afegeix nucleòtids marcats a l’extrem 3’.
Altres tipus de marcatge: Són difícils de detectar i són menys sensibles.
S’utilitza encebadors (dNTP) fluorescents per detectar un determinat gen en una cèl·lula.
Podem fer tots els marcatges interns explicats anteriorment, les tècniques en que es marcava el fosfat ƴ, però en aquest cas amb fluorescència.
Afegim encebador amb fluorescència i reconeixerem els bacteris amb que hagin hibridat (tindran el gen) perquè són fluorescents.
Una altra estratègia: NTP que no tenen grup fluorescent, però es poden unir a un grup fluorescent com la biotina, per detectar la sonda cal afegir avidina que és fluorescent que s’unirà a la biotina (sonda) de manera més afina i forta.
Avantatge: són molècules més petites i per tan s’aparellen amb més facilitat.
MARCATGE EXTERN Detectar la sonda de manera exògena la presència de la sonda, varis mètodes: 1. Sintetitzar la sonda i unir-la amb un grup químic a un enzim (més gran) com la peroxidasa. La sonda s’uneix covalentment a glutaraldehid H2O2 + A  (peroxidasa)  H2O + A-O, aquest canvi provoca un canvi de color.
2. Unió no covalent amb polietilamina (polímer positiu) + reactiu benzoquinona. La sonda té càrrega negativa i això permet que s’hi uneixi l’enzim. BN lliures que podran unir-se al DNA.
3. Amb agents intercalant fluorescents que hibrida la sonda amb el DNA.
3 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR polimerització del DNA Cal una cadena motlle, encebador, DNApolimersa i una barreja de dNTP i ddNTP.
-OH en 3’ on es podrà fer la reacció per que s’uneixi el següent nucleòtid. El ddNTP no té grup OH en 3’, només té H.
Quan un ddNTP s’incorpori a la cadena s’aturarà la reacció de polimerització (no es podrà unir un altre nucleòtid).
S’utilitza ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP marcats amb florofors diferents, el que els hi dóna un color ≠ a cada un.
Taq polimerasa és una polimerasa termoresistent.
Es posa la barreja en un tub i es posa en un seqüenciador. Només tenim un encebador  només es seqüenciarà la seqüència que volem.
A 95ºC el DNA es desnaturalitza  Tm: s’uneix l’encebador a les seqüències síntesi de a cadena amb dNTP i quan s’afegeix ddNTP s’aturarà i quedarà d’un color.
Obtenim molècules de DNA de ≠ mides.
Es fan varis cicles.
Obtenim molts productes d’amplificació. Amb 30 cicles  1010 productes d’amplificació.
Tindrem tots els productes entre el més curt i molts nucleòtids endavant.
Ho posem en una columna  electroforesi capil·lar + formamida que separarà el DNA motlle  queda DNA monocatenari.
L’elecroforesi capil·lar separa per PM. A la base de la columna hi ha un làser que distingeix el color de cada nucleòtid, així que podrem veure la seqüència, quin nucleòtid hi ha en cada posició segons el color.
Segons les proporcions de dNTP i ddNTP podrem llegir seqüències més properes i més llunyanes.
Si hi ha més ddNTP hi haurà més possibilitats de que s’uneixi primer un ddNTP i llegirem seqüències més properes a l’encebador, perquè la seqüència s’atura abans.
4  a 65ºC es produeix la ...