Tema 3 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 26
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 47
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Tema 3. DNA CIRCULAR INTRODUCCIÓ EN EL CONEIXEMENT DEL DNA CIRCULAR A la natura podem trobar DNA circular en virus animals, molts bacteriòfags, cromosomes bacterians i plasmidis. El DNA d’E. Coli és molt gran i quan s’estudia es trenca i és aquest el motiu pel qual quan s’estudia s’utilitza el DNA circular de virus.
L’any 1960, al laboratori de Vinograd van començar a treballar amb un virus que produeix tumors, el polyoma virus i que té com a material genètic DNA circular. Quan van elaborar els experiments van trobar diferents coses que els hi van cridar la atenció:  Si es fa una centrifugació amb gradients de sacarosa del DNA d’aquest virus s’obtenen dues bandes; una d’elles corre molt ràpid i té un coeficient de sedimentació molt baix, que es coneix com DNA tipus II, i una altra que corria menys i que té un coeficient més elevat, conegut com DNA tipus I.
 Quan s’estudia la corba de fusió d’aquests dos tipus de DNA van obtenir resultats diferents pels dos DNA.
Suposant que tenien aquests DNA purs, la temperatura de fusió del DNA tipus I és d’uns 80 °C i la de tipus II era més baixa.
Obtenen dues propietats molt diferents de DNA que tenen la mateixa longitud, és a dir, el nombre de parells de bases.
Això els va fer pensar que aquests canvis en el comportament no eren deguts només a la longitud del DNA. Cal tenir present que tots dos DNA són de doble cadena.
Tipus de DNA circular Després d’elaborar diverses observacions de DNA circular de diverses espècies, el primer va ser DNA víric, es van adonar que dins la població de DNA que estaven estudiant hi havia diferències de DNA, on trobaven:  DNA tipus I. Amb un coeficient de sedimentació elevat i una temperatura de fusió elevada.
 DNA tipus II. Amb un coeficient de sedimentació baix i una temperatura de fusió més baixa.
Quan van purificar el DNA van aconseguir extreure més informació ja que es va poder observar pel microscopi electrònic. A la imatge a podem veure com el DNA tipus I es veu recargolat sobre si mateix en la gran majoria d’ocasions; en canvi, el DNA tipus II es veu dominantment en cercles que no són molt perfectes però en aquest cas no estan recargolats.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Coeficient de sedimentació: DNA tipus I i tipus II Així doncs, la morfologia canvia substancialment en els dos tipus de DNA i aquest fet els hi va permetre interpretar el perquè en la diferència de coeficient de sedimentació. En el cas del DNA tipus I, com que està recargolat, té menys volum i en conseqüència el coeficient de sedimentació és més elevat. En el cas del DNA tipus II passa el contrari ja que el volum és més gran i per tant, coeficient de sedimentació més petit.
Temperatura de fusió: DNA tipus I i tipus II La diferència en la temperatura de fusió està basada en una altra cosa que la podem interpretar amb un model. Si el DNA circular el trobem íntegre, és a dir, si es mantenen tots els enllaços fosfodiester, quan el posem a fondre (temperatura elevada) les dues cadenes es volen separar. Com que està tancat en un cercle, el fet de trencar la doble hèlix de Watson i Crick costa moltíssim llevat que es trenqui algun enllaç.
Si trenquem un dels enllaços fosfodiéster fent un nick al DNA (un tall en la cadena) i el sotmetem a agitació tèrmica, hi ha la possibilitat que les dues cadenes es desenrosquin i se separin completament sense grans problemes. Això els hi va permetre explicar perquè la temperatura de fusió del tipus II és més baixa que la de tipus I. Així doncs, amb un sol nick hi ha prou perquè les cadenes de DNA tipus II acabin separant-se.
Curiosament, en el DNA tipus II trobem una certa part de la població que té la temperatura de fusió elevada. Això és degut al DNA que trobem en la forma rodona (relaxada) ja que si les dues cadenes estan tancades covalentment no hi ha tendència a recargolar-se la qual cosa implica que ocupi més volum i el coeficient de sedimentació sigui baix i a més, com que està tancat covalentment costa que la cadena de Watson i la de Crick se separin.
Nomenclatura Al DNA tipus I l’anomenarem DNA circular superenrotllat; també li podem dir superhelicoïdal ja que es tracta d’una doble hèlix recargolada. Cal tenir present que aquest DNA no pot estar nickat ja que si es produeix un tall, deixa de ser superenrotllat; transitòriament sí que podria estar-ho però, es desfaria.
Pel que fa als DNA tipus II, el que té la temperatura de fusió elevada l’anomenarem DNA circular relaxat covalentment tancat i té unes propietats equivalents al DNA anterior. El que té la temperatura de fusió més baixa l’anomenarem DNA circular relaxat nickat i té al menys un tall en una de les cadenes de manera que, com a mínim, en una de les cadenes no hi ha continuïtat.
A la pràctica, el DNA té una estabilitat en la doble hèlix prou gran com per no trobar diferències entre el DNA circular amb un nick o dos. En canvi, si els sotmetem a temperatura observaríem diferencies ja que en el cas del doble nickat obtindríem diversos fragments.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Teorema topològic fonamental Quan van veure això es van posar en contacte amb els topòlegs. Per tant, van avançar en una branca de la geometria que és la topologia, gràcies als estudis fets amb ADN. Hem de tenir present que la topologia és una part de la geometria molt fonamental. Si volem definir topologia direm que és una branca de les matemàtiques que estudia les propietats geomètriques que persisteixen inclús quan les figures que s’estan estudiant són deformades. Imaginem que tenim un triangle i un altre amb uns angles diferents; veiem que són geomètricament diferents. La topologia és la part de la geometria que admet que hi hagin deformacions i que estudia allò que queda.
Els geòmetres després d’estudiar els resultats van arribar al teorema topològic fonamental: Podem definir:  L és linking number fa referència al nombre d’enllaços topològics. Únicament poden ser nombres enters.
 T és el twist que és un nom que es va triar a l’atzar i representa el nombre de voltes de la doble hèlix.
 W és el writhing number que fa referència al número de la superhèlix.
Els geòmetres treballaven amb cintes de paper per tal de poder visualitzar el model. Si fem un tall, aleshores podem agafar una de les dues parts i fer un gir de 360°. Cal tenir present que el gir ha de ser de 360° i no de 180°; els geòmetres sí que podien elaborar el de 180° perquè els dos extrems quedarien encarats correctament però a la vida real, en l’ADN, si féssim aquest gir quedaria un extrem 5’ encarat amb un altre extrem 5’ i per tant no es podria elaborar un enllaç normal.
Suposem que el nombre d’enllaços topològics és de L = 1.
Podem parlar dels paràmetres en termes d’increments de tal manera que per passar de la figura a A a la C hem incrementat els enllaços topològics en una unitat.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Recompte d’enllaços topològics Comptarem el nombre d’enllaços topològics a partir de les dues cadenes que estan en un espai amb una forma X i es projecten sobre un pla; aplicant una sèrie de convenis podrem determinar els enllaços topològics. Per fer-ho cal definir un sentit en les dues cadenes, a la imatge veiem un sentit tot i que podria ser el contrari.
Si decidim fer el recompte dels enllaços topològcis seguint el sentit de les fletxes de l’esquema mirarem la cadena que està per sobre (línia continua). Si per trobar la cadena que està a sota gira en el sentit de les a agulles del rellotge, a aquesta cruïlla li assignarem un -1; en canvi, si va en contra de les agulles del rellotge li apliquem un +1.
Analitzant la imatge veiem que en el primer punt cruïlla, la que passa per sobre per anar cap a la que està a sota es va cap a l’esquerra i per tant, li assignem un +1. Resseguint aquesta estructura arribem a una altra cruïlla i veiem que per anar des de la cadena superior a la inferior també es va cap a l’esquerra, assignem +1. A la següent cruïlla on la vermella passa per sobre de la negra, torna a anar cap a l’esquerra i apliquem +1. Per últim, trobem una cruïlla on assignem un -1 perquè ha per tal d’anar de la superior a la inferior es va cap a la dreta.
Per tant, en aquest cas el linking number: Hem de saber que la formula anterior també es pot expressar com increments: ∆L= ∆T + ∆W 4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Exemples de linking number A continuació veiem imatges d’exemples més realistes amb un nombre més elevat d’enllaços topològics. Van generar un algoritme de tal manera que el càlcul de linking number en el DNA tipus B sigui positiu.
En el cas 1 (figura B) el nombre d’enllaços topològics és de 4 i en el cas 2 (figura C) tenim 3 enllaços topològics. El fet de generar l’increment de linking number ( ∆L=+3-4=-1) al passar de 1 a 2 només es pot aconseguir fent un tall en una de les dues cadenes i tornant a tancar. Per tant, podem dir que aquestes dues estructures són topològicament diferents.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Experiments de Van Holding En els experiments utilitzarà 105 parelles de bases perquè ja sap que el DNA en dissolució té 10,5 pb/volta i per tant, el twist el podem calcular com el quocient 105/10,5 = 100. Cal recordar que el DNA només presenta propietats topològiques si està en forma circular i no si està lineal.
Relaxed circle El model de Watson i Crick presenta 10 voltes i per tant, en les seves condicions vasals i relaxades (L0 i T0) són aquells en que el nombre de voltes és 10 i per tant sabem que L = T = 10, de manera que el superenrotllament és nul. Així doncs l’equació anterior en les condicions inicials queda com: L = T + W => 10 = 10 + 0 Strained circle En aquest cas el DNA anterior es modifica de manera que tenim 1 volta més. Holding proposarà que s’ha elaborat un descargolament però aquesta hipòtesis és falsa ja que per desenroscar una doble hèlix de la dreta cal girar cap a la dreta.
Observem doncs que el nombre de voltes és de 9 però el nombre d’enllaços topològics és el mateix, que també és de 9 de manera que, aparentment tot està bé però hem de tenir present que s’ha generat una estructura tenisonada.
En aquesta nova estructura amb tensió tenim 105 parells de bases amb 9 voltes de doble hèlix de manera que ara tenim 11,67 pb/voltes, el que genera una estructura en tensió respecte l’estructura de Watson i Crick ja que el Linking number (L) ha canviat, el que ens permet calcular un increment de L respecte l’inicial. Hem de tenir present que tenim diferents topoisomers perquè el Linking number no és el mateix.
Aquest increment del Linking number (∆L=-1) ha de quedar justificat amb el teorema topològic de manera que, sabent que el número de supercoils no varia (W=0) sabem que per variar el Linking number cal treure una unitat de Twist.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Supercoil Un supercoil que ens podem imaginar és un topoisomer a l’anterior en que L=9 però en aquest cas, la variació de Linking number es compensa generant una superhèlix. En aplicar el teorema topològic observem que l’increment de Linking number és el mateix (∆L=-1) però en aquest cas és compensat amb un increment de W d’una unitat negativa (perquè la superhèlix abança cap a la dreta), el que permet que el increment de Twist sigui nul.
En aquesta nova estructura tornem a tenir 10 voltes com en el model de Watson i Crik de manera que gràcies a la formació de la superhèlix la topologia ens permet tornar a tenir 10 voltes. Així doncs, la tensió generada sempre es reparteix alterant T o W, podem alterar un únic paràmetre o bé els dos però sempre cal respecta rel teorema topològic.
Els topoisomers es poden presentar esquemàticament de dues maneres (les dues tenen el mateix criteri de signes): no ho entenc molt bé  Forma trenada: és una volta superhelicoidal trenada cap a la dreta, que equival a un increment de W en forma negativa.
 Forma toroïdal: el trenat anterior era cap a la dreta perquè W=-1 però sabem que aquesta forma equival a la mateixa idea però avança cap a l’esquerra.
Qualsevol segment de DNA lineal que estigui confinat en un ambient cel·lular real, en que està unit a proteïnes té problemes topològics per tot arreu de manera que, la manera que solucionar la tensió generada és molt important.
Teorema topològic Si observem la següent imatge veurem que en la primera situació (a) W és molt elevat mentre que la variació de T és molt petita de manera que aquest DNA no té tensió pel que fa la seva estructura interna. En la situació (b) en canvi presenta una mica de tensió, és a dir, el DNA està patint una estructura que no és natural i per últim, en la situació (c) W és nul però en canvi T és molt gran de manera que presenta una tensió molt gran ja que l’estructura de Watson i Crick no és respectada.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 El que hem de tenir present és que el teorema topològic admet totes les estructures sempre i quan aquestes satisfacin l’equació ∆L= ∆T + ∆W. El DNA es pot presentar en situacions enrotllades i en altres no estar-ho de manera, que la cèl·lula també ha de tenir mecanismes per determinar quin és el seu grau d’enrotllament per diferents funcions. Així doncs, també hem de tenir present que el DNA del nucli és una estructura mol gran de manera que la tensió helicoïdal que pateixi ha de ser suportable per la cèl·lula i no provocar problemes en aquesta.
A les cèl·lules però tenim proteïnes que ajuden a que el DNA estigui en una conformació “còmoda” de manera que permeten un enrotllament sobre les proteïnes que desfan la tensió i permeten que la nova estructura s’acosti més a l’estructura de W&C.
Densitat superhelicoïdal En l’increment de L que hem donat en el DNA que estudiem (relaxat) per tal de calcular-ho hem posat en el denominador el nombre d’enllaços topològics del seu estat relaxat, que queda definit com: nombre de parelles de bases/ 10,5, de manera que sí L=L0, tenim una densitat superhelicoïdal nul·la.
El DNA circular de vàries espècies que ha estat estudiat s’ha vist que tenen una densitat superhelicoïdal de -0,06 i per tant, segons el model de Van Holding havia de ser de -0,1, de manera que es considera que és un model proper i vàlid.
El DNA natural té un dèficit de 6 enllaços topològics per cada 100 que s’elaboren. Sabem que per tenir 100 enllaços topològics necessitem 1.000 parelles de bases ja que per cada 10 parelles de bases ens donen 1 enllaç de manera que podem dir que ∆W=-6, per un DNA de 1.000 pb o 1.050 pb (en que per cada 10,5pb/volta).
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 EXPERIMENTS QUE PERMETEN DETERMINAR L’ESTRUCTURA CIRCULAR DEL DNA Electroforesi en gel d’agarosa L’electroforesi en gel d’agarosa és posada en marxa en els laboratoris de Vino Grand i són gels molt interessants perquè permeten estudiar els topoisomers del DNA circular.
En un gel normal, que no és desnaturalitzant, el DNA lineal migra en una posició d’un bacteriòfag de 3.000 pb aproximadament, de manera que en funció del lloc on migri podem determinar característiques del DNA. El DNA circular pot migrar més endavant o més enrere i aquest aspecte és difícil de preveure ja que depèn de la concentració d’agarosa que introduïm en el gel.
El que és molt interessant d’aquest tipus d’experimentació és que el DNA circular ens dona una banda ràpida i una sèrie de bandes que són més lentes (carrils 7-8); la banda ràpida és corre més que les altres perquè és la forma més superenrotllada de tots els DNA que tens, si tenim un dèficit de linking number la forma tancada serà molt més enrotllada el que li permetrà que migri més ràpid perquè hidrodinàmicament és més fàcil que passi pels forats del gel. La banda més lenta és aquell DNA que hidrodinàmicament li cosa més passar pels forats del gel d’agarosa de manera que és un DNA circular relaxat, que no té voltes superhelicoïdals, en aquesta banda tenim el DNA nickat i el relaxat circularment tancat (encara que no estigui nickat va lent).
Observem que entre les formes ràpides i lentes està ple de bandes, molt juntes, que fan una espècie de llapisada. Trobem bandes clares i definides, on cadascuna d’aquestes bandes és un topoisomer diferent, on entre una banda i la següent hi ha un increment de L unitari. Aquest aspecte permet que mirant els gels puguem conèixer els topoisomers presents perquè la variació de L sempre estarà determinada per un valor enter. Pensant en termes de W i T, qui s’emporta tota la càrrega de la tensió és W perquè sinó tindríem formes intermèdies i observaríem més llepisades.
Si mirem el DNA en microscòpia electrònica (DNA purificat, tractat i col·locat sobre una reixa) trobem des de formes quasi circulars a formes molt trencades però el que sí sabem és que tenen una gran variació de L, que en dissolució provoca que hi hagi també una variació de W, on els que tenen un valor més gran de W són més hidrodinàmics i poden passar de manera més ràpida pels forats del gel (si no fos així les bandes i les llapisades no serien ordenades).
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Utilització d’agents intercalants del DNA La segona eina que ens permet determinar l’estructura circular del DNA és l’ús dels agents intercalants del DNA. Hi ha molècules que tenen la propietat de ser planes: si a més, tenen les dimensions adequades es podran intercalar entre les parelles de bases del DNA.
Exemples d’agents intercalants Els agents intercalants són estructures aromàtiques i que solen tenir una gran quantitat de benzens. Podem trobar que siguin compostos totalment plans o bé parcialment plans com és el cas del bromur d’etidi que té l’enllaç al fenil alliberat de gir.
De totes les estructures que veiem a la imatge, la més coneguda és el bromur d’etidi (EtBr) que té una propietat molt bona quan actua com a agent intercalant i és que la seva fluorescència augmenta. Per tant, en els laboratoris és molt habitual emprar aquest compost pels estudis de DNA: es deixa sucat el gel en una dissolució aquosa que conté EtBr de manera que s’intercala allà on hi ha DNA i posteriorment es pot veure amb major facilitat a on en trobem.
Cal tenir present que s’ha de portar protecció quan il·luminem el gel amb llum ultraviolada ja que és perillós. Per tal de veure la fluorescència, es posa el gen dins d’una capsa de llum, coneguda com transil·luminador, que té uns tubs fluorescents; allà on trobem DNA apareixeran bandes de color vermell.
La cloroquina també es fa servir molt en els experiments de topologia però aquest compost no és fluorescent. Actua de la mateixa manera que el EtBr però no té la capacitat de tenyir el gel.
Efecte dels agents intercalants Observem una imatge obtinguda a partir de raigs X d’un dinucleòtid aparellat amb un altre dinucleòtid i entre mig de les parelles de bases que es formen hi trobem intercalat un bromur d’etidi. Observem com la part plana s’intercala clarament i el fenil, que té la capacitat de girar, en el cristall s’ha posat a 90°. Hem de tenir present que es podria trobar en un altre angle.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 El fet que s’intercali té repercussions en l’estructura de DNA. Recordem que, la doble hèlix del DNA s’enrosca i passa a una forma helicoïdal natural; l’EtBr ocupa un espai tot i ser una molècula plana de manera que quan les bases s’intentin recargolar no podran fer-ho com en un estat natural perquè no hi ha tant espai buit per ocupar.
En la següent imatge veiem a l’esquerra un dibuix d’una doble hèlix normal i si ens fixem podem determinar que el nombre de parelles de bases per volta és de 10,5. En la imatge de la dreta s’ha afegit un agent intercalant i quan comptem el nombre de parelles de bases veiem que augmenta fins aproximadament unes 13 pb/volta. Per tant, sembla que la longitud del DNA augmenta i aquesta conseqüència la podíem predir ja que estàvem afegint més material (agent intercalant).
Experiment 1: el DNA augmenta de longitud quan s’afegeix un agent intercalant Per tal de demostrar que la longitud del DNA augmentava quan s’afegia un agent intercalant es va realitzar una investigació on volien determinar què passava quan afegíem bromur d’etidi en el nostre DNA.
En aquest assaig no disposaven del DNA pròpiament circular sinó que tenien DNA unit a proteïnes; feien experiments utilitzant el microscopi electrònic amb nucleosomes que havien aconseguit que deixessin escapar del seu interior una part de DNA que contenien. Per tant, al microscopi electrònic veien part de proteïna, DNA i una llaçada de DNA.
Quan no s’afegia EtBr, la longitud de la llaçada era una determinada i a mesura que la concentració de l’agent intercalant augmentava, també ho feia la longitud de la llaçada. Van veure que aquesta longitud podia augmentar fins a un cert punt on l’increment de la longitud era mínim; en aquest moment, el DNA està saturat, és a dir, no li caben més bromurs d’etidi.
L’increment de la longitud en percentatge el podem calcular com: Van arribar a la conclusió que per cada dues bases s’hi pot posar un bromur d’etidi.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 A part de modificar la longitud del DNA, quan s’afegeix un agent intercalant la doble hèlix es desenrotlla bastant.
Aproximadament s’estima que 26° per cada molècula d’EtBr intercalada. Recordem que l’angle de twist és d’aproximadament de 36° de manera que, estem disminuint bastant aquest angle.
Si tenim un nombre de terminat de parelles de bases i afegim EtBr, les pb per volta augmenten i en conseqüència el valor de T ha de disminuir. Sabem que L es manté constant en el DNA circular tancat covalentment que estem estudiant. Per tant, segons el teorema topològic, el que haurà de canviar és W. Concretament, W ha d’augmentar. Recordem: En conclusió podem dir que la W d’un DNA CCC en presència de bromur d’etidi augmenta. Això vol dir que en un DNA relaxat, si afegim un agent intercalant quedarà superenrotllat.
Cal tenir present que a l’experiment anterior veiem únicament un augment de la longitud però no un augment en el superenrotllament. Això és degut que el DNA que utilitzaven per elaborar l’assaig estava nickat (trencat per una de les cadenes).
Experiment 2: el DNA augmenta el superenrotllament quan s’afegeix un agent intercalant Un experiment clàssic que va demostrar que el bromur d’etidi augmenta el superenrotllament del DNA és un experiment que es basava en la velocitat de sedimentació. Per tal d’elaborar aquest assaig s’emprava una ultracentrífuga i tubs amb gradients de sacarosa.
A la imatge veiem els resultats dels diferents tubs on trobàvem el mateix tipus de DNA però a concentracions creixents de bromur d’etidi. El que van observar és que de les velocitats de sedimentació elevades decreixien fins a arribar a un mínim i a continuació tornaven a créixer. Nosaltres partim d’un DNA natiu i amb W<0 ja que té un dèficit en L de manera que, quan el DNA es torna superenrotllat (degut a aquest dèficit) genera trenes superhelicoïdals cap a la dreta.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 La presència de bromur d’etidi augmenta W i això ho van voler demostrar experimentalment amb aquest assaig. Com més bromur d’etidi afegim, més increment de W hi ha. Per tant, si partim de W negatives i augmentem la concentració de EtBr estem fent increments de W; arriba un moment en el qual el valor de W negatiu és contrarestat i en aquest punt hem obtingut de manera artificial un DNA que no està superenrotllat. Cal tenir present que pel camí fins arribar a aquesta situació, on la velocitat de sedimentació és mínima, hi ha conformacions intermèdies.
A partir del mínim, el bromur d’etidi continua provocant voltes superhelicoïdals positives de manera que acabem obtenint una estructura tan trenada com la primera on les voltes van en sentit contrari a l’inicial.
Quan elaborem la centrifugació obtenim que la velocitat de sedimentació és la mateixa tant si està trenada cap a un sentit o l’altre ja que en essència la forma és la mateixa en quant al moviment pel gradient de sacarosa.
Amb aquest experiment va quedar demostrat que el bromur d’etidi és un agent intercalant que augmenta el valor de W.
ESTUDI DE LA TOPOLOGIA DEL DNA CIRCULAR Relaxació d’un DNA circular Es va intentar relaxar el DNA circular del bacteriòfag M13 que té unes 100.000 parelles de bases. Teníem una banda superenrotllada i una altre relaxada.
Volien aconseguir relaxar completament el DNA i per poder fer això, tal com estudiarem més endavant, per relaxar un DNA superenrotllat la manera més còmoda és fent servir enzims que modifiquen la topologia i que es coneixen com topoisomerases.
En el dibuix observem que si un agafa un DNA superenrotllat i el sotmetem a l’acció de topoisomerases obtenim un DNA relaxat. Quan van elaborar això amb el DNA del bacteriòfag M13 no obtenien un DNA relaxat.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Veiem un gel electroforètic d’un DNA que es volia relaxar. Al carril 2 es va afegir aquest DNA amb topoisomerasa després d’una incubació a 37°. En aquest cas esperaríem que les bandes corresponents a superenrotllament desapareguessin però no va ser així; van obtenir una banda que corresponia al DNA relaxat i altres bandes més primes.
Davant el dubte de no haver afegit el suficient enzim o no haver esperat el suficient temps com perquè el DNA es relaxés, van afegir-hi més i van esperar més temps. Van obtenir els mateixos resultats.
Per tal d’intentar solucionar això van afegir la DNAasa I que fa nicks i per tant, el DNA es relaxarà. A continuació, mitjançant una lligasa el nick es tanca i obtenim la forma relaxada. Després d’elaborar aquest procediment amb el DNA problema van tornar a obtenir les mateixes bandes.
El problema que tenien era que no pensaven en termes de química. Partien d’un DNA superenrotllat, llavors si tallem el DNA (tant pel camí superior o inferior de l’esquema), el DNA es relaxava i el tall havia de ser tancat covalentment mitjançant una lligasa. Al començament no tenien en compte que el DNA circular està en dissolució i en conseqüència s’està movent; per tant, en el moment de tancar-se, moltes molècules ho feien bé (banda principal) però algunes ho feien amb tensió superhelicoïdal la qual cosa depenia de l’energia tèrmica de l’aigua i la dels ions que es trobaven dissolts que feien que les molècules de DNA xoquessin. La tensió superhelicoïdal podia ser diferent, és a dir, unir-se amb major o menor tensió la qual cosa provocava que obtinguessin diferents bandes.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Electroforesi i agents intercalants: Determinació de ∆L Un altre problema que tenien és que en un gradient de sacarosa, ja que la migració de les molècules circulars supenrotllades tenen una velocitat de sedimentació idèntica si el supercoiled va cap a la dreta o cap a l’esquerra. Van aconseguir elaborar un gel que permet separar els + dels -, és a dir, aconseguir que les bandes mostrin els diferents topoisomers.
Volem veure com es resol el problema anterior de manera que elaborarem una electroforesi en que el gel contindrà agents intercalants, el que ens permet un coneixement millor i ens permet distingir el increment de L. Observem en aquesta imatge les principals diferències entre un gel normal i un gel que incorpora a la vegada un agent intercalant, com podria ser bromur d’etidi.
A l’elaborar l’electroforesi hem aconseguit que tots els topoisòmers quedin separats en el gel electroforètic que estem fent, el que dóna més potència a l’electroforesi, que ens permet resoldre completament la situació. Sabem doncs que si estudiem la topologia del DNA per electroforesi o bé per agents intercalants obtenim molta informació però si combinem les dues tècniques guanyem una gran potència tècnica i obtenim més informació.
Es pot escanejar el gel per determinar la densitat d’aquests gels dissenyant diferents densitometries, sent la banda mitjana la dominant i la resta les menys intenses de manera que quant més lluny del centre menys comú és.
Si elaborem un gel electroforètic normal (com els anteriors) només hi ha les bandes observades amb anterioritat i el desenrotllament sempre dona una distribució Gaussiana. De l’estudi de la distribució i la intensitat d’aquestes es veurà en cursos posteriors com a partir de l’equació de Boltzman podem elaborar aquest tipus d’ajut al gel per calcular l’energia que necessita la molècula per obtenir un mol de superhèlix.
Per mitjà d’una sèrie de càlculs s’arriba a determinar doncs que l’energia necessària per elaborar un mol de superhèlix és de 4Kcal/molt de manera que tenir el DNA supernerotllat no és gratuït, el DNA en la posició d’equilibri prefereix estar sense aquest desenrotllament però per motius de tensió ha d’augmentar la seva superhelïcodicitat de manera que, necessita per cada molt una determinada energia.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 PURIFICACIÓ DE DNA CIRCULAR Preparació del DNA circular El DNA circular que habitualment és fa servir en el laboratori per elaborar vectors de clonació és el DNA plasmídic o el DNA víric (de tipus bacteriòfag). Per isolar aquests petits DNA, que poden tenir de 1.000 a 7.000 parelles de bases, cal separar-los del DNA del bacteri, que és molt més gran, amb un milió o més parelles de bases.
Generalment tenim bacteris que tenen el seu propi DNA genòmic i a més a més contenen el DNA circular que nosaltres necessitem, ja sigui DNA víric o bé plasmídic. De manera que tenim, per exemple, un cultiu bacterià infectat i hem de tenir present en tot moment que el DNA bacterià, tot i que sigui circular (com en el cas d’E. coli) durant la manipulació quedarà trencat en petits trossos de manera que, ja no serà circular sinó que serà de caràcter lineal. Durant aquest tractament però, el DNA plasmídic i viral són prou petits com per no estar exposats al trencament i per tant, es mantindran íntegres i amb conformació circular.
Una de les tècniques per elaborar el tractament és introduir el la suspensió de DNA genòmic del bacteri un detergent, com SDS, i introduir a la vegada unes condicions de medi alcalí, el que ens permet trencar els bacteris, de manera que l’interior del bacteri s’allibera en el medi (conjuntament amb el DNA). Si a més, introduïm aquesta suspensió en un bany d’aigua bullint es produirà un augment de temperatura, el que provoca la desnaturalització, entesa en el sentit de separar les cadenes del DNA.
Així doncs, si sotmetem el DNA a temperatura elevada i un pH extrem (ja sigui alt o baix) sabem que les cadenes d’aquest DNA es dissocien, ja sigui un DNA de caràcter lineal o circular. El que passa és que en el procés de reassociació la cinètica que sofreix un DNA lineal comparat amb el d’un DNA circular és diferent:  En un DNA lineal perquè torni a formar doble cadena són necessaris dos passos: nucleació i propagació o efecte cremallera. Sabem doncs que primerament s’han d’aparellar algunes bases, el que provoca i permet, que s’aparellin a continuació totes les altres. Aquest primer pas de nucleació és molt lent, mentre que el segon pas és molt més ràpid. Podem determinar doncs, que la formació nova de doble cadena és un pas lent.
 En el DNA circular, com que hi ha enllaços topològics, tot i que augmentis la temperatura la cadena de Watson i Crick no es poden separar de manera que, la reassociació és molt més ràpida.
Amb aquest procediment arribem a tenir DNA desnaturalitzat però al retornar a les condicions fisiològiques el DNA genòmic estarà pràcticament tot desnaturalitzat mentre que el DNA circular petit serà de doble cadena i perfectament regenerat. El DNA lineal el trobarem amb algunes parelles associades i altres, de manera que, es pot entendre com una mena de magma d’un gran agregat que al centrifugar es quedarà en el precipitat. Així doncs, en elaborar una centrifugació obtindrem un sediment, equivalent al DNA genòmic, i un sobrenedant, les molècules de doble cadena que han quedat intactes.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 En el següent gràfic observem com el DNA lineal al introduir-se d’un pH neutre cap a un pH àcid té un efecte hipercròmic, les dues cadenes es separen, però llavors, quan retorna al pH neutre observem que hi ha una certa recuperació de l’absorció inicial tot i que no acaba de baixar, sinó que és manté més alta, el que ens està dient que el DNA lineal es manté, en gran proporció, en una situació en que les dues cadenes no estan hibridades. En el cas del DNA circular podem observar que sí retorna a la normalitat.
Purificació del DNA Al manipular el DNA circular, com en un procés de descongelació, tindrem una part que serà: DNA circular covalentment tancat, DNA circular nickat i inclús, podem arribar a tenir una part que és DNA lineal. El que volem nosaltres és obtenir únicament el DNA covalentment tancat, de manera que necessitem elaborar una purificació del DNA.
Un exemple de purificació és la ultracentrifugació en gradients de clorur de cesi. Aquesta tècnica consisteix en agafar un tub i posar DNA conjuntament amb el clorur de cesi convenient (punt molt delicat) i en presència de bromur d’etidi. Un cop ja temin la barreja elaborada cal remenar-ho tot plegat per obtenir una dissolució homogènia que es posa dins la centrífuga. Hem de tenir present que aquesta centrifugació s’elabora a tant alta velocitat que durant aquesta s’establirà espontàniament un gradient de clorur de cesi, de manera que, al llarg del tub s’anirà produint un augment de la concentració de clorur de cesi (recordem que els gradients de sacarosa són preformats mentre que els de clorur de cesi s’autoformen durant la centrifugació).
La centrifugació s’elabora a gran velocitat de manera que si el tub no estigués completament ple i no hi hagués aire en aquest (que és de plàstic) quedaria deformada, la part que no tindria mostra quedaria aixafada i per tant, al acabar la centrifugació tindríem un tub deformat que no serviria per analitzar. És per aquest motiu que el tub s’omple fins amunt amb oli o aigua i al final el tap es fon de manera que obtenim la mostra hermèticament tancada. Si l’experiment no s’elabora correctament el rotor de la centrifuga es trenca.
La centrifugació és un experiment és una tècnica molt subtil: si posem més clorur de cesi del que toca mentre dura aquesta centrifugació sabem que la concentració local de cesi va augmentant i per tant, si en passem de la concentració, tenint en compte el temps i la temperatura, a la part d’abaix podem trobar clorur de cesi molt concentrat que ja no serà soluble i per tant, es formaran cristalls de clorur de cesi. Tenint present que la centrifugadora gira a una gran velocitat és com si aparegués una espècie de “pedra” que al dipositar-se pot travessar ell tub i trencar el rotor (que és de titani).
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Introducció de bromur d’etidi El bromur d’etidi s’introdueix perquè el DNA lineal o el DNA circular nickat, tal com hem demostrat, aproximadament per cada 2 parelles de bases entra 1 molècula de bromur d’etidi. En el DNA circular en canvi, per molt que introduïm el bromur es generen valors positius de W i per tant, el DNA es va recargolant fins a un moment que no pot admetre bromur d’etidi. Cal tenir presten però que el DNA circular uneix menys bromur d’etidi. La densitat del DNA lineal/nickat és baixa en comparació amb la densitat del DNA circular de manera que, quan hi ha molt bromur d’etidi l’estructura cilíndrica presenta trossos en que és més prima (just on està el bromur) i per tant, segueix un patró de ample – prim – ample... En aquesta situació en que no tot l’espai està ocupat per molècules orgàniques es provoca que hi hagi una densitat menor a la lineal. Observem en el següent gràfic la velocitat de sedimentació dels diferents tipus de DNA en funció de la concentració de bromur d’etidi: quan acabem la centrifugació tenim que el DNA circular nickat/lineal com que té una densitat menor surt amb una banda diferenciada de la banda de DNA circular covalentment tancat. El clorur de cesi que es troba en la zona ens indica la densitat del DNA i per tant, és una centrifugació d’equilibri perquè s’atura en un punt d’equilibri quan totes les densitats estan en el punt en que el DNA té la densitat al clorur de cesi.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Solució per la centrifugació Recordem que el pas de centrifugar és un pas difícil ja que en el rotor sabem que els tubs sempre van penjant perpendicularment i es disposen en perpendicular a aquest. Tot i això, tal com hem comentat anteriorment existeixen problemes:  Triga molt de temps. El gradient de clorur de cesi sense la velocitat adequada pot trigar en formar-se dies i és perillós augmentar la velocitat per no trencar el motor de manera que el temps en arribar a l’equilibri és lent.
 Hi ha perill de trencament del rotor per la formació de cristalls.
Generalment els tubs van penjats amb unes pinces metàl·liques i en girar el rotor també giren.
Els mecànics s’han inventat rotors de titani en que els tubs van posats dins d’uns forats i la centrifugació, mentre dura, els tubs no es disposen en perpendicular, sinó que es queden en vertical. Aquesta nova tècnica presenta avantatges:  Com que és molt sòlid es requereix menys temps perquè puguem anar a més velocitat. A més, el gradient de clorur de cesi s’ha d’establir en una longitud molt gran (en el primer cas) mentre que en aquest cas, s’estableix entre la paret del tub que està més lluny i la que està més propera al rotor, de manera que, el gradient es forma entre una longitud més petita el que provoca que es formi de manera més ràpida.
 Hi ha menys perill de ruptura.
Fent la centrifugació en rotors verticals reduïm doncs el temps de dies a hores y ens ha de quedar clar que el gradient sempre s’estableix entre el punt que té menys força de rotació i el que té més força.
La formació de bandes també depèn del tipus de rotor que utilitzem en cada cas, és a dir, en si utilitzem el primer mètode o bé el segon:  En el primer cas la divisió de bandes és que trobem una banda ràpida i una curta. Sabem que els tubs es tornen a la posició vertical quan la centrifugació acaba però aquesta baixada es produeix tant lentament que provoca que les bandes estiguin tant bé separades com quan es produeixen en el cas horitzontal.
 En el segon cas les bandes que es formen són en vertical però quan el motor es va aturant arriba un moment en que el gradient es reorienta de manera que les bandes es s’orienten horitzontalment, on estan molt més separades que no en les verticals.
En un rotor és molt important que tots els vectors força siguin compensats en la direcció oposada i si això no s’elabora correctament es trenca l’eix de la centrifugadora.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Obtenció de la mostra purificada Recordem que el tub no es pot destapar ja que l’havíem tancat fonent el plàstic de manera que en el moment en que es vol treure la mostra necessitem que entri aire dins d’aquesta. Per poder obtenir la mostra el que fem és clavar una agulla a dalt de tot per permetre l’entrada d’aire i per un altre cantó posar una tira de celo en el tub perquè al punxar, com que els tubs són de plàstic hi ha perill que s’esquerdin.
Per veure les bandes cal que tinguem una làmpada ultraviolada i per tant, veurem les bandes molt fluorescents gràcies a la presència de bromur d’etidi. Hem de tenir present que per elaborar aquesta tècnica cal portar protecció (màscara, ulleres, bata, guants...) perquè la llum ultraviolada és molt perillosa i a més, el bromur d’etidi és potencialment cancerigen.
Per treure el DNA es punxarà cada banda i com que hi ha una entrada d’aire per la part superior, si donem una inclinació a l’agulla el líquid sortirà amb facilitat.
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 ESTUDI DE LA TOPOLOGIA DEL DNA II Topoisomerases Observem el següent experiment on tenim les següents disposicions en quant als carrils:  Carril 1: DNA relaxat  Carril 2: DNA supernerotllat que s’està tractant amb una topoisomerasa de tipus I  Carrils que segueixen: el DNA que tenim està relaxat però hem afegit un particular tipus de topoisomerasa anomenada girasa, de tipus II, que es troba en bacteris.
En general les topoisomerases de tipus II (o també anomenades topo II) en general relaxen, però en el cas especials dels bacteris el que genera és un supernerotllament del DNA.
D’aquesta manera, el que s’elabora durant l’experiment és agafar el DNA relaxat i afegir topoisomerasa II, que es deixa actuar durant un temps (diferents carrils de 3-5) per tant, el que aconseguim és introduir superhèlix de manera que en cada carril tenim bandes superenrotllades amb diferents intensitats. Perquè les topoisomerases actuïn com girases han d’estar en presència d’ATP, de manera que si només introduïm l’enzim topo II no obtindrem el resultat esperat.
La gran diferència entre les dues topoisomerases que hem introduït és que, observant el gel, veiem que en les topoisomerases I trobem 8 bandes seguides que estan bastant juntes mentre que en les de tipus II en canvi, sempre hi manca una banda intermèdia, veiem que tenim dues bandes separades però que entre elles, falta una banda que si trobem en el cas de les topoisomerases I. Aquesta diferència la notem perquè les topoisomerases I elaboren increments de L amb unitats de 1, mentre que les topoisomerases II els elaboren amb unitats de 2.
Abans de conèixer l’estructura es sabia que per la funció que fan les topoisomerases I tant sols agafant les dues cadenes, fent un tall i agafant l’altre cadena i passant-la pel tall el que aconseguim és un increment d’una unitat de L.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 En canvi, si agafem un model de cinta, en que cada cinta és una cadena de DNA, si fem un tall en les dues cadenes, passem la doble cadena pel forat, segellem amb “celo” el tall i llavors veurem que, si separem les dues cadenes el que es forma és un increment en dues unitats de L, un increment doble respecte el primer mètode.
No es coneixia l’estructura de les topoisomerases però es va poder estudiar la seva funció. Per entendre el funcionament de la topoisomerasa cal entendre que és una estructura que enrotlla el DNA, hem de pensar que elabora un tall de les dues cadenes i pel forat que genera, passem la part d’abaix, segella el tall i per tant, això ha canviat la orientació, la hèlix que era cap a la dreta ara és cap a l’esquerra de manera que W= -1, el que defineix l’increment com: ∆W = -1-1=-2. Com que hi ha hagut un tall també es produeix un canvi en L, que és equivalent al canvi en W, de manera que W=L=-2.
El que és important és que la topo II té missions, té funcions molt importants en la gestió del DNA dins la cèl·lula ja que el pot relaxar, i aquesta relaxació és, a vegades, molt important i necessària. Si es fan nusos en el DNA aquesta topoisomerasa és perfecta perquè a base de tallar les dues cadenes els pot desfer.
En la següent figura observem que té una estructura concreta en forma de pota, que pot obrir-se o tancar-se de manera que en funció d’això observarem un espai, una obertura a baix.
L’espai que es genera és tan gran com perquè hi càpiga una cadena de DNA tallada transversalment. Amb experiments realitzats in vitro s’ha demostrat que la topo II permet tallar el DNA i una vegada està tallat passar entremig d’aquest no una cadena sinó inclús una doble cadena de DNA i això lliga amb tot el que esperem de la gestió del DNA dins la cèl·lula.
22 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Quan la cadena està interaccionant amb la topoisomerasa es genera un tall, en la figura C del procés veiem que una tirosina queda unida covalentment i transitòriament en aquesta cadena, el que genera un canvi de conformació de manera que l’enzim obre el forat, la boca, el que genera un espai perquè s’introdueixi la doble hèlix. Quan ja estan en aquesta posició, l’enzim uneix covalentment els dos fragments de DNA. Així doncs aquest és en essència el mecanisme d’actuació de la topoisomerasa: tallar una monocadena, obrir pas per una altre cadena. Hem de tenir present que aquest és el procés trobat in vitro, i no se sap si poden existir modificacions al procés natural.
L’estructura de la topoisomerasa II té un espai que es pot obrir, de manera que funciona patint canvis de conformació importants. El mecanisme queda recollit en el següent esquema que observarem on la barra clara representa el DNA i la més fosca un tros de DNA. Ens podem imaginar que el DNA clar forma un cerca i que l’altre està ficat dins d’aquest, i el que volem és que l’estructura concatenada es desfaci. També ens podem imaginar un embolic de DNA en el nucli en que hi hagi un tros d’aquest que no es pugui posar on li correspon i per tant, es necessari tallar, deixar passar i tornar a unir.
La relació sempre és que hi ha la unió en la part de a dalt d’una de les cadenes, llavors intervé l’ATP, que és totalment necessari per elaborar les reaccions. És en aquest moment en que entra en joc la segona cadena; la primera cadena queda tallada (les cadenes hem de tenir present que són doble cadena i sempre és tallat tant la cadena de Watson com la de Crick). La topoisomerasa II pateix un canvi conformacional de manera que, per l’espai passa la cadena més fosca. Al final, hi ha un altre canvi conformacional i aquesta cadena és exposada, que queda lliure en dissolució. La segona cadena també serà alliberada de manera que s’ha desfet totalment en concatàmer o l’embolic de DNA.
23 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Estudis de Keller al 1975 Abans de centrar-nos en els seus estudis recordem que hi havia 3 mètodes per estudiar la topologia: agents intercalants, electroforesi i topoisomerases. Gràcies a aquests 3 elements s’ha permès fer coses molt sofisticades de cara a l’estudi del DNA circular.
Keller basarà el seu treball amb un virus molt utilitzat en l’investigació, el virus del silis número 40 (SV40), un virus que infecta cèl·lules animals i té aproximadament 5.000 parelles de bases. El que proposa és mesurar el valor del increment de linking number o el nombre de superhèlix que el DNA té en la natura, és a dir, quan extreus el DNA, la forma superenrotllada natural quin grau de superenrotllament té, quantes voltes superhelicoïdals presenta.
Els resultats més destacats els observem en les següents imatges. Els dos primers gels (a, b) són equivalents i en el carril 11 és on està el problema, el gen natural del SV40 extret de cèl·lules d’animals infectats ens dóna una banda ample i bastant ràpida però necessitem referències per saber el W, per conèixer el grau de superenrotllament. Aquestes referències que són tant necessàries les construeix Keller de manera que totes les mostres dels carrils 1 al 10 serviran com a referència.
És bo tenir referències amb diversos nivells de superenrotllament de manera que, cal agafar varis tub i per cada carril generar un tub nou en el qual introduirem DNA circular i bromur d’etidi a diferents concentracions i topoisomerasa I. Recordem que la topo I relaxa el DNA superenrotllat de manera que, com que el bromur d’etidi introdueix diversos nivells de W la topo I treballarà de forma “enganyada” en els tubs de reacció, perquè relaxarà un DNA que té un superenrotllament artificial, provocat pel bromur d’etidi, el que ens donarà el DNA relaxat. Quan trèiem el bromur d’etidi i la topoisomerasa I deixem el DNA lliure i el que hem aconseguit és que ens quedi amb diferents valors de W en cada tub ja que en cadascun teníem una concentració de bromur d’etidi diferent; quan retirem el bromur d’etidi el DNA pateix un superenrotllament equivalent la concentració d’etidi que abans estava present. D’aquesta manera, el que Keller aconseguia és tenir una col·lecció de 10 mostres on les primeres tenien poc W i aquest anava augmentant de forma successiva, on la mostra 10 tenia un superenrotllament important.
Amb aquests gels no podem fer encara una determinació de W perquè són bandes molt gruixudes de manera que el que es va fer és elaborar encara més gels electroforètics de les mateixes mostres però en presència de bromur d’etidi (c,d,e,f).
El bromur d’etidi en l’electroforesi permet separar bé les bandes superhelicoïdals, els diferents topoisòmers. La banda gruixuda es converteix en unes bandes més clares que corresponen a uns quants topoisòmers- hem de pensar que per l’efecte de l’agitació tèrmica les mostres tinguin un topoisòmer principal i altres satèl·lit. Observant els gels sabem que en (e) s’aconsegueix parcialment mentre que en (f) no s’aconsegueix perquè hi ha molta concentració de bromur d’etidi.
24 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 S’elaboren molts gels amb diferents concentracions de bromur d’etidi però no tots són útils sinó només uns quants. Si elaborem una densitometria de qualsevol carril el que tindrem és una col·lecció de topoisòmers que tenen una banda més alta (que és la central) i altres subsidiàries. Recordem que el que volem és establir una relació en funció de la concentració de bromur d’etidi el els tubs i el nivell de superhèlix. Cada punt correspon en el lloc central i la barra de dispersió correspon als satèl·lits, que cobreixen altres bandes. Amb els patrons que elabora, aconsegueix construir la gràfica següent.
El gel (c) és el millor ja que la mostra problema sabem que està en el carril 11. Cal buscar en el gel una banda propera, el que ens porta a la banda obtinguda en el carril 9. El valor que obtindrem de w és de -24 a una temperatura de 27 graus i presència de clorur de sodi (NaCl) de 0,2M.
Gels bidimensionals Per elaborar un gel bidimensional posem la mostra en un carril s’elabora un cert recorregut que ens dóna en una banda una sèrie de topoisòmers.
Una vegada tenim aquesta experimentació elaborada es dóna la volta al gel i si aquesta era la primera dimensió s’agafa el gel i es desmunta per elaborar la segona dimensió. En aquesta segona dimensió s’introdueix bromur d’etidi o un altre agent intercal·latius de manera que, en la primera dimensió tenim un carril en bades que es converteix amb un seguit de punts, que es poden interpretar tots i cadascun d’ells atribuint un valor de W positiu o negatiu. Per elaborar aquest experiment cal assumir sempre que dins del gel l’increment de T és sempre nul i per tant, necessariament un increment de L suposa un increment de W.
REPERCUSSIÓ DE LA TENSIÓ SUPERHELICOÏDAL AMB FUNCIONS DE REPLICACIÓ O TRANSCRIPCIÓ Considerem sempre un DNA amb 360 parelles de bases. En el primer dibuix podem observar la forma relaxada del DNA en que tenim 36 voltes de doble hèlix, L=36 i W=0. Si afegim una girasa i ATP s’introdueixen voltes superhelicoïdals i s’elabora un canvi en L, en que ∆L=-4 de manera que L=32, T=36 i W=-4 (tenim 4 voltes superhelicoïdals). Sabem que 35 és el mateix número que teníem abans i això és perquè l’estructura de W&C està respectada, és a dir, tenim tantes voltes com abans. Ara canviem a la tercera figura, en que es respectarà i no es canviarà L de manera que ∆L=0 el que ens permet parlar del mateix topoisòmers perquè L es manté amb L=32 (respecte la figura 2). En aquest cas però traurem voltes superhelicoïdals de manera que W=0 (∆W=+4) i T=32 voltes de doble hèlix.
25 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular. T3 Això ens permet veure que per estabilitzar la tensió del DNA podem repartir les voltes de forma homogènia o bé podem posar 32 voles i posar la resta del DNA fora d’aquestes de manera que, el que es demostra és que quan hi ha tensió superhelicoïdal una manera de relaxar el DNA és que part de la seva estructura surti de la doble hèlix. En quest cas hi ha unes 40 parelles de bases que han de sortir de l’estructura per tal que, el DNA sigui potencialment funcional. Aquest DNA si surt de l’estructura de doble hèlix està més accessible i és més fàcil de replicar o transcriure perquè per aquests processos necessiten de la separació de la doble hèlix.
La tensió superhelicoïdal pot portar a situacions d’obertura de la doble hèlix amb significat funcional. Cada 10 parelles de bases que passen a aquesta estructura anomenada bombolla hi ha un increment de W d’una unitat positiva.
Proposta d’un problema relacionat amb la transcripció (Wang) Tenim un DNA que ha de produir RNA i perquè la polimerasa pugui fer la feina és necessari que es faci una bombolla, una zona de doble hèlix oberta perquè es pugui funcionar l’enzim polimerasa.
Imaginem que la polimerasa va fent la seva feina de manera que, va produint RNA i el que s’ha anat produint en la mesura que la polimerasa es desplaci tindrem una cadena més o menys llarga.
La topoisomerasa s’esquematitza com que va girant la cadena de DNA i per tant, el DNA que es va formant també gira.
L’altre cosa que va passar és que si, la part d’abaix no gira el que passa és que el DNA es compacta per una part i per l’altre es descompacta. Així doncs, el DNA naixent no té problemes d’unir-se però hem generat dos problemes topològics diferents: el que ja presenta el DNA i el que s’ha introduït en la transcripció.
El DNA que està darrera de la topoisomerasa ha quedat desenroscat i el que estava davant supernerotllat de manera que:   DNA esquerra: el nombre de parelles de bases per volta augmenta o ∆T < 0 si mantenim ∆W=0 o ∆W <0 si mantenim ∆T = o DNA dreta: el nombre de parelles de bases per volta disminueix o ∆T > 0 si mantenim ∆W=0 o ∆W>0 si mantenim ∆T=0 Si una topoisomerasa avança i no gira es genera un gran embolic topològic que s’ha de tenir en compte alhora d’entendre què és el DNA i com funciona.
26 ...