TEMA 1. INTRODUCCIÓ A LA GENÈTICA MOLECULAR (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Biologia Molecular d'Eucariotes
Año del apunte 2014
Páginas 9
Fecha de subida 22/10/2014
Descargas 25
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 1: INTRODUCCIÓ A LA GENÈTICA MOLECULAR La biologia molecular és la ciència que estudia els processos que tenen lloc als éssers vius, amb el focus posat en les molècules que hi prenen part. La biologia molecular està molt relacionada amb la genètica molecular, més que no pas amb la de poblacions o la de transmissió. La genètica molecular va sorgir com a tal amb el descobriment de la doble hèlix de DNA.
A partir d’aquest descobriment i del principi de la genètica molecular, també es va començar a desenvolupar la biologia molecular. Fet històrics que han marcat aquest desenvolupament: - - - - 1869: Miescher aïlla per primera vegada el DNA.
1944: Avery demostra que durant la transformació bacteriana és el DNA, i no les proteïnes, el que conté la informació genètica i per tant és el principi transformant.
1953: A partir dels estudis de raigs X efectuats per Franklin i Wilkins, Watson i Crick proposen que l’estructura del DNA s’assembla a una doble espiral.
1957: Kornberg descobreix la DNA-polimerasa.
1958: Meselson i Stahl demostren el DNA es replica semiconservativament.
1961: Marmur i Doty desenvolupen la tècnica d’hibridació del DNA. Ficar el DNA a temperatura molt alta, llavors les cadenes se separen, i quan la temperatura torna a baixar, les cadenes es tornen a ajuntar.
1962: Arber descobreix les nucleases de restricció. Nathans i H. Smith utilitzen aquests enzims per caracteritzar la seqüència del DNA.
1966: Nirenberg, Ochoa i Khorana descobreixen el codi genètic.
1967: Geller descobreix la DNA-ligasa (que uneix fragments de DNA).
1972-73: Boyes, Cohen i Berg desenvolupen les tècniques de clonació del DNA.
1975-77: Sanger i Barrel, i Maxam i Gilbert, desenvolupen mètodes de seqüenciació ràpida del DNA. Els dos mètodes són semblants però no iguals.
1981-82: Palmiter i Brinster desenvolupen ratolins transgènics.
1986: Mullis presenta la tècnica de PCR. Això suposa un avanç envorme en l'estudi de la biologia molecular. Podem amplificar un gen milions de cops i això fa que l'estudi sigui més fàcil.
1995: Seqüenciació del primer genoma complet (H. Influenziae).
1996: Wilmut aconsegueix crear el primer mamífer clònic (DOLLY!).
2000: presentació del primer esborrany de la seqüenciació del genoma humà.
Seqüenciar el genoma humà era un repte molt gran, i com els científics tenien ganes de mostrar el seu gran triomf, no es van poder esperar a tenir-lo completat i van presentar un esborrany (lame).
2003: presentació de al versió definitiva del genoma humà seqüenciat.
2011: publicació de la seqüència del genoma de quatre pacients amb leucèmia limfàtica crònica.
La biologia molecular estudia només la part de la biologia que es troba dins la cèl·lula.
EXPERIMENT DE GRIFFITH AMB STREPTOCOCCUS (1928) Quan es va descobrir el DNA, no se sabia per a què servia, no se sabia que era el portador de la herència. Això va portar molts problemes als científics, que pensaven que la molècula portadora de l’herència havia de ser molt complexa, ja que aquesta és una funció molt important. I la molècula més complexa a nivell estructural és la proteïna. Per això quan es va descobrir el material genètic, no es va pensar que servís per portar l’herència, ja que aquesta funció estava atribuïda a les proteïnes.
Un experiment que va demostrar el principi de transformació (poder passar la informació d’una cèl·lula a una altra) va ser el de Griffith. Aquest va ser clau pels posteriors experiments que van demostrar que el DNA era el portador de l’herència.
Hi ha dues soques d’Streptococcus, una virulenta i una altra que no ho és. La soca virulenta és letal per als ratolins, ja que els bacteris tenen una coberta polisacarídica amb la qual poden evitar el sistema immunològic del ratolí i acabar provocant-li la mort. La soca no virulenta no té aquesta coberta que la protegeix, de manera que els bacteris acaben eliminats pel sistema immunològic del ratolí.
Així, en els experiments observava que quan injectava als ratolins la soca virulenta aquests morien, i quan els injectava la soca no virulenta aquests no morien.
Després, continuant l’experiment, va matar els bacteris amb calor, i va injectar mostres de les dues soques mortes als ratolins. En els dos casos, els ratolins no morien, perquè els bacteris, en estar morts, no es podien reproduir i per tant no podien desenvolupar la infecció. Va provar diferents combinacions d’injeccions: virulents vius amb no virulents morts... Llavors va veure que quan inoculava bacteris virulents morts amb bacteris no virulents vius, el ratolí també moria.
Així va descobrir el principi de transformació: alguna cosa passava dels bacteris morts als vius fent que els que al principi no eren virulents al final ho fossin.
EXPERIMENT D’AVERY, MACLEOD I McCARTY (1944) Van continuar l’experiment de Griffith, que no havia aconseguit determinar què era el que passava d’uns bacteris a uns altres, és a dir, quina era la molècula transformant.
Avery va crear diferents extracte de bacteris Streptococcus virulents, i els va tractar amb diferents elements: un extracte amb proteases (per eliminar les proteïnes dels bacteris), l’altre amb ribonucleasa (elimina l’RNA), i l’altre amb desoxiribonucleasa (elimina el DNA).
Tots aquests tractaments feien que els bacteris acabessin morts, però uns eren diferents dels altres perquè hi havia una molècula que no tenien respecte la resta.
Llavors Avery va posar cada un d’aquests extractes de bacteris virulents morts amb bacteris vius no virulents, per veure si aquests últims adquirien la virulència (tal i com havia observat Griffith en el seu experiment). Per observar-ho, només havia d’injectar cada un dels tres extractes a ratolins i veure si morien o no. Van veure els ratolins morien en dos casos i sobrevivien en un, quan s’injectava l’extracte que no tenia DNA. Això volia dir que el principi transformant era el DNA, perquè sense aquest, els bacteris no virulents no havien pogut obtenir la virulència dels bacteris virulents morts.
Però hi ha via una idea molt arrelada de que la informació de les característiques d’una cèl·lula la portaven les proteïnes, i es van haver de fer més experiments per treure aquesta idea del cap dels científics.
COM FUNCIONA EL PRINCIPI TRANSFORMANT? Un bacteri té un cromosoma circular. Els virulents tenen un al·lel d’un gen que codifica per un enzim que participa en la creació de la coberta polisacarídica. En el cas dels no virulents, l’al·lel d’aquest gen no codifica per aquest enzim, i per això no tenen la coberta.
Quan Griffith matava els bacteris virulents i els inoculava juntament amb els no virulents, hi havia material genètic que passava dels bacteris morts als vius. Els bacteris vius podien incorporar el DNA que hi havia a l’exterior, entre el qual hi havia el gen de l’enzim. Com l’al·lel dels bacteris virulents i dels no virulents eren homòlegs, en la divisió dels bacteris no virulents es podia donar una recombinació, de manera que els bacteris fills incorporessin l’al·lel que codifica per l’enzim. Llavors podien crear la coberta, i havien adquirit la virulència. La diferència entre els dos al·lels és només d’una o dues bases, i és per això que poden recombinar.
Després de l’experiment d’Avery, es van continuar fent d’altres per demostrar que el DNA era el principi transformador que portava la informació i la herència: EXPERIMENT DE HERSHEY I CHASE (1952) Per acabar de demostrar que era el DNA, i no les proteïnes, la molècula portadora de l’herència, es va fer un experiment amb bacteriòfags, que bàsicament estan formats de DNA i una càpsida proteica, és a dir, les dues molècules de la discòrdia.
Quan un bacteriòfag infecta una cèl·lula, la càpsida proteica es queda fora i només s’injecta dins la cèl·lula el material genètic del virus. El DNA és transcrit a RNA per la maquinària de la cèl·lula infectada i després aquest RNA traduït a proteïnes. Aquestes proteïnes, juntament amb DNA viral replicat dins la cèl·lula formaran nous virus, que sortiran de la cèl·lula matant-la. (Cicle d’infecció dels virus molt resumit i pocs detalls).
En aquest experiment, van marcar radioactivament tant les proteïnes de la càpsida com el DNA viral. Així es va poder observar com el DNA viral entrava dins la cèl·lula, i que els nous virus que sortien de la cèl·lula infectada portaven encara una part d’aquest DNA (gràcies a la replicació semi-conservativa del DNA). En comptes, la part proteica del virus es quedava fora i no entrava dins la cèl·lula infectada, i a més, cap dels nous virus que després sortien de la cèl·lula portaven proteïnes marcades.
Per tant, la molècula portadora de l’herència era el DNA, que és la que entra dins la cèl·lula i fa que els nous virus formats siguin iguals que els seus “progenitors”.
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA Aquest dogma diu que hi ha una ruta unidireccional del nucli al citoplasma. Transcripció del DNA a RNA, processament del mRNA primari al mRNA madur, sortida d’aquest del nucli, i finalment traducció a un polipèptid.
Això va ser acceptat durant un cert temps, però s’ha vist que la transcripció no sempre és unidireccional, i el material no sempre és el DNA. Ex: virus de RNA.
Així doncs, el dogma central s’ha modificat i ha quedat així: El canvi del pas de la transcripció es va incloure quan es va descobrir l’enzim transcriptasa inversa. De la mateixa manera, també es va descobrir que l’RNA també es pot replicar, de la mateixa manera que ho fa el DNA.
El que no s’ha descobert, és que pugui tornar enrere el pas de RNA proteïna (sembla poc probable a causa de que el codi genètic és degenerat). Sí que s’han descobert, però, els prions, que són proteïnes que tenen un comportament estrany, són infeccioses. Tenen una estructura modificada, i en contacte amb altre proteïnes que tenen l’estructura correcte, fan que aquestes canviïn també a una estructura estranya. Les proteïnes amb una estructura que no és la que haurien de tenir acaben formant agregats de proteïnes, que poden causar malalties degeneratives molt greus.
El transcriptoma no són només els gens transcrits a RNA que codifiquen per proteïnes, sinó que també en formen part totes les molècules de RNA que té una cèl·lula.
Al nucli hi ha una gran quantitat de RNA no-codificant (no codifica per res), és un 96% del total (en direm RNA funcional). L’altre 4%, per tant, correspon al RNA codificant.
L’RNA codificant primer el trobem com a pre-RNAm (missatger), o també anomenat RNA Nuclear Heterogeni (hnRNA). Aquest és un RNA que encara no és madur, ha de patir modificacions i s’han d’eliminar algunes parts de la seqüència de nucleòtids (ex: introns).
Després d’aquests modificacions, el RNAm ja és madur, i es pot traduir per donar lloc a proteïnes.
En el cas dels RNAt (de transferència) i RNAr (ribosòmic), formen part del RNA funcional, però tal i com passa amb el RNAm, han de patir modificacions abans de ser madurs.
snRNA (s de small): són RNAs petits i curts. Són nuclears, i s’organitzen per formar ribonucleoproteïnes. Aquestes, per exemple, participen en l’eliminació dels introns.
snoRNA (s també de small): és RNA nucleolar (del nuclèol). També són RNAs curts i petits, i participen en la maduració del pre-RNAt i del pre-RNAr.
miRNA: també són RNAs curts. Regulen l’expressió d’alguns gens. Provenen d’un gen miRNA(A), que quan es transcriu dóna lloc al miRNA. Hi ha un altre gen, que anomenarem gen(A) que quan es transcriu dóna lloc al RNAma (missatgerA). El miRNA és complementari amb una part del RNAma (el miRNA és molt més petit), de manera que s’hi uneix i es forma un RNA de doble cadena. Aquest RNA llavors no es pot traduir, i va a degradar-se. D’aquesta manera el gen(A) queda regulat, i no s’expressa. (Aquesta és només una de les moltes formes de regulació gènica).
siRNA: són RNA petits d’interferència, molt semblants al miRNA. Però aquests no estan codificats pel propi genoma, sinó que provenen de genomes vírics que s’han integrat, d’elements transponibles... el factor en comú és que venen de fora. Molts d’aquests siRNA serveixen per lluitar contra l’agent extern que l’ha portat. Per exemple, si un d’aquests siRNA prové d’un virus, si aquest torna a infectar la cèl·lula, el siRNA pot unir-s’hi per complementarietat i llavors no deixar que es propagui.
Els gens eucariotes normalment tenen bastants introns. Els introns són seqüències no codificants que s’eliminen amb un procés anomenat splicing. Hi ha gens que es transcriuen i després es tradueixen.
Altres, es transcriuen i l’RNA s’elimina abans de que es pugui traduir. Els gens tenen regions reguladores (upstream i downstream), que són les que permeten que el gen es transcrigui. Les regions codificants dels gens (exons) són les que queden al RNA després de que aquest es modifiqui.
Els gens es troben al DNA, que es disposa en una estructura superenrotllada, associat a histones.
Aquest gen s’ha de transcriure, i després el seu RNA és processat, va al ribosoma, i allà es crea una proteïna nativa (així s’anomena a les seqüències polipeptídiques just després de la traducció). La proteïna nativa no és funcional, s’ha de processar i plegar, fins a agafar l’estructura necessària per a què sigui una proteïna funcional.
ORGANISMES MODEL DE AL GENÈTICA Aquests organismes han de reunir unes certes característiques per ser “organismes models”: - Són fàcils de mantenir al laboratori (poc menjar, ocupen poc...).
Tenen un elevat nombre de descendència (això permet tenir mostres més grans per estudiar).
Tenen un genoma petit, perquè és més fàcil d’estudiar.
Tenen un període de vida petit, és a dir, que hi hagi diverses generacions per any.
Manipulació sigui fàcil.
En aquest esquema podem observar una part del genoma de diferents espècies models de al genètica.
El color vermell correspon als gens (els introns estan d’un color vermell més fluix), i el color blau a seqüències repetitives (molts són elements transponibles.
Veiem que en els genomes més petits (com els llevats) quasi tot són gens, i tenen molt poques seqüències repetitives.
En comptes, en el blat, ja hi ha un 75% d’elements transponibles, i en els humans el percentatge és més gran.
La conclusió que podem treure de tot això és que els genomes són molt diversos, i canvien molt entre una espècie i una altra.
...