Tema 7 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Biologia de la Reproducción
Año del apunte 2014
Páginas 12
Fecha de subida 18/02/2015
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

BR- Tema 7 TEMA  7:  DIAGNÒSTIC  GENÈTIC  PREIMPLANTACIONAL   (DGP)   1. OBJECTIUS,  INDICACIONS  I  CANDIDATS   Objectiu: dur a terme una caracterització genètica dels embrions (preimplantacionalment) de manera que puguem transferir aquells diagnosticats com a sans. En alguns casos s’analitzen els oòcits, en aquest cas s’anomenaria diagnòstic preconcepcional.
Candidats: - Parelles amb risc elevat de transmissió d’anomalies genètiques o Portadors de malalties monogèniques (com FQ) o Portadors d’anomalies cromosòmiques Aquestes parelles, no nomes tenen la DGP com a opció, sinó també la donació d’oòcits/espermatozoides...
- Millorar resultats dels cicles de reproducció assistida o Avortaments de repetició: la idea del DGP es que l’embaràs per repetició pot ser degut a anomalies cromosòmiques, amb la DGP les detectarem i podrem transferir els embrions sans.
o Fracassos cicles previs: podem pensar que els embrions que es formen son cromosòmicament anormals o Edat materna o Factors masculins: els pacients amb una oligospèrmia severa, per exemple, poden produir més gàmetes amb anomalies cromosòmiques.
- Altres: o Compatibilitat HLA (benefici per tercers): podem triar un embrió que tingui compatibilitat amb un germà malalt (per utilitzar la sang de cordó per un transplantament al germà malalt) o Risc de malalties d’aparició tardana: risc càncer, evitar el risc que l’individu pateixi un càncer, com el càncer de mama.
Primers naixements: Els primers naixements utilitzant DGP van ser el 1990 i a Espanya el 1993 (entre la UAB i la Dexeus).
La llei de les tècniques de reproducció assistida del 1988 ja era molt oberta, molt progressista aquí a Espanya i molt aviat es va incorporar la opció de poder fer selecció d’embrions per raons mèdiques. Al 2006 va sortir una nova llei, que permet també realitzar DGP però amb uns supòsits i condicions.
Tots els candidats es poden abordar dins del marc legislatiu.
  1   BR- Tema 7 2. OBTENCIÓ  DE  BIÒPSIES   Per fer el DGP, necessito tenir embrions in vitro, per tant, és imprescindible que hi hagi una fase de reproducció assistida per obtenir els oòcits o embrions (encara que la parella no sigui infèrtil, han de passar per TRAs). Es la gran majoria de casos s’aplica una ICSI (FIV), per tal d’aconseguir el màxim nombre d’embrions, però en alguns casos és obligat utilitzar ICSI: Són casos en que no podem córrer el perill de contaminació per una cèl·lula externa (no podem tenir un espermatozoide per allà perquè contamina).
En segon lloc, necessitem equips de micromanipulació i personal expert, per tal de poder agafar un embrió sense que li passi res.
1. Obertura  de  la  zona  pel·∙lúcida   Una vegada tenim els oòcits, s’hi ha de fer una obertura en la zona pel·lúcida, aquesta es pot fer de diferents maneres: a. Per mètodes mecànics b. Per una solució enzimàtica o química c. Polsos de làser en la zona pel·lúcida (fotòlisi). És el més utilitzat (però el més car i difícil) 2. Obtenció  de  biòpsies: Aquestes biòpsies les analitzarem. Es poden obtenir per: a. Aspiració de corpuscles polars: Es un diagnòstic basat en oòcits, estirem els corpuscles polars. Podem aspirar tant el primer corpuscle o el segon corpuscle, si aspirem el primer, analitzarem l’oòcit sense fecundar i si aspirem el primer i el segon, l’analitzarem després de la fecundació.
i. El principal avantatge d’aquesta tecnologia és que treballar amb corpuscles polars, que no son cèl·lules funcionals, es mes legal en alguns països on no es pot treballar amb embrions. A més, al ser cèl·lules de rebuig no tindrà cap efecte per l'oòcit.
ii. Però el principal inconvenient és que només podré veure característiques de l’oòcit.
iii. La tècnica és igual de complexa que la DGP amb embrions.
  2   BR- Tema 7 b. Aspiració de blastòmers: es retira un blastòmer (i en casos extrems 2) al dia 3 de la fecundació (estat de 6-8 blastòmers). Es fa l’orifici a la zona pel·lúcida i amb una punta s’entra dins l’embrió pel forat i s’aspira un blastòmer. Això ha de ser amb molta cura perquè no l’hem de trencar i. Retirar un blastòmer en un estadi de 8 cèl·lules té poc efecte detrimental en la resta d’embrió (la majoria de vegades els embrions no es bloquegen). En general, només es treu un blastòmer.
ii. El principal avantatge es que es poden detectar tant factors masculins com femenins.
iii. La principal limitació és que disposem de molt poques cèl·lules per analitzar (una i en pocs casos dues).
iv. És la tècnica més utilitzada en DGP.
c. Escissió de cèl·lules del trofoectoderm: es fa en l’estadi de blastocist (dia 5-6). A través de l’orifici de la zona pel·lúcida s’estira una mica les cèl·lules del trofoectoderm amb una pipeta, llavors amb el làser es fa un tall.
i. El principal avantatge de treballar amb aquesta tècnica (igual que l’estudi de blastòmers) es que podem veure tant factors masculins com femenins ii. Un segon avantatge de l’estudi de cèl·lules del trofoblast es que tenim moltes cèl·lules iii. La principal limitació de la tècnica es que extraient trofoblast els embrions es poden bloquejar.
L’ideal és poder tenir el resultat de l’anàlisi a temps per fer la transferència, sense haver de congelar els embrions. Es millor no haver de congelar els embrions, això implica que si treballem estudiant cèl·lules del trofoblast tinc mol poc temps per fer l’estudi (un dia, ja que al dia 6 ja es transferiren els embrions) per any quan es fa biòpsia de trofoblast, es solen congelar els embrions.
Quan s’està fent la biòpsia hem d’assegurar-nos que la/es cèl·lula/es tenen nucli!!!: La resta de l’embrió es deixarà en cultiu in vitro o es congelarà. Amb el temps de cultiu in vitro en principi tindré el resultat de la biòpsia, i si l’embrió es normal, transferiré l’embrió.
Si no tinc els resultats a l’hora de la transferència, he de congelar els embrions.
  3   BR- Tema 7 3. Anàlisi  genètica  de  la  biòpsia:     a. l’anàlisi genètica ha de anar dirigit a la indicació de cada parella (si te una translocació, estudiar els cromosomes implicats en la translocació) b. ens hem de basar en procediments validats (test fiables) perquè tenim poques cèl·lules c. hem de fer uns tests ràpids per evitar la congelació • Principal limitació: quantitat de material per l’anàlisi. Només tenim una cèl·lula (6 pg de DNA), per tant, no tots els anàlisi genètics possibles es podran aplicar a DGP.
• Representativitat d’una /unes poques cèl·lules. La cèl·lula que analitzem és representativa de la resta de cèl·lules? Podríem tenir mosaics? Sabem que les primeres divisions poden generar mosaïcismes per tant podria ser que la cèl·lula no fos representativa, però en general, hi ha molt pocs falsos diagnòstics. Per tant en el DGP donem per fet que la cèl·lula que analitzem és representativa de la resta d’embrió.
• Processat individual de cada biòpsia • Manipulació acurada de les biòpsies: hem d’evitar perdre la cèl·lula, que es trenqui, contamini...per tant les condicions de treball han de ser molt precises i estèrils.
Podem fer diferents estudis genètics en la biòpsia: CARACTERITZACIÓ CITOGENÈTICA: Es basa en determinar si existeixen cromosomopaties (veure si l’embrió té el nombre o estructura de cromosomes alterat o normal). Es pot fer mitjançant - FISH - Array de CGH FISH (hibridació in situ fluorescent sobre nuclis interfàsics) És una FISH interfàsica.
- Extensió: la cèl·lula que hem retirat s’ha d’estendre sobre un portaobjectes. No l’estenem de la formula típica sinó que deixem caure la cèl·lula al porta mirant-la pel microscopi i li tirem Carnoy mirant a on va. L’extensió és molt important.
FISH estàndard: A continuació fem un processat per FISH estàndard (hibridació, desnaturalització...) Valoració en un microscopi de fluorescència Opcions diagnòstiques: Amb la FISH es pot detectar: o Determinació sexe (amb sondes pel cromosoma Y i X) o Desequilibris cromosòmics   4   BR- Tema 7 o Screening d’aneuploïdies: en aquest cas, utilitzarem panells de sondes per les aneuploïdies més típiques. Això ho hem de fer per rondes, ja que no tenim suficients fluorocroms per mirar tants cromosomes alhora.
És important utilitzar una combinació de sondes adequada per l’estudi que volem fer, molt especialment quan volem analitzar possibles embrions desequilibrats en portadors/es d’anomalies cromosòmiques constitucionals Limitacions: o No permet estudiar tots els cromosomes alhora o No detecta reorganitzacions equilibrades (no podem diferenciar un embrió normal d’un que porta una reorganització equilibrada).
Exemples: - - - Pacient MV,E1: S’han utilitzat sondes centromèriques per l’X (vermell), ,Y (blau) i 18 (verd).
Pacient MV, E8: s’han utilitzat les mateixes sondes que en el cas anterior però el pacient és diferent. Es pot intuir el cromosoma Y. En aquest cas la foto s’ha fet amb un filtre múltiple de manera que es veu el DAPI i el blau del Y s’intueix. Però el diagnòstic no es fa mai amb un filtre múltiple, sinó que es van canviant els filtres per colors, per assegurar que realment les marques que veiem hi són.
Pacient BP, E1: S’ha utilitzat un panell de sondes; pel 21 (sonda per regió Down), 13 (sonda per retinoblastoma), 22 (sonda per regió delecionada amb digeorge), centromèrica per 19, 18, X... De manera que s’ha fet un screening d’aneuploïdies.
Aquesta mostra es d’una pacient amb avortaments per repetició. Això s’ha de fer amb diferents rondes d’hibridació, perquè no tenim suficients colors.
Pacient SQ, E: S’ha utilitzat una sonda subtelomèrica pel cromosoma 14 (braç q) i una sonda per la regió del retinoblastoma del 13. S’observa una trisomia 13.
Pacient ER: S’han utilitzat sondes per al 7 i l’Y. S’observa una translocació recíproca entre Y i el 7.
Coses a tenir en compte: • La mida de la taca de color es representativa de la mida de la sonda: com mes petita sigui, la senyal serà més petita.
•   La FISH es fa sobre cromosomes interfàsics perquè fer extensions de cromosomes metafàsics dona un gran risc de pèrdues de cromosomes.
5   BR- Tema 7 Array CGH (Microarray-based comparative genòmic hybridization) És actualment, la tècnica més utilitzada.
Des que es disposa de tecnologies mes fiables i tècniques més eficients, aquesta tecnologia s’està utilitzant per estudiar aneuploïdies en les biòpsies que analitzem després per DGP.
Si estem fent un array de CGH en un material amb moltes cèl·lules nomes extraiem el DNA i a partir d’aquest fem la hibridació competitiva sobre el microchip.
Però quan estem fent DGP prèviament hem d’amplificar el DNA de la biòpsia.
Optimitzant sistemes d’amplificació gènica (DOP-PCR, PEP-PCR, MDA...) s’amplifica el DNA de la cèl·lula. Un dels kits per fer aquesta amplificació és el BlueGnome.
Un cop tenim el DNA amplificat, ja podem fer l’array, que, en general, és simple. Es posa a hibridar DNA de controls i pacients marcat diferencialment sobre un microarray, on cada pouen conté un clon (sondes) que reconeix un determinat cromosoma. A continuació es valoren els senyals.
El et que cada clon reconegui un cromosoma fa que aquest tipus d’arrays siguin més fàcils de llegir i interpretar. El que s’acaba obtenint és un screening d’aneuploïdies per tots els cromosomes, ja que cada cromosoma està cobert per diferents clons/BACS que reconeixen una regió específica.
En la imatge l’embrió presenta una monosomia del 4, un excés pel 13, manca pel 14 i excés pel 18.
  6   BR- Tema 7 Limitacions: o No permet detectar les alteracions de ploïdia total (triploïdia).
o No permet detectar translocacions/inversions equilibrades o No detecta canvis petits (mutacions puntuals, expansió de trinucleòtids, insercions/delecions intragèniques...) o No detecta variacions que afectin a regions que no estan cobertes per cap clon o És més costós que una FISH - Resolució: 2,5 Mb, (en alguns casos s’ha reportat 1,6 Mb).
o Limitació: Les translocacions/delecions <1,6 Mb no es poden detectar per aquesta tècnica (llavors hauríem de fer FISH).
En la següent imatge es detecta una monosomia de l’11 i el 20. Aquest és un cas en el que es detecta un embrió desequilibrat que prové d’un portador d’una translocació (t(3;18)). (Pensar com ha passat, tenint en compte com és el cromosoma del pare – imatge de sota- i quina segregació s’ha donat).
CARACTERITZACIÓ GÈNICA: Caracteritzarem anomalies en el DNA, es basa en la detecció de mutacions causants de malalties monogèniques.
Al llarg del temps han sortit diferents estratègies, en tot cas cal posar el blastòmer en un eppendorf per extendre’l.
Hi ha diferents estratègies per tal d’amplificar específicament seqüències de DNA:   - Estratègies de diagnòstic o Diagnòstic directe: anar a buscar una mutació específica(com FQ) o Caracterització indirecte: anàlisi de polimorfismes propers a la regió a estudiar i que permetin detectar l’al·lel mutat.
- Estratègies d’amplificació i detecció dels productes d’amplificació: PCR fluorescent, córrer gels de poliacrilamida, miniseqüenciació...
- Diferenciar embrions afectats dels portadors(tenir en compte herència de malaltia) à què es això???? 7   BR- Tema 7 - Preamplificació del DNA total: en alguns casos puc fer una preamplificació de tot el DNA de la cèl·lula biopsada per abordar diagnòstics múltiples. Aquestes tècniques no són perfectes, per això no les fem sempre. El problema que tenen és que no amplifiquen totes les regions, per tant si volem estudiar una mutació no sempre va bé perquè pot ser que el tros que porti la mutació no s’amplifiqui.
Adaptarem el protocol al tipus de malalties - Noves estratègies: tècniques de seqüenciació global del genoma (next generation sequencing).
Limitacions: o Quantitat de DNA de partida per l’anàlisi (si la primera amplificació ja no amplifica el fragment que vull, tenim un problema) o En hem d’assegurar que la cèl·lula tingui nucli o Pel que fa a les tecnologies d’amplificació del DNA hi ha un fenomen anomenat ADO (allele drop –out); quan es fan amplificacions és ocasional que un dels dos al·lels amplifiqui molt més o molt menys que l’altre, de manera que al final trobaré dos al·lels que no amplificaran igual.
Així doncs, pot ser que l’amplificació d’un al·lel sigui tant baixa que no la vegi, això pot donar errors de diagnòstic (si no m’amplifica el mutat puc dir que l’embrió no està afectat...).
§ Aquest fenomen s’ha de tenir en compte i informar a la parella el risc de falsos positius / negatius.
Tot el que es pot fer amb prenatal, encara no es pot fer amb DGP. La diapositiva mostra totes les malalties que es poden abordar per DGP (els protocols ja estan a punt).
Els següents gràfics mostren l’evolució de les tècniques de DGP des de 1997 fins al 2012.
Al principi (fins al 1997), es feien pocs DGP i la majoria eren de FQ. Actualment (2012) hi ha més diagnòstics i, en general, es fan més DGP.
  8   BR- Tema 7 ESTUDIS  GENÈTICS  EN  CORPUSCLES  POLARS   És un tipus de DGP o DGpreconcepcional.
Sabem que les dones, tot i no tenir cap patologia de fertilitat, presenten al voltant d’un 20% d’oòcits cromosòmicament anormals. (nivell basal). A mesura que l’edat va augmentant, això pot arribar al 80%.
Així doncs en una dona d’edat avançada que vol fer TRAS, hem d’estudiar els seus corpuscles polars dels oòcits.
El corpuscle polar és la imatge especular de l’oòcit (és just el contrari) , és a dir, si el corpuscle té una monosomia l’oòcit té una disomia, així doncs podem identificar els oòcits correctes abans de la fecundació.
Però es va veure que estudiar el primer corpuscle era difícil (cromosomes molt condensats, cromatina relativament malmesa...) El que es fa dons és fecundar i analitzar el primer i segon corpuscle polar. El primer seria la imatge especular que l’oòcit, i el segon, seria la confirmació (hauria de ser igual l‘oòcit).
Però a part de la segregació de cromosomes cromàtides, tenim recombinació. De manera que en els anàlisis gènics hem de tenir en compte els fenòmens de recombinació: • si es dona recombinació (a metafase I) , l’oòcit serà heterozigot per la mutació i quan es doni la fecundació i per tant la segona divisió, pot ser que la cromàtide que porta la mutació vagi al oòcit (llavors l’embrió la tindrà) o bé que vagi al segon corpuscle polar (llavors l’embrió no tindrà la mutació).
Degut a les característiques del segon corpuscle, es poden cometre errors de diagnòstics lligats al fenomen de recombinació à font d’error (repassar errors que es poden originar en aquesta meiosi) En aquest estudi: à OBLIGATÒRIAMENT hem d’estudiar els dos corpuscles à si veiem RESULTATS DISCREPANTS, hem d’estudiar el cas més a fons, perquè pot ser que hi hagi recombinació   9   BR- Tema 7   4. RESULTATS  GENERALS:     ESHRE PD Consortium Dara recull dades de molts centres de reproducció assistida.
Aquestes dades són molt variables en funció del tipus de centre).
- De les parelles que van a fer DGP: o 57% infèrtils (la resta volien evitar la transmissió d’una cromosomopatia a la descendència) o Taxa de fecundació: 85% o Cicles cancel·lats (pots FIV/ICSI): 5% (els embrions no estan bé...) o Eficiència biòpsia: 99% (99% dels embrions aguanten el procés de biòpsia) o Eficiència diagnòstic: 94% (un 6% dels embrions no es poden diagnosticar perquè no hi ha amplificació, no hem estès bé, la cèl·lula biopsada no té nucli...) o Embrions transferibles: 25% (25% dels embrions diagnosticats són transferibles) o Cicles amb transferència: 61% (61% dels cicles iniciats poden fer transferència ,un 30% de parelles han arribat fins al DGP però al moment de transferir no se’ls transfereix cap perquè no n’hi ha cap embrió normal) (77% a Catalunya) o Taxa d’embaràs: 29% (47% a Catalunya). És alta segurament perquè moltes de les parelles son fèrtils.
o Delivery rato: 26% tenen un nascut viu (33% a Catalunya).
  10   BR- Tema 7 5. AMPLIANT  CANDIDATS Hi ha un altre bloc de candidats, són els següents: - Individus amb risc per presentar malalties d’aparició tardana - compatibilitat HLA (Benefici per tercers. Ex/ Sang de cordó per fer un transplantament de cèl·lules hematopoiètiques a un germà malalt) - individus que tenen risc de càncer - ...
La llei de DGP és bastant àmplia i permet treballar molt bé, contempla tots aquests candidats nous. Aquesta llei conté un article que tracta del DGP. Aquest article exposa que la DGP es pot utilitzar en moltes alteracions (d’aparició tardana, que l’embrió pugui prosperar, complex de HLA amb un informe obligat...). Per aquest cas de compatibilitat de HLA es requereix un informe, i per patologies noves també.
HLA matching: Es busca aconseguir una gestació per trasplantar la sang de cordó a un tercer (un germà afectat). És a dir, en aquest cas la DGP s’aplicaria per tal de fer teràpia cel·lular.
Ens podem trobar en dos casos: 1. Selecció d’embrions histocompatibles (Ex/ obtenció de precursors hematopoiètics en leucèmies): La probabilitat que l’embrió sigui histocompatible és 1/4 .
La resta d’embrions són normals però no compatibles pel que fa al HLA, aquests es congelen, donen...
També pot donar-se el cas que hi hagi tres embrions i cap compatible.
2. Malaltia hereditària: selecció d’embrions sans + histocompatibles En podem trobar en el cas en que hi hagi una malaltia en la sang, però a més, hi hagi una malaltia familiar, llavors hem de trobar embrions sans pel que fa a la malaltia i a més, histocompatibles.
Aquest és l’exemple de l’anèmia de Fanconi: La probabilitat teòrica de trobar els embrions que ens interessen és: ¾ · ¼ = 3/16 A aquests valors se li ha d’afegir la taxa de FIV (40%) el que fa que les probabilitats siguin molt menors. Per tant, les parelles que arriben en aquests punt han gastat ja totes les altres opcions, estan al límit (ultima opció que tenen).
  11   BR- Tema 7 Fer aquest tipus de DGP és complex i la legislació Espanyola és mes restrictiva: si el nen afectat no està molt malament es pot esperar (a que aparegui un donant en un banc de cordó) i si està molt malament no es fa perquè es suposa que ja no tindrà temps de curarse. Per tant, s’ha de trobar el punt intermedi.
Predisposició a càncer: Ens trobem en embrions en que: - Hi ha un probabilitat elevada o quasi certesa de desenvolupar la malaltia - No són susceptibles als tractaments curatius.
Sanitat autoritza aquest tipus de DGP.
Ara estem anant a la seqüenciació global. Pel que podrem abordar més diagnòstic (no són possibles els “nens a la carta”, actualment és una utopia però cada vegada s’avança més).
  12   ...