DISTÀNCIES EVOLUTIVES (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2013
Páginas 7
Fecha de subida 18/10/2014
Descargas 21
Subido por

Descripción

Professor: José Domínguez

Vista previa del texto

Problemes DISTÀNCIES EVOLUTIVES Les característiques utilitzades en taxonomia microorganismes han estat sobretot fenotípiques: - clàssica per classificar els Morfològiques.
Fisiològiques i metabòliques.
Ecològiques.
Mobilitat.
Presència de pigments.
Sensibilitat a antibiòtics.
Es fa servir una taxonomia numèrica per classificar, segons les característiques morfològiques i fisiològiques. S’han de comparar molts caràcters per poder-ho fer així, almenys 50, i millor centenars. Es fa una comparació numèrica de la qual surt una matriu de similitud i un dendrograma.
1 significa característica present, i 0 característica no present. Així, a és el nombre de característiques presents als dos organismes, b el nombre de característiques presents només a l’organisme B, c el nombre de característiques presents només a l’organisme A, i d el nombre de característiques que no són presents en cap dels dos organismes.
Aquest quadre ens permet calcular el coeficient d’aparellament simple: a+d a+b+c+d Com més s’acosti a 1 el coeficient d’aparellament simple, més s’assemblaran els dos organismes. Però això podria ser perquè d és molt alt, i llavors seria tot el contrari. Per tant no és molt fiable.
Llavors fem servir el coeficient de Jaccard: a a+b+c Eliminant les característiques que no tenen cap dels dos organismes, sí que podem dir que com més s’acosti a 1 el coeficient més s’assemblaran els dos organismes.
Problemes A part de les característiques clàssiques, la taxonomia també estudia característiques moleculars: - Contingut de G+C.
Hibridació d’àcids nucleics.
Ribotipat.
Anàlisi de seqüències de DNA, RNA i proteïnes.
En el contingut de G+C, es calcula el tant per cent d’aquests nucleòtids que té un organisme sobre el total de nucleòtids de l’ADN, i es compara el resultat amb el d’altres organismes. No és gaire definitiu, però és una guia. Això és perquè no ens dóna informació de les seqüències, ja que organismes molt diferents poden tenir percentatges semblants.
G+C x 100 A+T+G+C Pel que fa a l’anàlisi de la seqüència que codifica per l’ARN 16S, és el que fa la filogènia molecular. Aquestes seqüències s’anomenen cronòmetres moleculars. El nombre de diferències en aquestes seqüències són proporcionals als canvis mutacionals que han patit, i per tant també són directament proporcionals al temps que fa que es van separar els dos organismes.
Problemes EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR L’epidemiologia és la ciència que estudia l’origen, causes, freqüències, prevalences, incidències... de les infeccions. Ho estudia a nivell molecular.
Brot epidèmic en ambient hospitalari: augment del nombre de casos d’una malaltia infecciosa per sobre del normal.
Ex: fa temps en un hospital es van detectar nombroses infeccions per Klebsiella pneumoniae en malalts pluricomplicats i greus properes en l’espai i el temps. K.
pneumoniae és un patogen oportunista que s’aprofita d’algun problema en el sistema immunològic.
S’han d’aplicar mesures perquè no torni a passar: - Prendre mostres ambientals.
Estudis epidemiològics dels malalts (i possibles afectats), i fer un control en el temps.
Congelar les soques dels aïllaments de les mostres ambientals i dels malalts.
Neteja exhaustiva de les instal·lacions (per eradicar la font d’infeccions).
Es va comprovar que les soques aïllades eren totes fenotípicament iguals, però s’ha de comprovar també si estan relacionades epidemiològicament i si són iguals genèticament.
Per decidir si estan relacionades epidemiològicament s’ha de mirar de quin malalt s’han aïllat les mostres, de quina planta, si hi ha possibilitat de relació entre els afectats... és a dir, si les característiques circumstancials coincideixen.
Per comprovar que són iguals genèticament es fan anàlisis moleculars: PDGF, Electroforesi en camp polsat (Pulsed Field Gel Electrophoresis Method). Es talla el DNA per seqüències molt concretes i s’observa si en tots els microorganismes s’ha tallat el mateix nombre de vegades i als mateixos llocs.
Es posen els cromosomes dels microorganismes amb enzims de restricció de baixa freqüència, és a dir, la seqüència diana que talla l’enzim es troba molt poc, i per tant en resulten trossos grans, visibles i quantificables, però no tant grans com per no poder passar pel gel d’agarosa.
Després es posarà el DNA tallat de cada microorganisme en un gel d’electroforesi i en sortirà un patró de bandes característic. Si d’una soca a una altra desapareix una seqüència de tall, en l’electroforesi el patró de bandes és diferent. Si en el gel, en diferents microorganismes, trobem el mateix nombre de bandes i en la mateixa posició, i a més coincidien en les característiques circumstancials de l’aïllament, podem dir que es tracta de la mateixa soca.
Si és la mateixa soca podem dir que sí que hi ha hagut un brot epidèmic, i que no ha estat simplement un fet causat per casualitat al mateix temps per dos microorganismes diferents.
Problemes Metodologia de la PFGE 1. Suspensió en un tub de la soca provinent d’un malalt.
2. Posar la suspensió dins un fragment semisòlid d’agarosa.
3. S’apliquen als bacteris enzims que tallen la paret i la membrana i alliberen el DNA.
4. Es talla l’ADN afegint a la suspensió els enzims de restricció de baixa freqüència.
5. En el gel sòlid d’agarosa de l’electroforesi es fan forats amb una “pinta”, on es posen els fragments d’agarosa amb els fragments de DNA tallat. Cada mostra està en un forat diferent. El fragment d’agarosa ha de tocar per la banda on erls fragments de DNA correran.
6. Com els trossos de DNA són massa grans per moure’s en una electroforesi normal, es fa servir la de pols creuat. La direcció en la que va el corrent elèctric va variant i també la força. Amb això s’aconsegueix que els fragments més petits es moguin més i els més grans menys.
A part de les mostres, també s’havien posat mostres controls de microorganismes aïllats en anteriors brots epidèmics i d’altres microorganismes que tenen poc a veure.
Es compara el patró de bandes entre soques. Si hi ha la mateixa distribució de bandes per quasi totes les mostres, estarem parlant de la mateixa soca, i per tant serà un brot epidèmic. Si hi ha diferent distribució de bandes, no seran la mateixa soca i per tant no serà un brot epidèmic.
Hi ha softwares que comparen la similitud: - 0~1 diferències: mateixa soca.
- 2~3 diferències: soques estretament relacionades.
- 4~6 diferències: soques possiblement relacionades amb anterioritat.
- 7 o més diferències: soques no relacionades.
(Tot depèn del nombre de bandes que es creïn).
Problemes A més, les mostres control també mostren si el brot epidèmic té algú a veure amb altres brots anteriors.
Exemple Klebsiella pneumoniae: Es van prendre 65 mostres més 5 mostres control. Les control eren: - 1 soca no multiresistent.
2 soques multiresistents però amb antibiograma diferent.
2 soques multiresistents aïllades 12 mesos abans de l’estudi.
El resultat de la comparació dels patrons de bandes va donar que: - 52 soques eren idèntiques.
11 estaven estretament relacionades.
7 possiblement relacionades.
Tot això va fer arribar a la conclusió de que havia estat un brot epidèmic, i que per tant calia replantejar-se el tema de la neteja a l’hospital.
Problemes AVALUACIÓ D’UNA PROVA DIAGNÒSTICA Primer de tot s’ha de detectar quan una persona està malalta, que és el que l’afecta: - - - Variabilitat biològica: detecció de glucosa, anticossos... elements que variïn la seva concentració normal per la presència d’organismes patògens. Saber que els nivells de glucosa varien no ens serveix per saber a quin gènere o espècies pertany el microorganisme patogen.
Valors de referència: per saber quins són els valors pels quals una persona està infectada o malalta per una malaltia, s’ha de comparar amb un grup control de persones sanes.
També hem de saber els resultats que donen les tècniques de diagnòstic per al grup control, pels sans i pels malalts, és a dir, caracteritzar-los.
Valoració tècnica/clínica: la valoració tècnica d’una tècnica ens diu si realment serveix per detectar microorganismes, i la clínica si té algun ús real en la detecció d’infeccions.
(Ex: hi havia una tècnica de detecció molecular que detectava DNA víric que tenia una valoració tècnica molt bona, però detectava casos en nens petits que realment no tenien el virus, per tant la valoració clínica era dolenta).
Les tècniques de diagnòstic han de ser primer molt sensibles per detectar si una persona està malalta, i després molt específiques per detectar exactament el microorganisme que les causa. Hi ha tècniques sensibles que no són específiques, i a la viceversa.
Característiques dels mètodes de diagnòstic: Resultats Positiu Malalts Veritablement positius (VP) Falsos negatius (FN) Negatiu Control Falsos positius (FP) Veritablement negatius (VN) Sensibilitat: capacitat de la tècnica per detectar els malalts.
VP S= ·100 VP + FN Especificitat: capacitat de detectar els realment sans com a sans.
VN E= ·100 VN + FP La sensibilitat i l’especificitat depenen de la qualitat de la tècnica.
Valor predictiu positiu: probabilitat de ser realment positiu si ets detectat coma positiu.
VP VPP = VP + FP ·100 Problemes Valor predictiu negatiu: probabilitat de que un detectat com a negatiu sigui realment un negatiu.
VN VPN = VN + FN ·100 ...