TEMA 4 - Sistemes de reparació (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Mutagènesi
Año del apunte 2015
Páginas 10
Fecha de subida 08/04/2015
Descargas 10
Subido por

Vista previa del texto

MUTAGÈNESI PARCIAL 1 Tema 4 – Sistemes de reparació del DNA INTRODUCCIÓ 09/03/15 Procariotes i eucariotes comparteixen quasi tots els sistemes de reparació. De tots els sistemes de reparació del DNA presents a la taula, que corresponen a E. coli, l’únic que no portem a terme els organismes eucariotes és el sistema SOS.
Sobre el primer sistema de la taula, la detoxificació, cal dir que no és estrictament un sistema de reparació, ja que el que fa és evitar que el DNA pugui patir el dany oxidatiu. Si evitem el dany, no el reparem. Per tant, qualsevol mecanisme que sigui de detoxificació, no és de reparació. Actua abans, impedint que es faci el dany. La detoxificació impedeix simplement la formació de lesions al DNA. La superòxid dismutasa és un exemple de compost que evita el dany oxidatiu del DNA.
39 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 Els mecanismes que restauren la situació inicial sense errors (per exemple, els que eliminen dímers, els que eliminen uracils, els que eliminen els alquils... tots aquells enzims específics) els anomenem mecanismes de reversió del dany, i són lliures d’error (error free).
DÍMERS DE PIRIMIDINA Els dímers de timina (o pirimidines en general) són l’efecte característic de les radiacions UV (no ionitzants). En bacteris, trobem la fotoliasa. La fotoliasa és un enzim que reconeix el dímer de pirimidina i, si capta un fotó per activar-se, és capaç de desfer el dímer de timina.
Però si els bacteris es troben en un lloc fosc, tot i que la fotoliasa pot reconèixer el dímer i situar-s’hi a sobre, no pot fotoreactivar-se i no pot desfer el dímer amb un procés de fotoreacció. El que sí pot fer és tallar el dímer i eliminar-lo. Llavors, fent servir les dues adenines de l’altre monocadena de motlle, es poden tornar a posar dues timines que no estiguin en forma de dímer. Si aquest procés es fa malament, es crearà una mutació puntual.
Els eucariotes no tenim fotoliases, i complementem el tros de cadena que falta usant com a motlle la cadena que falta.
40 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 Uracil GLICOSILASA A vegades el DNA pot contenir uracils per error. La cèl·lula pot disposar de glicosilases específiques (U-Glicosilasa) que reconeixen els uracils i els eliminen. El gap que queda, es complementarà amb la base corresponent, cosa que no serà difícil si tenim motlle. Si es comet un error en posar la base es crearà una mutació puntual.
SISTEMA GO En la imatge, tenim un dany oxidatiu.
Aquest dany s’ha fet per la “base més sensible”, la guanina (la G acostuma a ser la base més danyada oxidativament). Quan la G s’oxida es converteix en 7,8-dihidro-8oxoguanina (8-hidroxiguanina). La 8hidroxiguanina (o GO) correspon a dany oxidatiu.
L’enzim encarregat d’aquest sistema de reparació és la Formamido-PirimidinaDNAglicosilasa (FaPy).
Si ara hi ha una replicació, què pot passar? Tenim 3 opcions. Pot ser que la replicació mantingui la base oxidada. Pot ser que l’altra cadena incorpori l’A perquè la GO actua, o pot ser que si la cèl·lula disposa de la glicosilasa específica (FaG) el que farà 41 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 selectivament és eliminar la base oxidada. Acabarem amb citosina sola i la GO ja no la tindrem.
Repararem perquè la C era la base original. Per tant al cap de dues rondes el dany ja s’ha normalitzat. Ara bé, si ens queda la GO, el més normal és que davant de la GO ens quedi una C.
I tornaríem a estar al principi.
ALQUIL-TRANSFERASES 11/03/15 Tenim una base (en aquest cas una G) metilada en la posició de l’oxigen 6 (podria ser una altra base alquilada en una altra posició, es tracta d’un exemple). Si en un DNA hi ha bases alquilades i aquest DNA s’ha de replicar, aquests poden induir aparellaments incorrectes i normalment provoquen transicions. Aquí intervenen uns enzims específics (metil transferases o alquil transferases o transferases de grups alquílics) que van passejant i quan veuen un alquil, s’hi col·loquen i el capturen. Si la transferasa reconeix i treballa correctament la base torna a ser l’original evitant el possible efecte mutagènic dels agents alquilants.
La metil transferasa enganxa el grup alquil per la cisteïna – la cisteïna és la responsable de segrestar el grup alquil. Un cop l’enzim s’emporta el grup alquil, l’enzim s’inactiva. Pot ser que el sistema enzimàtic que funciona mitjançant les transferases se saturi. Per tant, en situacions de molta alquilació, no solucionaria el problema.
Les bases alquilades que no hagin estat reparades per aquest mecanisme podrien ser reparades per escissió. La reparació per escissió és una reparació de tipus generalista – serveix per tot però no és específica de cap dany en particular. Per això són millors els sistemes que actuen preferentment en cada situació.
Quan hi ha moltes alquilacions pot haver una resposta adaptativa – la cèl·lula genera la possibilitat de produir més enzims per poder reparar aquest dany.
42 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 Aquesta resposta adaptativa no existeix en organismes eucariotes, és una resposta característica de bacteris on està actuant el que s’anomenen regulons. La diferència entre un operó i un reguló és el fet que els regulons s’activen quan és necessari. Això es veu representat en l’esquema d’abans. Les seqüències que veiem a dalt estan especificant la seqüència promotora del gen en concret. Si no hi ha alquilació, cada un dels gens està produint unes proteïnes, uns productes/enzims a un nivell basal. Per tant, com no hi ha dany, la cèl·lula no necessita reparar i per tant no necessita estimular la producció de proteïnes implicades en la reparació.
Recordem que quan es diu que un gen “no està treballant”, no vol dir que no hi hagi producte gènic – sempre hi ha mínima expressió, la que anomenem expressió basal.
En l’esquema, se’ns metilen les bases G i T. Tenim un senyal que indueix l’activació de la transcripció per tal de poder assolir un nivell alt de reparació.
El gen ‘ada’ és el gen fonamental d’aquest reguló, i produeix la proteïna dibuixada N-C. Cada una d’aquestes proteïnes pot capturar dos grups metil. Quan el producte del gen ada ha estat metilat, aleshores aquest producte es col·loca en la regió promotora del gen corresponent i la interacció del producte metilat és un activador molt potent de la transcripció d’aquests gens.
Per tant tenim una situació inicial sense alquilació amb poques molècules i una situació final amb alquilació i una gran quantitat de molècules.
Altres cèl·lules opten per una via apoptòtica més que per una via de reparació.
NER – REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE NUCLEÒTIDS En aquesta figura tenim una reparació per escissió. Tenim un o més dímers de pirimidines (TT, CC, TC, CT). Tenim dues senyals, que poden estar més o menys lluny, que ens indiquen que les endonucleases tallen a banda i banda del dany, sigui dímer o sigui un adducte o un altre dany.
Tota la regió serà eliminada – venen les exonucleases. Com que a la cadena de sota tenim la informació correcta, la fem servir de motlle per sintetitzar el tros prèviament eliminat. Això ho fan les DNA polimerases.
Si la DNA polimerasa actua de manera fidel i no hi ha cap error, aquesta reparació per escissió conduirà a una situació on no hi ha cap canvi a nivell de cap base. S’ha desfet el dímer i s’ha recuperat la seqüència correcta. Però aquests mecanismes no són error free – les escissions, en implicar polimerització, comporten freqüentment errors.
Un cop la polimerasa ha actuat, tenim una espècie de ‘cullera’ – en qualsevol procés que hi hagi hagut talls i polimerització, per tornar a restaurar la integritat o continuïtat del DNA, ha d’actuar la lligasa.
43 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 BER – REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE BASES També trobem sistemes de reparació per escissió de bases, no de nucleòtids.
En aquesta imatge només hi ha una alteració.
Aquesta base alterada és reconeguda per una glicosilasa específica i és eliminada. Ens quedarà un lloc a-bàsic, en aquest cas de la imatge, a-purínic.
En aquests casos recordem que es pot introduir la base correcta o no. L’acció de la lligasa és important per restaurar la integritat del DNA.
Una alteració d’una base que fos molt grossa (afegim un adducte voluminós), difícilment seria reparada per BER. Una adducte distorsiona una cadena – s’acostuma a reparar per NER.
Totes les alteracions que impliquen distorsions grans de la molècula es reparen per NER.
Tenim un tall a banda i banda i la restauració.
Imaginem una reparació per BER i per NER – les dues poden cometre errors. En quina de les dues podem esperar més magnitud quanta incorporació d’error? En les NER ja que s’ha de polimeritzar.
44 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 En aquesta imatge tenim les bases ben aparellades excepte en el centre, on tenim una T aparellada amb una G – missmatch. Un missmatch es pot reparar perfectament escindint un trosset allà on es troba i esperant que la polimerasa actuï bé i canviï la T per la C o la G per la A.
En la imatge, perquè s’elimina la G i no la T? Una de les dues seqüència té GATC repetits amb A metilades.
S’eliminarà la base de la cadena on no hi hagi la metilació. Això és correcte si parlem de bacteris – en els bacteris aquesta discriminació es molt senzilla perquè la cadena de nova síntesi encara no està metilada, i això fa que l’enzim quan arribi sàpiga on tallar, sap quina és la cadena patró. Però si els enzims arriben quan ja s’ha donat la metilació en la cadena filla, si el procés no va coordinat amb la síntesi, ja no discriminaran entre la cadena nova i la vella. Llavors eliminarà una base aleatòriament amb 50% de probabilitats d’encertar.
Aquest mecanisme no està prou dilucidat en eucariotes/mamífers/humans. Això no vol dir que no disposem d’aquest mecanisme, però no se sap ben bé quina és la manera que té el sistema de discriminar la cadena vella de la nova. S’acostuma a dir que es discrimina gràcies als fragments d’Okazaki, que estan associats a la replicació i presenten discontinuats, talls de reunió i així es podria saber quina és la nova i quina és la vella.
REPARACIÓ POSTREPLICATIVA Inicialment tenim un DNA sa. S’origina un dímer de timines. Si aquest fragment es replica, tenim un problema, ja que el dímer no és reconegut per la polimerasa i si la replicació avança (que podria bloquejar-se) deixa un forat (gap). Pot passar que es doni una mena d’intercanvi (que recorda a la recombinació) de manera que es generi un dúplex recombinant sense cap tipus de dany, i un altre amb els dímers (gaps).
45 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 LA REPARACIÓ SOS Aquest mecanisme, present a E. coli i a altres bacteris relacionats, actua quan al DNA hi ha molts errors, com buits, dímers o altres distorsions, que dificulten la replicació. Aleshores el bacteri indueix l’expressió d’uns 25 gens que actuen de manera cooperativa, i els productes dels quals permeten que la replicació es produeixi en aquests tipus del lesions, a costa de la seva fidelitat.
Es tracta d’un sistema només demostrat en bacteris. No es descarta que pugui haver mecanismes semblants en organismes superiors.
La transcripció dels gens implicats en la resposta és regulada al menys en part per un repressor comú: el repressor LexA, producte del gen lexA. Entre aquests altres gens implicats trobem recA, uvrA, uvrB, uvrD, sulA i sulB.
El sistema implica la proteïna RecA. Aquesta proteïna és activada pel DNA de cadena senzilla, interacciona amb la LexA i causa la seva escissió, suprimint la seva activitat repressora i induint d’aquesta manera la resposta.
RecA s’uneix a les zones de ssDNA. Però hi ha molts fragments tallats i per tant molts fragments a replicar. En aquestes situacions, les DNA polimerases que no són les normals, repliquen afegint les bases que volen – són polimerases conduents a error. Hi ha molts nucleòtids equivocats. Això és positiu perquè es manté la integritat i continuïtat del cromosoma, la cèl·lula pot viure i es pot replicar. Si després a l’hora de replicar ja no està agredida, tots els mutàgens ja estan eliminats, potser a la cèl·lula li dóna temps d’anar corregint els aparellaments erronis que s’hagin pogut produir. De totes maneres és una reparació tendent a error, l’activitat fonamental de la qual és la supervivència del bacteri i la integritat del bacteri.
La denominació SOS és deguda a que és l’últim recurs que té la cèl·lula per minimitzar el dany en el seu DNA. Es tracta d’un mecanisme que només actua quan amb els altres sistemes de reparació no hi ha hagut prou per reparar el dany genètic – actua en situacions extremes d’emergència.
Quan s’ha activat el sistema, la forca de replicació, en lloc d’aturar-se perquè la cadena motlle conté múltiples errors, avança sobre la regió afectada. Això és possible gràcies a que els enzims dels sistema SOS tenen condicions molt laxes pel que fa a l’aparellament de bases i afegeixen nucleòtids molt sovint de manera incorrecta. A més, el sistema corrector de proves de la polimerasa també està relaxat per tal de permetre que la polimerització es produeixi malgrat la distorsió existent.
Per les seves característiques, la reparació SOS és mutagènica però permet que la cèl·lula sobrevisqui al dany en el DNA.
46 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 En aquest esquema surten els gens més interessants implicats en la resposta SOS. Quin és el mecanisme que dispara aquest procés? Quan la proteïna RecA és activada. I quan s’activa? Quan el DNA troba trossos o fragments de cadena senzilla. Aquests fragments poden correspondre a dues situacions: a una escissió o a que la replicació no pot avançar i la forca estigui oberta. Sigui quina sigui la causa primera, quan trobem reiteradament gaps, s’activa RecA, que catalitza els dímers de LexA. Quan LexA, que és el repressor del sistema, no està alterat, està bloquejant l’expressió dels gens implicats en SOS.
Alguns dels enzims implicats en el sistema són: 47 MUTAGÈNESI PARCIAL 1 La gràcia del sistema SOS és que permet que s’incorporin bases a la cadena encara que siguin errònies. Si la replicació no es pot dur a terme, el bacteri no es pot dividir (desapareix del mapa). Amb el sistema SOS s’aconsegueix seguir endavant amb la replicació i es manté la integritat del cromosoma (segueixes tenint el bacteri). Si se sobreviu, els errors que ha produït el sistema SOS potser poden ser reparats més tard. Les mutacions causades pel sistema SOS poden ser beneficioses en un medi que canviï ràpidament i amb facilitat.
Es tracta d’un sistema molt estudiat en E. coli. En llevats, alguns gens tenen respostes induïbles semblants a la resposta SOS, però no és el mateix.
Si el dany que el bacteri experiment a nivell genètic és un dany moderat, el sistema SOS no es dispara. El bacteri repararà el que calgui amb els sistemes de què disposi. Només usarà el SOS en casos d’extrema necessitat.
REGULACIÓ DE LA RESPOSTA ALS AGENTS QUE CAUSEN DANY GENÈTIC EN EUCARIOTES En els llevats, s’ha demostrat l’existència de gens induïbles per l’exposició de genotoxines.
Però no s’ha posat de manifest el funcionament d’un reguló equivalent al sistema SOS bacterià. Això vol dir que d’alguna manera els eucariotes tenim gens que són activats en resposta a unes condicions determinades.
Existeixen gens clarament involucrats en la mutagènesi: RAD (radiation sensitivity). Aquest gen actua en la reparació per escissió de nucleòtids. Per exemple: el RAD51 és un gen humà que codifica una de les proteïnes implicades en la reparació de trencaments de doble cadena.
Recordem que els ssb són fàcilment reparats, mentre que els dsb són els que comporten més defectes. Els membres de la família RAD51 són homòlegs als RecA bacterians i Rad51 dels llevats (per fer referència al RAD en humans l’escrivim en majúscules loki).
També tenim el RNR (ribonucleòtid reductasa) i la POL1 (polimerasa α) que possiblement estan involucrats en la reparació per recombinació. El gen DIN és un altre d’aquests gens induïbles pel dany per radiació, però no se sap exactament què fa.
Molts gens es posen en funcionament de forma coordinada per augmentar l’eficiència.
En mamífers, a més dels gens de reparació, hi ha altres gens induïbles, com són els responsables dels factors de transcripció, de creixement, de protecció i de proteïnes associades amb la inflamació. L’aturada del cicle cel·lular pot ser una resposta al dany genètic – és una estratègia per evitar les conseqüències del dany si aquest es replica. Però amb aturar-lo no hi ha prou. En cèl·lules eucariotes, sovint es dóna el fenomen de l’apoptosi, que és la mort cel·lular programada.
En els cromosomes de les cèl·lules eucariotes que entren en processos apoptòtics trobem freqüentment trencaments dobles i dany oxidatiu, seguits d’una condensació del nucli i de la cèl·lula en general ja que, una vegada morta, és fagocitada.
48 ...