TERÀPIA GÈNICA. VECTORS VÍRICS I APLICACIONS (2014)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 01/11/2014
Descargas 3
Subido por

Descripción

TERÀPIA GÈNICA. VECTORS VÍRICS I APLICACIONS

Vista previa del texto

Seminari 6. TERÀPIA GÈNICA. VECTORS VÍRICS I APLICACIONS La teràpia gènica és una metodologia experimental dissenyada per transferir gens per tractar una patologia. Consisteix en insertar nous gens en les cèl·lules d’un pacient per recuperar el fenotip “normal”. Els seus objectius són: - Substituir la còpia mutada d’un gen que causa una patologia per una còpia “sana” del mateix gen.
Inactivar (knock out) un gen mutat, per silenciar una funció incorrecta.
Introduir un nou gen en l’organisme a tractar per ajudar a combatre una malaltia.
Podem distinguis: - - Nivell somàtic: s’ingereix un gen a les cèl·lules del cos. La modificació queda restringida a un pacient individual. Es considera ètic i segur. Es poden retirar les cèl·lules mare dels pacients i corregir-ne el defecte genètic.
Teràpia germinal: s’ingereix un gen a cèl·lules de la línia germinal. La modificació perdurarà en les següents generacions, per això no es considera ni segur ni ètic.
Vectors per transferir DNA bastats en virus, mètodes no vírics, mètodes híbrids - - - La inserció directa d’un gen en una cèl·lula, en general, no produeix cap efecte terapèutic.
Alguns virus (modificats) sovint són usats com vectors de teràpia.
S’injecta el vector directament en un teixit del pacient.
Alternativament, s’agafa una mostra de cèl·lules del pacient, aquestes es modifiquen in vitro i es reintrodueixen.
El gen transferit pel vector dictarà la síntesi d’una proteïna funcional.
Si féssim servir directament DNA, entraria en les cèl·lules amb poca eficiència i es perdria, per aquesta raó necessitem els vectors (n’hi ha que sí que entra, per exemple, en els músculs). La teràpia gènica avança molt lentament, perquè si no hi tenim molt clar es pot “pifiar” molt.
Principals Vírics característiques Avantatges dels vectors vírics: dels Vectors - Presenten especificitat cel·lular i són eficaços a l’hora de transferir gens.
Alguns són molt específics per infectar determinats tipus de cèl·lules.
Són susceptibles d’ésser modificats genèticament per tal que no puguin replicar-se i destruir cèl·lules de l’hoste.
La càpside s’uneix a la membrana i nosaltres aprofitem la seva maquinària eficient per introduir-hi gens a la cèl·lula.
Limitacions dels vectors vírics: - La quantitat de material genètic que poden portar és limitat. Per tant, alguns gens són massa grans per ésser transferits per viurs.
Poden causar respostes immunes en l’hoste i problemes potencials com els següents: o Fer emmalaltir el pacient.
o El sistema immunitari bloqueja el virus i no pot transferir el gen terapèutic o, mata a la cèl·lula hoste un cop ha rebut el gen terapèutic.
Hi ha dues vies d’entrada: ex vivo i in vivo.
Teràpia ex vivo Es tracta de fer una extracció del moll de l’ós del pacient, s’haurà preparat un virus que no es pot reproduir i se li introdueix el gen (dins del vector víric) i es fa una infecció fora del cos (a part per poder observar-ne l’evolució posem un gen marcador) aleshores es cultiva. D’aquesta manera podem controlar si s’infecten les cèl·lules, si aquestes es divideixen, és a dir, l’expansió d’aquest gen.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
S’agafen cèl·lules del pacient.
Al laboratori, s’alternen els virus per tal de que no pugin reproduir-se.
S’ingereix un gen dins del virus.
Es barregen els virus alterats amb les cèl·lules del pacient.
Les cèl·lules són genèticament alterades.
Les cèl·lules alterades són injectades al cos del pacient.
Les cèl·lules alterades produeixen la proteïna desitjada.
In vivo en canvi, el gen terapèutic s’injecta directament a les cèl·lules del pacient. S’han d’afegir unes marques (vectors) per tal de que aquestes vagin al teixit que ens interessa.
Aquest procediment es fa servir, ja que no sempre podem treure les cèl·lules del pacient, per exemple, les cèl·lules de les neurones.
Vectors actualment emprats en teràpia gènica Virus Adeno-associats (AAVs) ssDNA, el diàmetre del virió té entre 18 i 26 nm, la mida del genoma és de 5kb. Infecten cèl·lules que es divideixen i que no es divideixen. Per obtenir una infecció productiva cal un virió ajudador. Uns pocs AAVs s’integren en el genoma de l’hoste, la major part es mantenen com episomes (plasmids). Potencialment, l’expressió és de llarga durada. La capacitat d’empaquetament és de 4’5kb.
Retrovirus / Lentivirus ssRNA (+), el diàmetre del virió és entre 80 i 130 nm, la mida del genoma és de 3-9kb.
Infecten cèl·lules que es divideixen i que no es divideixen (lentivirus). S’integra en el genoma de l’hoste. L’expressió és de llarga durada. La capacitat d’empaquetament és de 8kb.
Els retroviurs és el cas en que s’integra un gen terapèutic dins del genoma, poden fer mal si s’integren en algun lloc on no ens interessa. Si un virus no s’integra, doncs el gen terapèutic es perd.
Ψ: Senyal d’empaquetament, proteïnes no s’empaqueten.
sinó les LTR: extrems Hem d’afegir a la cèl·lula empaquetadora tres formes: - DNA amb LTRs, ψ i el gen terapèutic (gag, pol i env).
- DNA sense LTRs ni ψ i només amb gag i pol: que ens donaran solament les proteïnes.
- DNA sense LTRs ni ψ i només amb env: que podem triar, d’aquesta manera les proteïnes que aconseguim seran específiques per el teixit diana que decidim.
Quan una cèl·lula està fent una producció retrovírica, la cèl·lula no lisa per realitzar la infecció (que és el que passa amb altres cèl·lules d’altres virus), sinó que la cèl·lula és una màquina que prepara retrovirus a baix rendiment sense matar.
Per què els lentivirus (vs altres tipus de vectors vírics)? Poden transduir cèl·lules que no es divideixen: generalment transdueixen cèl·lules que són difícils de transfectar, l’eficàcia de la transducció arriba al 100%.
Control de la transferència: transferència directa d’una única còpia, fàcil de fer un seguiment del nombre de còpies que es transfereixen, el procés de transferència és fàcilment reproduïble.
Alt nivell d’expressió: els lentivirus tendeixen a integrar-se en localitzacions favorables per a la transcripció, s’integren en absència d’un marcador de selecció.
EXEMPLES: Teràpia gènica amb lentivirus (derivats VIH) 6 de Novembre de 2009 Teràpia gènica de cèl·lules mare hematopoètiques amb un vector lentiviral a Adrenoleucodistrofia1 lligada al cromosoma X: retrovirus.
Aquesta és una malaltia greu que es tracta amb teràpia gènica amb nens. Afecta sobretot a nens barons, no comença a afectar fins als 4 anys, és aleshores quan se’ls hi va desmielitzant el cervell, queden vegetatius i moren. És una malaltia hereditària en el gen ABCD1 que codifica una proteïna anomenada ADLp. Aquesta proteïna normalment es troba en la membrana del peroxisoma (que transporta àcids grassos i allà es degraden), però quan no porten el gen ABCD1 no es codifica la proteïna ADLp i aleshores els àcids grassos s’acumulen i moren.
Per tractar aquesta malaltia es realitza un transplantament al·logènic (de medul·la òssia) d’un donant compatible. Aleshores s’atura la malaltia.
Però pels nens que no troben donant, es fa una teràpia gènica agafant les seves pròpies cèl·lules del seu moll de l’ós, on hi ha cèl·lules mare hematopoètiques. Es fa una combinació de teràpia gènica i cel·lular (cèl·lules mares i lentivirus): transplantament de cèl·lules autòlogues, és a dir, d’un mateix pacient. Aleshores s’introdueix en les cèl·lules un vector que té el gen terapèutic, es fan créixer i quan tenim una quantitat suficient, es tornen a introduir al nen.
Aquestes proves si no es fan aviat, la intervenció és contraproduent.
Comparació dels cervells dels dos pacients després del tractament de teràpia gènica (A i B) respecte a un pacient no tractat (C). S’observa que la teràpia ha funcionat, tot i que en els primers 12 mesos no veiem que s’hagi aturat, més endavant s’observa que no empitjora.
Riscos associats a la teràpia gènica - 1 Efectes indesitjables en la salut (per exemple càncer, mort...) Si el gen s’inserta en una localització incorrecta pot afectar la funció d’alguns gens endògens que són vitals per a l’organisme.
Adenoleucodistròfia: malaltia autosòmica lligada al cromosoma X amb mutacions al gen ABCD1. És una desmilienització degut a problemes en la destrucció per β-oxidació de lípids de cadena molt llarga als peroxisomes i acúmul de lípids als peroxisomes.
- Els vectors vírics poden infectar teixits i cèl·lules sanes.
Es poden donar casos de reversió a la forma vírica silvestre.
Reaccions immunitàries que produeix el virus i que generen inflamació, toxicitat i diferents formes de letalitat.
És freqüent que els tractaments s’hagin de repetir periòdicament i això afavoreix aquetes reaccions immunitàries adverses.
Nens bombolla: SCID (immunodeficiència severa combinada) Hi ha molt tipus de SCID, el SCID XI, és causat per mutacions en el gen IL2R6 (cadena γ del receptor de interleuquina 2) Els nens que no tenen la cadena gamma d’aquest receptor (en cadena X) aleshores tenen unes cèl·lules B que no funcionen bé i per tant no tenen cèl·lules T. Això es tant greu que si no se’ls posen en una bombolla, aleshores moren per la mínima infecció.
L’article és d’un nen que va ser salvat fa menys d’un mes: utilitzant un vector basat en retrovirus modificat. Actualment es fa servir un virus menys potent d’infectar, però fa uns 14 anys s’utilitzava un virus massa potent, i per tant, de 20 pacients tractats, 5 es van morir perquè van adquirir una leucèmia de cèl·lules T. Per culpa de la teràpia, va esdevenir el càncer.
Aquests virus menys potents que estan utilitzant actualment són modificats ja que els hi ha tret l’enhancer2 (o amplificador genètic) que es troba en l’extrem LTR.
2 Amplificador genètic: és una curta regió d’ADN eucariota que pot unir-se a factors de transcripció per augmentar la velocitat de transcripció gènica. No s’han de trobar a prop del promotor.
...