PROCARIOTES - 1 - El cromosoma bacterià (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 7
Fecha de subida 01/11/2014
Descargas 24
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 1 – El cromosoma bacteria CARACTERÍSTIQUES - - - 08/09/14 La mida del cromosoma depèn del microorganisme. Els mesurem amb pb. El cromosoma bacterià és petit comparat amb el d’un eucariota. Aquest oscil·la entre 0,5 Mb i 10 Mb. Hi ha un ventall de mides molt gran, tot i que la majoria estan situats entre les 3 i les 5 Mb (ex: E. coli).
És circular i de doble cadena – és un DNA covalentment tancat i circular (cccDNA) i double stranded o bicatenari (dsDNA). Això vol dir que no té ni inici ni final. PERÒ hi ha microorganismes amb cromosomes lineals. Per exemple, Borrelia burgdorferi, que produeix la malaltia de Lime. Altres exemples són Streptomyces coelicolor o Agrobacterium tumefaciens. Fins i tot s’ha construït un bacteri E. coli amb DNA lineal, i funciona igual que un amb DNA circular, la qual cosa prova que no és necessari que el DNA sigui circular, sempre que hi hagi la maquinària de replicació necessària.
Els cromosomes cccDNA són altament estables, més que els lineals, ja que els extrems lliures dels dsDNA lineals són sensibles a les nucleases intracel·lulars. És molt difícil incidir nou DNA o trencar el DNA del cromosoma en els circulars, a no ser que hi hagi un forat específic. Aquests són punts de separació de DNA anomenats nicks (poden tenir altres noms) on poden actuar enzims per degradar el DNA (nucleases intracel·lulars). El DNA lineal, per evitar la degradació per part d’aquests enzims, té uns sistemes de protecció (els extrems 5’ són els extrems més sensibles) que estabilitzen el DNA: o 1)Hairpin telomere – un enzim reconeix els dos primers nucleòtids i genera un enllaç covalent entre l’enllaç 5’ i el 3’ de la cadena inferior, aconseguint dos extrems covalentment tancats; per exemple, Borrelia. La configuració de l’extrem canvia una mica perquè les bases complementàries no estan unides per ponts d’hidrogen, ja que l’estructura del nucleòtid és diferent de la normal.
o 2)Invertron telomere – proteïnes associades covalentment unides a l’extrem 5’, és una superbola que bloqueja l’entrada d’exonucleases; per exemple, Streptomyces.
- - - - - - Hi ha un únic origen de replicació com passa en la majoria de cromosomes d’eucariotes. Aquest origen en els microorganismes rep el nom de OriC.
Els microorganismes tenen majoritàriament un cromosoma únic, però no sempre.
Alguns tenen 2, 3 i fins i tot més cromosomes. Un mateix microorganisme pot tenir uns cromosomes lineals i altres circulars.
10/09/14 El genoma bacterià comprèn els cromosomes i altre material extracromosòmic com ara bacteriòfags, plasmidis (formen part del genoma, no del cromosoma). Aquest material també aporta informació genètica.
Els diversos fragments de material extracromosòmic poden ser indispensables. Per exemple, el genoma de Borrelia burgdoferi té 23 elements extracromosòmics i tots són indispensables (imatge  ).
També hi ha megaplàsmids – són plasmidis (cccDNA, sdDNA, molt grans) d’aproximadament un mega o més. Diferència entre un cromosoma i un megaplasmidi? Depèn de l’essencialitat de cada molècula de DNA que trobem. Si considerem que el contingut és essencial per la cèl·lula i sense ell la cèl·lula no és viable, es tracta d’un cromosoma. Si li dóna característiques però la cèl·lula pot viure sense ell, llavors és un plasmidi o megaplasmidi. Què considerem essencial per la cèl·lula? Depèn. La catalogació pot ser subjectiva (proteïna d’inici de replicació, proteïna de degradació de la lactosa – depèn del medi en què es trobi).
Els procariotes no tenen nucli però alguns tenen alguna cosa semblant a membranes nuclears que embolcallen el material genètic (pseudonucli).
El cromosoma bacterià està altament compactat – està compactat unes 1000 vegades respecte la seva mida lineal. Ocupa un lloc específic al citoplasma i es mou amb una direcció específica. Quadrat en la imatge (DNA sense compactar) = mida de la cèl·lula.
No tenim nucli, sinó nucleoide. Està organitzat i compactat de forma organitzada en dominis, i l‘OriC interacciona amb les parets de la cèl·lula.
- Aquest nucleoide és molt compacte – a la zona interna hi ha el DNA associat a proteïnes i no hi cap res més, i per tant no es dóna ni transcripció ni traducció.
- Els llocs accessibles pels enzims són aquells que es troben en el límit del nucleoide – la transcripció i la traducció es donen fora dels dominis. A dins el nucleoide ni arriba la RNA polimerasa ni hi ha ribosomes – estan justament als llocs del citoplasma on no hi ha DNA. Per tant, l’orientació i localització de cada gen dins el genoma és important per l’expressió gènica. La ubicació del DNA en el nucleoide pot determinar el grau d’expressió. És a dir, si només es dóna transcripció a la perifèria, quan al bacteri li interessi expressar algun gen, el reubicarà a la zona que interessi perquè arribi a on hi hagi ribosomes i polimerases – hi ha d’haver algú que moduli això.
ARQUITECTURA DEL DNA BACTERIÀ Com s’aconsegueix l’empaquetament del DNA i la seva fluïdesa? Cal que hi hagi un equilibri entre la compactació i l’activitat de la cèl·lula (replicació/transcripció). Com més activitat, més expressió de gens hi ha d’haver, i per tant menys compactació SISTEMES QUE INTERVENEN SOBREENROTLLAMENT NEGATIU De forma natural, moure una part de la cadena de DNA acaba generant sobreenrotllament i torsions.
Hi ha uns enzims, les topoisomerases, que generen i modulen el sobreenrotllament – són capaces de fer un moviment per tal de compactar el DNA. Poden fer el sobreenrotllament positiu o negatiu, per tensar (-) o destensar (+) el DNA. És important destensar-lo en la replicació.
Per això, produeixen talls en les cadenes DNA – modulen la tensió afegint o traient sobreenrotllament negatiu tallant el DNA Tenim dos tipus de topoisomerases: - TIPUS I – Tallen una cadena, desenrotllen un loop per tall.
TIPUS II – Tallen dues cadenes, desenrotllen dos loops per tall. Aquest tipus relaxa el sobreenrotllament positiu generat per la forquilla de replicació – genera superenrotllament negatiu.
A l’hora d’ubicar els gens al genoma, ho fem amb unitats per no haver de dependre de la mida de cada cromosoma. A E.Coli parlem en minuts pel temps que tarda en transferir-se el DNA. L’OriC està a 83,5 min.
ACCIÓ DE LES NAPs (PROTEÏNES ASSOCIADES ALS NUCLEÒTIDS) 15/09/14 Abans conegudes com a proteïnes histone-like, són proteïnes que embolcallen, connecten i/o flexionen el DNA per canviar l’estructura dels nucleòtids. L’efecte de les histona-like a la conformació d’un plasmidi superenrotllat pot ser com en la imatge: - - A) Es flexiona i es provoca una ramificació de substrats d'DNA circular superenrotllat.
B) En elevades concentracions, H-NS s’acobla en pegats d’oligòmers que interaccionen entre ells, de manera que converteixen plasmidis superenrotllats en estructures en forma de peses (manuelles).
C) En elevades concentracions, HU s’acobla en filaments rígids de nucleoproteïnes que obren el DNA superenrotllat i el converteixen en una conformació d’anell.
El DNA bacterià és igual que l’eucariota (collar de perles). Però enlloc de tenir el nucleosoma, tindrem el nucleosoma-like, que té la mateixa estructura (loops) però amb diferents proteïnes.
Moltes de les NAPs que interaccionen amb el DNA (histones-like) són proteïnes equivalents a les d’eucariotes – s’uneixen en forma de dímer i formen forquilles. Aquestes proteïnes fan girar el DNA generant els loops que formen els nucleosomes.
Les proteïnes equivalents a les histones dels eucariotes (histone-like) s’uneixen en dímers al DNA. Dos dímers, és a dir, un tetràmer d’aquestes proteïnes formen un nucleosoma-like, que queda envoltat per 39 pb.
Un exemple de les proteïnes que s'han trobat en bacteris amb característiques molt semblants a les histones dels organismes eucariotes, és la HU, que és un dímer de subunitats diferents i semblant a la histona H2B.
Algunes proteïnes NAPs fixen els loops del DNA sobreenrotllat, generant dominis dins el cromosoma bacterià. L’associació d’aquestes proteïnes estructurals permet que l’acció de les topoisomerases es pugui localitzar en un sol loop o domini sense que els altres es moguin (potser interessa que una zona sigui molt més activa que una altra).
Hi ha moltíssimes NAPs: algunes generen torsió, altres recobreixen el DNA, altres el compacten, altres hi fan nusos... Per exemple, les proteïnes DPS – són part d'un sistema de defensa bacterià complex que protegeix contra el dany oxidatiu de l'ADN i es distribueix àmpliament en el regne bacterià – tenen un efecte compactador.
Es desconeix quina és la proteïna clau que s’encarrega de l’empaquetament màxim del DNA. En els eucariotes, són les histones (sense histones, l’organisme no existeix). En els bacteris, cap de les proteïnes associades NAPs (IHF, HU, FIS, DPS) al nucleoide és essencial – segueix sent viable i el DNA no s’estressa si li mutes una proteïna.
Això és cert almenys en E. coli i en B subtilis (bacteris tipus, un gram - i un gram +, els microorganismes model). El motiu més probable és el fet que encara no les coneixem totes i per tant tenim molta redundància en els sistemes d’empaquetament.
MOLECULAR CROWDING – Amuntegament/hacinamiento molecular La densitat proteica en el citoplasma és molt alta i no és homogènia (gran quantitat de macromolècules en l’interior cel·lular), es va acumulant en determinades zones. El nucleoide està on la resta de molècules que conformen el citoplasma li deixen estar. És a dir, en tenir tanta proteïna suelta, pues tinc aquest espai, pues me quedo aquí. Si les proteïnes es mouen una mica, el nucleoide també es pot moure. Si no, la quantitat de solvent accessible en aquestes zones és molt baixa – amb poc solvent, la possibilitat que una proteïna enganxada al DNA se’n vagi, és poca – constant d’afinitat molt més alta in vivo que in vitro.
La gran quantitat de macromolècules en l’interior de la cèl·lula i en aquest cas l’elevada densitat del nucleoide redueix el volum de solvent accessible a altres macromolècules. Això dóna lloc a una major compactació i al increment de l’estabilitat de les NAPs associades al DNA.
Igualment també afavoreix que els processos de transcripció i transducció tinguin lloc en el llindar del nucleoide – just en aquestes zones el solvent és més accessible a les proteïnes enganxades al DNA, i això permetria que el DNA sigui més lax.
Actualment, hi ha la hipòtesi que és aquest efecte el que té un paper més important en la compactació del DNA en el nucleoide.
QUIN ÉS EL PAPER DE LES NAPs? Com no hi ha prou solvent, les NAPs no tenen més remei que unir-se al DNA i aquest es compacta. Les proteïnes tenen una constant d’afinitat amb el DNA, i una altra amb el solvent.
Per tant, segons la situació, pot ser que s’uneixin al DNA o no. Dins una cèl·lula, la quantitat de solvent és poca, i llavors la constant d’afinitat amb el DNA és molt més gran in vivo que in vitro.
Per tant, les NAPs s’uneixen amb el DNA i aquest es compacta.
A les vores del nucleoide és on hi ha més solvent, i per això les NAPs es poden desenganxar del DNA i deixar que altres proteïnes hi puguin interaccionar, per que es puguin dur a terme la transcripció i la traducció.
Les NAPs: - Ajuden al funcionament de la cèl·lula.
Ajuden a ubicar el DNA dins la cèl·lula.
Regulen l’expressió gènica – permeten moure el DNA cap a la zona que interessa.
Si hi ha proteïnes que torsionen el DNA i formen ponts, aquesta estructura pot facilitar o entorpir l’entrada d’altres proteïnes (amb qualsevol funció: RNA polimerases, repressors, activadors...) associades al DNA. Això fa que els gens es puguin expressar més o menys – hi ha regions d’interacció perquè la cèl·lula expressi determinades zones.
En funció de la fase en la que es troba un cultiu bacterià dins la corba de creixement, la concentració de les NAPs canvia dins la cèl·lula – en funció del moment, les proteïnes interaccionen d’una forma o d’una altra i això canvia l’accessibilitat d’altres proteïnes.
El genòfor compactat (cromosoma bacterià) es mou pel citoesquelet controlant la situació del nucleoide i permetent que la divisió es faci correctament. Hi ha una direccionalitat – no se situa a l’atzar, el DNA també es mou sobre el citoesquelet i s’hi ubica.
L’OriC i el punt terminal d’un cromosoma no se situen aleatòriament dins la cèl·lula, sinó que aquesta posició va variant durant el cicle cel·lular.
Això està regulat per proteïnes.
Com ho sabem? Si el gen de les proteïnes MUK (un tipus de NAPs) es muta, això varia: el cromosoma no es pot separar bé perquè l’OriC i el punt terminal no s’ubiquen bé, i llavors les cèl·lules descendents no poden sobreviure – acabem tenint cèl·lules sense cromosoma a causa d’una mala segregació.
Imatge sobre l’organització del genòfor en bacteris: Segments consecutius d'ADN cromosòmic es pleguen en dominis superenrotllats que s'apilen un sobre l'altre i disposats en una superestructura circular. En conseqüència, la posició subcel·lular d'un locus es correlaciona directament amb la seva ubicació al mapa cromosòmic circular. En b, l'origen de replicació es localitza en el pol flagel·lat de la cèl·lula filla, mentre que la regió terminal es troba en el pol oposat. Per tant, els braços esquerra i dret del cromosoma estan orientats en paral·lel a l'eix longitudinal de la cèl·lula. En E. coli, per contra, Ori i ter estan ubicats a la meitat de la cèl·lula, de manera que els dos braços del cromosoma flanquegen l'eix transversal cel·lular.
...