TEMA 4. SISTEMES EN ESTAT ESTACIONARI (MFA – Metabolic Flux Analysis) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Biologia de sistemes
Año del apunte 2016
Páginas 12
Fecha de subida 26/03/2016
Descargas 15

Vista previa del texto

Biologia de Sistemes TEMA 4: SISTEMES EN ESTAT ESTACIONARI (MFA – Metabolic Flux Analysis) SISTEMES METABÒLICS EN ESTAT ESTACIONARI Exemple de situació de referència: bioreactor RCTA en estat estacionari.
L’estat estacionari simplifica molt els càlculs que hem de fer. És un moment en el qual estudiar el sistema és més fàcil.
A partir de les diverses fonts d’informació es poden construir models estequiomètrics per estudiar el metabolisme, generalment seguint un procés iteratiu. Es construeixen macromatrius (en el cas de l’humà de 7000 files), on en cada fila hi ha un component cel·lular i en cada columna hi ha una reacció. La majoria d’elements de la matriu seran 0, ja que la majoria de components no participen en la majoria de reaccions. Només hi haurà un 1 o un -1 quan un component participi en una reacció com a substrat o producte.
A partir d’aquesta macromatriu farem equacions diferencials. No només hem de posar els components que es consumeixen i es generen en reaccions metabòliques, sinó que també hem de posar reaccions de consum destinades a formar components estructurals de la cèl·lula. Això s’afegeix posant reaccions de biomassa. A més també es molt important determinar la quantitat d’ATP del sistema. Hem de saber que sempre es genera més ATP del que es pot tenir en compte estequiomètricament (i que es gasta, per exemple, en el manteniment de les dents).
49 Biologia de Sistemes Es poden fer diferents tipus d’estudi segons la informació disponible i els objectius: Després d’haver creat la matriu, hi ha mètodes que estudien les seves característiques i com utilitzarles en un entorn d’optimització.
GT.v=0 vol dir que els estudis es fan en l’estat estacionari.
Es poden trobar solucions particulars si mesurem alguns fluxos (a, b i c).
O es pot fer una anàlisi de l’estructura del sistema a partir de l’espai convex, que conté totes les solucions possibles del sistema (d).
O es pot estudiar el sistema a partir de l’espai nul (e).
LAL 50 Biologia de Sistemes Les xarxes metabòliques es defineixen a partir dels seus constituents fonamentals: les reaccions.
Posem com a exemple una reacció senzilla tal com la catalitzada per la catalasa: H2 O2 ↔ H2 O + O2 Noms alternatius per abreujar: 2A = 2B + C (Recordem posar els coeficients estequiomètrics en l’abreviació també).
Reordenació convencional: posem tots els components a la banda dreta de l’equació i, primer els productes i després els substrats: 0 = 2B + C − 2A Així queden els productes amb un coeficient positiu i els substrats amb un coeficient negatiu. En realitat els coeficients no són únics: es poden multiplicar o dividir per una constant sense variar la relació. Per exemple, l’equació també podria ser: 0 = B + 0,5C − A Conceptes bàsics a recordar: - Els coeficients estequiomètrics relacionen el nombre de molècules que intervenen. Es poden escalar mantenint la proporcionalitat.
Els signes dels coeficients depenen de la direcció escollida.
Les reaccions són reversibles i avancen cap a l’equilibri.
A l’equilibri les velocitats directa i inversa són iguals.
Els enzims acceleren la reacció però no poden canviar les condicions d’equilibri.
Les reaccions molt desplaçades cap a productes es poden considerar a la pràctica com a irreversibles. Solen estar molt lluny de l’equilibri quan operen normalment, i en condicions normals seria molt difícil fer canviar el sentit de la reacció.
Els components de la reacció metabòlica, però, també estan afectats per reaccions de transport: Per cada un dels components que intervenen hi ha d’haver una equació de balanç. Com ja hem vist en tots els sistemes vius es compleix el principi de conservació de la matèria que es pot representar com: Acumulació = Generació + Entrada – Sortida L’acumulació entesa com la derivada d’un component.
Es pot escriure una equació de conservació o balanç per cada metabòlit: 𝑑(H2 O2 ) = −2 · 𝑟1 + 𝑡1 − 0 𝑑𝑡 Acumulació Sortida Generació Entrada 51 Biologia de Sistemes 𝑑(H2 O) = 2 · 𝑟1 + 0 − 𝑡2 𝑑𝑡 𝑑(O2 ) = 𝑟1 + 0 − 𝑡3 𝑑𝑡 Per treballar és convenient expressar-ho com matrius i vectors. En el següent exemple es tenen en compte els components dins (int) i fora de les cèl·lula (ext): Sabent el volum del bioreactor, la quantitat de cèl·lules, la concentració dels components i els fluxos d’entrada i de sortida del bioreactor podem calcular fàcilment el transport de components que es dóna entre l’interior i l’exterior de les cèl·lules.
Cada fila de la matriu estequiomètrica representa un balanç a cada metabòlit intern o extern i representa una restricció que s’ha de complir.
Per a molts estudis només és necessari tenir en compte les concentracions internes. Llavors només mirem la part superior de la matriu. Això també es deu a que normalment les velocitats d’entrada i sortida per als metabòlits externs són fàcilment mesurables, per la qual cosa ens concentrem en els metabòlits interns.
52 Biologia de Sistemes D’aquesta manera queda descrit de forma general un sistema de qualsevol grandària. Si tenim Si metabòlits i els seus corresponents coeficients estequiomètrics nij per cada reacció j llavors tindrem: 𝑟 𝑑𝑆𝑖 = ∑ 𝑛𝑖𝑗 𝑣𝑗 𝑑𝑡 𝑗=1 - r: número de reaccions.
j: número de la reacció.
i: número de metabòlit.
Si: concentració del metabòlit.
vj: velocitat de reacció.
nij: coeficient estequiomètric.
En aquests casos assumirem que el canvi de concentració de metabòlits només depèn de les reaccions expressades i no d’altres factors com la difusió (en un sistema homogeni la concentració és igual a tot arreu).
Per als casos senzills també considerarem que la dilució deguda al creixement cel·lular és negligible respecte al canvi degut a les reaccions (efecte de les reaccions entre 100 i 1000 vegades més gran. Turnover – o taxa de recanvi – elevat).
En forma de matrius i vectors: - N = {nij}: matriu estequiomètrica. Cada fila (i) és un metabòlit, i cada columna (j) és una reacció.
S = [S1, ... Sn]T: vector de concentracions de metabòlits.
v = [v1, ... vr]T: vector de velocitats de reacció.
p = [p1, ... pm]T: vector paràmetres.
Les concentracions dels metabòlits depenen del valor dels paràmetres, i les velocitats de reacció depenen de les concentracions dels metabòlits i del valor dels paràmetres: S = S(p) ; 𝑣 = 𝑣(𝑆, 𝑝) Per exemple: 𝑣= 𝑣𝑚𝑎𝑥 · 𝑆 𝐾𝑀 + 𝑆 ; 𝑝 = [𝑣𝑚𝑎𝑥 , 𝐾𝑀 ] Amb aquesta nomenclatura podem escriure una equació que descriu el balanç sencer: 𝑑𝑆 =𝑆=𝑁·𝑣 𝑑𝑡 O també: 𝑑𝑆 = 𝑁 · 𝑣(𝑆(𝑝), 𝑝) 𝑑𝑡 53 Biologia de Sistemes Un estat que interessa és l’estat estacionari. L’estat estacionari es defineix com “aquell estat dinàmic en què les variables (concentracions de metabòlits) no canvien amb el temps”. Si les variables que descriuen el sistema no varien, la derivada és zero: 𝑑𝑆 =0 𝑑𝑡 0 = 𝑁 · 𝑣(𝑆(𝑝), 𝑝) En un estat metabòlic estacionari anomenarem flux metabòlic a: 𝐽 = 𝑣(𝑆(𝑝), 𝑝) És a dir, els fluxos metabòlics equivalen al conjunt de velocitats de reacció que s’estableixen en l’estat estacionari (no confondre la J amb el Jacobià..... ok :’) com si sabés què és).
En un cas general l’equació: 𝑑𝑆 = 𝑁 · 𝑣(𝑆(𝑝), 𝑝) 𝑑𝑡 - És un sistema d’equacions habitualment no lineal on les velocitats de cada reacció depenen de les cinètiques de cada enzim.
A la majoria de casos aquests sistemes no tenen solució analítica i s’ha de recórrer a una solució numèrica. És a dir, hem de resoldre les equacions diferencials amb mètodes numèrics, i no de forma analítica.
- En un cas en estat estacionari ideal ( 𝑑𝑡 = 0) les concentracions de metabòlits no varien - i els fluxos són constants.
En aquest cas els fluxos es poden determinar si es disposa d’una informació mínima (en una situació ideal tenim un sistema homogeni): 𝑑𝑆 0=𝑁·𝑣 - La matriu N conté informació de totes les vies metabòliques considerades i delimita les solucions possibles. El seu estudi ja dóna informació valuosa.
ANÀLISI DE LA DISTRIBUCIÓ DEL FLUX Visions generals del metabolisme com xarxes complexes: TOPE DE LAL 54 Biologia de Sistemes Visió del metabolisme com una estructura en “forma de corbatí” (Bowtie): Hi ha un metabolisme central al qual van a parar o en surten la gran majoria de vies metabòliques. Totes les vies llavors es poden simplificar dient on comencen i on acaben.
Les cèl·lules es poden assecar i llavors podem mesurar el pes sec de proteïnes, lípids, glúcids, o d’un aminoàcid en concret. Així podem arribar a saber quants mols de glicina es necessiten per construir una proteïna, o quants grams d’una determinada proteïna calen en un orgànul. Així, podem posar una sola en les vies de biosíntesi i dir en general la quantitat que s’ha produït del component que sigui (serien les fletxes grises en l’esquema de la dreta). Simplificant així els models passarien a tenir només unes 150-200 files.
Tot i que el metabolisme és una xarxa complexa, freqüentment n’hi ha prou considerant el metabolisme central (sempre que transporti la majori part del carboni).
En molts casos interessa calcular la distribució dels fluxos metabòlics d’una xarxa donat que es troben directament relacionats amb el seu estat fisiològic. Per determinar-los es necessiten mesures experimentals. Podem reformular el sistema inicial tal com: 0 = 𝑁𝑐 · 𝑣𝑐 + 𝑁𝑚 · 𝑣𝑚 S’agrupen les reaccions en dues matrius que inclouen, respectivament, els fluxos calculats i els mesurats: 𝑁𝑐 · 𝑣𝑐 = −𝑁𝑚 · 𝑣𝑚 = 𝑏 𝑁𝑐 · 𝑣𝑐 = 𝑏 Un cop separades les dues matrius deixem de tenir un sistema homogeni, i tenim un sistema lineal, que pot ser determinat, sobredeterminat o subdeterminat.
- Sistema completament determinat: nombre d’incògnites = nombre de files de la Nc = rang(Nc).
Sistema sobredeterminat: nombre d’incògnites < nombre d’equacions (assumint nombre d’equacions = rang(Nc)) 55 Biologia de Sistemes - Sistema subdeterminat: nombre d’incògnites > nombre d’equacions (linealment independents).
SISTEMA DETERMINAT Exemple senzill (l’estequiometria d’aquest esquema és de mol a mol): Llavors si creem la matriu N per trobar la solució , veiem que hi ha més incògnites que equacions.
Hi ha 6 incògnites i el rang de la matriu és de 4. Per tant tenim 2 graus de llibertat. Això vol dir que hem de mesurar experimentalment com a mínim 2 variables. Suposem que mesurem v1 i v5. I obtenim els valors de l’esquema de dalt.
Ara reordenem l’equació matricial, separant entre les variables mesurades i les que encara són incògnites, i trobem la solució: SISTEMA SOBREDETERMINAT Imaginem que en el sistema anterior mesurem una variable més de les necessàries, per exemple mesurem també v6.
Ara tinc més equacions de les necessàries, per tant puc prescindir de les que em sobre. Si tinc 3 incògnites em puc quedar només amb 3 equacions. Aquesta és la solució del matemàtic: pensa que amb el mínim d’informació en té suficient perquè les mesures són exactes.
56 Biologia de Sistemes Però els biòlegs sempre fan mesures més cops dels necessaris per després fer-ne la mitjana i hagi assegurar-se que l’error sigui mínim. Així tenim una desviació que ens diu la confiança de la mesura. Per tant ens interessa més fer servir tota la informació i aplicar estratègies del tipus de mínims quadrats, i no pas eliminar una de les equacions. El mètode de mínims quadrats quan tenim matrius i vectors es fa amb la pseudoinversa (preferentment la de Moore-Penrose..... ok, no sé quina és jajajajaj).
57 Biologia de Sistemes SISTEMA SUBDETERMINAT No hi ha una solució única. Tenim diferents possibilitats: - Fer servir el Kernel i un criteri d’optimització per seleccionar una solució d’entre les possibles.
Afegir informació experimental (habitualment basada en marcatge amb 13C).
Afegir noves restriccions.
Seguim amb l’exemple anterior, i imaginem que en aquest cas només hem mesurat v1: Si anem donant valors diferents a α anem veien que canvien les solucions del sistema. La majoria de mols se’n poden anar per “la vida de dalt” o cap a la “via de baix”. Les diferents solucions calculen les possibles distribucions de fluxos per les vies.
Consideracions per tots els casos: la bondat de la solució depèn del condicionament de la matriu Nc i de la propagació de l’error experimental.
EXEMPLE D’UTILITZACIÓ DEL CÀLCUL DE FLUXOS: SÍNTESI DE LISINA A C. glutamicum 58 Biologia de Sistemes L’esquema de la pàgina anterior és un model del metabolisme central. Es comparen dos casos, i podem veure com la distribució de fluxos és diferent. En aquest cas s’ha intentat trobar quines són les distribucions de fluxos que s’han de canviar per maximitzar la producció de lisina. El primer que hem d’anar a veure són les ramificacions de branques, i comparar els dos esquemes.
Les que estan encerclades en vermell són les que canvien. Passar de no produir lisina (té un flux de 0,2 a l’esquema de l’esquerra) a produir-ne (té un flux de 30 a l’esquema de la dreta) fa que canviï la distribució de fluxos en les primeres ramificacions del sistema.
Ara observem però uns altres esquemes del mateix metabolisme. En aquest cas els canvis que es fan en la distribució de fluxos no serveixen per augmentar la producció de lisina, sinó justament per disminuir-la (encara que només una mica): Exemples perquè veiem que el càlcul de fluxos té una utilitat: buscar punts de control del sistema per modificar-los i fer que es produeixi més o menys d’un component. Per exemple en l’esquema de la dreta es posa un inhibidor d’un dels passos per redistribuir el flux cap a la producció de lisina.
Però la idea no surt bé: el flux es redistribueix cap al piruvat en comptes de la lisina.
59 Biologia de Sistemes Anàlisi de fluxos metabòlics amb 13C Si no hi ha prou informació per resoldre la xarxa metabòlica s’obté més informació per mitjà de la tècnica de marcatge amb 13C.
60 ...