Electroforesis SDS-PAGE i Espectroscòpia de masses (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Macromolècules
Año del apunte 2014
Páginas 5
Fecha de subida 18/10/2014
Descargas 9
Subido por

Descripción

Electroforesis SDS-PAGE i Espectroscòpia de masses

Vista previa del texto

Electroforesis SDS-PAGE i Espectroscòpia de masses Electroforesis SDS-PAGE Xarxa de boles que es poden posar dins amb més o menys facilitat de correlació entre dues propietats: pes molecular Per passar d’una divisió a una altre hem de multiplicar una constant, no pas sumar-la.
Tub de vidre tot ple de polímers i mentre dura l’experiment addiciono tampó i calculo el que va baixant gràcies a un detector (bombeta), la llum arriba al detector sempre i quan no hi hagi res que l’aturi.
Sabem el volum que surt. Cadascun dels punts és el resultat experimental al posar-hi una proteïna, en aquest cas hi ha una recta al mig que és la zona útil de la columna. A partir d’una certa mida, al final del gràfic, totes les proteïnes baixen a la mateixa velocitat perquè no passen pels porus. També passa amb les proteïnes molt petites, en aquest cas al principi del gràfic.
La zona útil de la columna es trasllada i depèn dels polímers que utilitzem.
La nostre proteïna pot no ser rodona, pot ser allargada, per tant no tindrà exactament el mateix pes molecular del real.
També es pot trobar una relació quan la proteïna està desnaturalitzada, tot i que sembla més gran.
Excussió molecular Exemple real d’un experiment per determinar el pes molecular i aleshores entendre les propietats de les proteïnes. Per exemple HNS Aquesta substància forma polímers molt grans: però aquests polímers són massa grans i no entren en la reïna i per tant queda exclòs.
...
Per aquesta raó es barreja aquesta proteïna amb dominis rodons, aleshores la proteïna no s’allarga gaire: (és com si algú no volgués donar la mà dins d'una cadena). Quan s’afegeix el domini rodó, apareixen polímers molt més petits: procés de desagregació.
Quan fem una cromatografia d’absorció molecular i trobem l’absorbància: - A: quan la proteïnes és molt gran i no cap entre els porus del polímer.
E: és una impurificació SDS-PAGE Placa de vidre i s’obre aquesta hi dipositem la dissoluci: polimeritza (massa concentració de polímer). Es fa un forat per dipositar la proteïna. El que forma és aplicar camp elèctric: a dalt hi ha el pol negatiu i a baix el pol positiu. Les proteïnes amb càrrega negativa es mouen cap al pol positiu, aleshores tenyim el gel i fem una fotografia. Les proteïnes petites corren més que les grans. Es representa en un gràfic: mobilitat-pesmolècular.
El SDS-PAGE és un detergent que s’uneix a la proteïna i fa que sigui negativa. 12 àtoms de carboni, grup solfat (Na+) L’experiment es basa en agafar 7 proteïnes i fer-les córrer, fem una foto, tindrà més carrega com més gran sigui la proteïna, si fem el filtre amb una concentració de gel més baixa, l’ordre es manté però la diferència és cada cop més petita. És a dir, no hi ha efecte de càrrega, sinó que se separen en funció de la mida, perquè el que separa és el gel: és més gran com més càrregues negatives tingui, ja que el pol positiu tirarà més.
Moure una proteïna més gran en aigua costa més que una petita.
Espectroscòpia de masses Permet una mesura del pes. Determina la massa. Molt específic, podem distingir una proteïna que té un H+ més o un menys.
La sensibilitat, és a dir, la quantitat de mostra que necessitem, és molt gran: necessitem poca proteïna. Podem identificar de forma inequívoca la proteïna que tenim, assegurar-nos que no s’ha modificat res.
CONDICIONS PER VEUIRE-LA (abans ens pensàvem que no era possible a causa d’aquestes raons) La proteïna ha d’estar en fase gas i ionitzada (amb càrrega). Es necessita càrrega perquè el que estudiem és un quocient entre massa i càrrega: m/z. Per exemple, carrega +1 (la massa serà aleshores el número del quocient), carrega +2 (la massa serà la meitat del número del quocient)...
MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption and Ionitzation. (laser: dòna l’energia) Boles blaves: proteïna Boles grogues: matriu (més groc que blau) Punts negres: cations La matriu és una molècula orgànica que té la propietat d’absorbir llum d’una determinada longitud d’ona. La ralla vermelles és el làser, una font molt alta d’energia que subministra a la mostra. La seva longitud d’ona és tal que les proteïnes NO les absorbeixen, per tant per aquesta llum la proteïna és transparent, és a dir, la traspassa.
En canvi, la matriu sí que absorbeix l’energia, n’absorbeix tanta que explota. A la proteïna no li passa res perquè no n’absorbeix, però tot el seu voltant explota, per això surten disparades, algunes de les quals porten enganxades els cations; solament aquestes passen a la fase següent, ja que hi ha un camp magnètic i són atretes a ell. Per tant, tenim proteïnes volatilitzades (en forma de gas) i ionitzades.
També podem, en comptes d’això, injectar la proteïna en aigua a través d’un capil·lar i aleshores es fa un spry: ELECTROSPRY IONITZATION.
Es fa sortir spry a través d’un forat petit de manera que tenim gotes d’aigua amb proteïna a l’interior. Quan surten hi ha un camp elèctric, i com que la proteïna té enganxada càrrega, aleshores les gotes fan un trajecte en direcció la seva atracció del camp elèctric.
Les gotes van perdent l’aigua i es van fent més petites, i com que a l’interior tenen càrrega doncs exploten i cada cop són més i més petites, ja que a més l’aigua es va evaporant. Fins que arriba un moment que solament queda una proteïna hi ha ions que s’uneixen i per tant la proteïna queda carregada.
La càrrega ve perquè la nostre proteïna que pesa “m” no surt sola, sinó que surt amb alguna cosa enganxada. Per exemple, un protó, això dona lloc a un objecte de “m+1” (1 és la massa d’un protó) i té una càrrega de +1.
Si en comptes d’enganxar-se un protó, s’enganxa sodi, la massa serà “m+23” i la càrrega +1. El paràmetre que acabarem mesurant és la relació entre massa/càrrega (m/z), en els dos exemples la càrrega ha estat +1, per tant la relació és “m” i “m+1” Representació de l’espectre de masses: És un diagrama on en les abscisses està representada la relació m/z i en les ordenades està representada la intensitat.
L’analitzador del que ha sortit ha trobat una “certa” quantitat d’espècies carregades que tenien certa intensitat. L’especies majoritària té el pic més alt. L’espècie molecular és la que té aquella massa menys el protó afegit.
Si la proteïna en comptes d’agafar un protó n’agafa dos: la proteïna pesa “m+2”, però la càrrega és +2, per tant la relació és aproximadament la meitat i és per aquesta raó que hi ha un pic en aproximadament la meitat de l’espècie majoritària, la meitat del més gran.
L’albumina té tendència a autoassociar-se, és a dir que la massa és doble o triple, per això són causats els pics de la dreta, quan la relació és més gran.
La càrrega ve de l’adquisició d’un protó. En el MALDI el número de protons que es queda a la proteïna és molt petit.
Però si s’analitza amb un ELECTRO-SPRY una única proteïna sense impureses em dona una gran família de pics. Sobre el pics hi ha un número que es refereix al número de protons que té la proteïna unida.
En l’espectre no sabem la càrrega que té. I el pes molecular el descobrim ja que per sort tenim una col·lecció de pics, l’observació experimental d’una proteïna amb un cert nombre de protons: (m + nH+)n+ i la relació és: (m+n)/n = m/z. Com que tenim dues incògnites, necessitem una altre equació.
Els pics van en ordre i cada pic és un protó menys, per tant podem fer un sistema amb un altre pic: (m + (n+1)H+)(n+1)+ i la relació és: (m+n+1)/(n+1)= m/z.
El fet de que hi hagi una càrrega o moltes també té importància tècnica. Les relacions massa/càrrega són molt més petites que en el cas de l’elecrospry ionitzation, ja que tot i que les proteïnes són grans, la càrrega també ho és. Això és bo ja que el que fem amb proteïnes petites i com les detectem , també ho podem aplicar a aquestes proteïnes més grans, però que tenen la relació petita.
Mètodes d’anàlisi “especials” Mètode que es va utilitzar per calcular la relació de proteïnes molt grans. L’analitzador es basa en: les partícules ionitzades es troben en un camp elèctric, la pressió és el més baix possible (si pot ser el buit), per tal de que no topin amb ningú, aleshores amb el camp elèctric es mouen.
Exemple: posem un motor de càrrega +1 a un camió i un cotxe petit. El camió accelerarà a poc a poc, en canvi el cotxe ho farà ràpidament. A quina velocitat arriben? La velocitat es pot calcular traient la velocitat del camp elèctric i contant el temps que tarda la molècula en recórrer una distància fixada (temps de vol). Si la velocitat és gran, tarda poc temps.
Relació: m/z = 2eEls(t/l)2 la relació depèn d’un temps i tot de coses que ja sabem En principi, en un món ideal això no té límit, les proteïnes més grans arriben més lentes (més temps).
En el cas de les altres tècniques, el principi es basa en que les molècules carregades són accelerades en un camp de base i s’intenta desviar: es tracta de veure si és fàcil o difícil! Si tenim un objecte amb molta massa, és molt difícil de desviar (per exemple el titanic). Si la massa és més petita, la inèrcia és més petita.
Es fa amb un camp magnètic, i el camp elèctric perpendicular. Quan ionitzem el camp no només hi ha una proteïna: podem fer coses, com per exemple filtrar.... encara que sempre hi ha molècules de sobres.
...