Tema 6 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Química i Enginyeria de proteïnes
Año del apunte 2014
Páginas 28
Fecha de subida 14/10/2014
Descargas 30
Subido por

Vista previa del texto

Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 PROCESSOS I MODIFICACIONS POST-TRADUCCIONALS Les proteïnes sovint tenen modificacions post-traduccionals que s’elaboren generalment e el reticle endoplasmàtic i de caràcter petit però que tenen una gran importància (poden arribar a generar malalties). Un exemple d’una malaltia és la proteïna FUS, que quan té una fenilalanina fosforilada elabora una repulsió electrostàtica que és suficient perquè la proteïna no funcioni correctament (es generen agregats), de manera que el pacient presentarà els símptomes (tot i que tinguin una mutació genètica greu, si no es dona la fosforilació el pacient no presenta cap problema).
FUNCIÓ DE LES MODIFICACIONS POST-TRADUCCIONALS Les modificacions post-traduccionals serveixen per:  Enviar la proteïna al orgànul que correspongui (sinó es quedarien totes al citosol)  Modificar l’activitat (activen o inactiven la proteïna de forma reversible o irreversible)  Controlar la vida mitjana (si una proteïna és marcada amb ubiquitina serà degradada) MODIFICACIONS POST-TRADUCCIONALS Les modificacions post-traduccionals es poden donar en:  N-terminal: és una reacció freqüent perquè és un extrem molt reactiu  Eliminació de seqüències senyals  Modificacions d’aminoàcids individuals (perquè es puguin modificar cal que estiguin exposats a solvent)  Modificacions a través de lípids (és molt important i complicada, molts oncògens depenen de si tenen un lípid encarat o no que els permeti la unió a la membrana)  Addició de grups prostètics (un exemple és l’hemoglobina)  Modificació proteolítica (es genera un tall)  Ponts disulfurs  Glicosilacions  Ribocilacions Una modificació sempre suposa un canvi i un consum energètic per la cèl·lula, és a dir, hem de pensar que tot allò que tingui un consum d’ATP s’elabora perquè no és evitable, si elaborem una modificació és perquè realment és molt important.
1 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 MODIFICACIÓ D’AMINOÀCIDS INDIVIDUALS Fosforilació La fosforilació és una modificació post-traduccional reversible, aquesta es provoca per quinases i s’apaga (desfosforilació) per fosfatases) i sempre es dona en residus amb hidroxil (serina, tirosina o treonina).
Addició de grup carboxil El carboxiglutamat és un exemple d’addició d’un grup carboxil a un aminoàcid en el qual ja hi ha un grup d’aquest, de manera que ens queda un γ-carboxiglutamant i això ens dona un bidentat amb càrrega negativa que permet unir calci. Sense aquesta modificació si ens fem un tall ens desganem ja que és indispensable per la cascada de coagulació.
Metilacions L’addició d’un grup metil a l’aminoàcid canvia el seu caràcter ja que tenen un grup polar de més que provoca un canvi conformacional bestia.
Modificació post-traduccional del col·lagen A mesura que ens fem grans el col·lagen té més enllaços covalents i per tant, és més rígid. Aquests enllaços covalents són entre aminoàcids que normalment no formen un enllaç de manera que això requereix que enzims específics catalitzin la reacció.
Generalment sempre partiríem de dues lisines, una lisina oxidada forma un enllaç covalent amb una histidina per formar una estructura covalent molt forta. Aquesta regió té diferent que el pont disulfur normal només pot connectar a distàncies curtes mentre que aquest enllaç pot connectar a distàncies més llargues, el que ens permet connectar el col·lagen amb d’altres estructures sense necessitat d’una estructura secundària, ens permet muntar el col·lagen a distància.
2 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Una altra característica que elabora és que canvia el estat redox de la molècula i això és bo perquè ens dona una consistència i permanència a l’espai però és dolent perquè a mesura que acumulo molts enllaços el col·lagen és més rígid i es trenca amb més facilitat (els disulfurs si tinc pocs els puc reduir).
Addició de grups lipídics Aquest és un camp molt estudiat ja que els lípids són molècules complicades però molt importants. Un exemple d’aquest és la proteïna Ras, que no es modifica si no té una funció definida ja que es dona per un procés enzimàtic complicat. Ras és un oncogen i té una cisteïna exposada a solvent (grup –SH) i per tant, si aquesta està exposada és perquè ha de tenir una funció (mai no la trobem a la superfície naturalment): serveix per formar un enllaç tioéster per formar un enllaç farnesil pirofosfat, aquesta cadena és un lípid i serveix d’ancoratge a la membrana. La capacitat transformadora oncogènica de Ras només es dona quan està ancorat a la membrana, és a dir, Ras al citosol no té funcionament.
Aquesta modificació post-traduccional és una diana terapèutica: si inhibim la formació d’aquest complex Ras no anirà a la membrana sió que es quedarà al citosol i la seva capacitat transformadora disminuirà dràsticament.
3 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Addició de glicofosfatidilinositol (ancoratge a membranes) Aquest lípid ens permet unir proteïnes a una membrana però de manera que la proteïna quedi a la cara externa. Aquesta unió, que normalment es dona entre el grup C-terminal de la proteïna (per tant aquest ha d’estar exposat a solvent si la proteïna és globular) amb la fosfoetanolamina i és un enllaç amida (isopeptídic) de manera que és un enllaç fort i irreversible que ens permet tenir la proteïna lluny de la membrana però ancorada en aquesta.
Aquests fosfolípids a la membrana no estan fixes sinó que es mouen, el que permet que la proteïna també es traslladi per la membrana per buscar el seu “bingind”, que pot ser una altra proteïna. Així doncs els fosfolípids permeten unió a la membrana, exposició i funció.
Hi ha proteïnes que tenen una hèlix hidrofòbica que les ancora a la membrana i una part globular que les manté fora. Aquest tipus de proteïna no es mou per la membrana (difon) mentre que l’ancoratge a un fosfolípid ens permet una distància de la membrana i la difusió per aquesta. La unió, en aquest cas, entre el GPI i la proteïna l’elabora la fosfoetanolamina.
GLICOSILACIONS Els sucres tenen una gran importància i presenten modificacions complexes. Quasi totes les proteïnes unides a membrana o les que són secretades estan modificades per diferents motius:  Reconeixement  Protecció (si estan al medi extracel·lular allà hi ha moltes proteases de manera que els sucres l’envolten i la protegeixen de l’atac)  Solubilitat (els sucres són solubles) 4 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 La modificació dona identitat, selectivitat i protecció. Aquests canvis modifiquen l’activitat de la proteïna i això és molt important, un exemple és la eritroprolietina, una proteïna que no és activa si no té el sucre i aquesta modificació ha de ser humana (els bacteris no tenen glucosilacions perquè no tenen ni aparell de Golgi ni Reticle Endoplasmàtic, ja que secreten poques proteïnes). Els llevats glicosilen i secreten molt poc i generalment les glicosilacions són molt diferents a les humanes de manera que, si produïm la proteïna en llevats no és funcional (hi ha grups que han aconseguit reproduir la via de glucosilació humana de la epo en llevats) Aquesta modificació a més, també ajuda al plegament ja que protegeix les regions hidrofòbiques. Alhora, serveix de reconeixement, com en el cas dels anticossos que molts pocs reconeixen tant la part proteica com la glucosídica. També, tenen identitat perquè els sucres tenen seqüència, en que l’ordre és diferent i per tant, aquest codi és un codi de reconeixement i identitat.
Les funcions principals de les glicosilacions són:  Modificació de l’activitat  Assistència en el plegat i localització  Confereix Identitat  Confereix Solubilitat  Confereix Imunigenicitat  Protegeix de la degradació Els sucres s’uneixen en n-glucosilacions (generalment ho elabora l’asparagina) o o-glucosilacions (el grup que es dona és OH i poden ser en serina, treonina i tirosina). Aquesta és una unió bàsica, a partir de la qual es poden generar més branques.
5 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Hem de pensar que la glucosilació no es pot donar en qualsevol posició, és a dir, qualsevol serina exposada no serà glicosilada sinó que existeix un patró de glicosilació (no cal saber) que està tant davant com darrera d’aquest aminoàcids (això ens permet predir aquestes modificacions), és a dir, cal que l’aminoàcid estigui envoltant d’uns residus específics que l’enzim reconeixerà i per tant, es durà a terme la glicosilació. Hem de pensar també que perquè es produeixi la glicosilació tant l’aminoàcid a glicosilar com el patró ha d’estar exposat a solvent.
A la majoria de casos la part glucosídica és una part petita en comparació a la part proteica però existeixen uns cassos especials com el Hialuran, una lipoproteïna que es troba a la matriu cel·lular, que té més part glucosídica que no pas proteica.
On podem trobar aquests sucres? Els podem trobar en:  Directament sobre els lípids, com a lloc de reconeixement  En proteïnes integrals de membrana (sempre tenim a la membrana una hèlix hidrofòbica que és molt fàcil de predir ja que són residus que tenen tendència a formar una hèlix i a més són hidrofòbics)  Reconeixement; molts virus, bacteris o limfòcits no reconeixen la proteïna sinó el glúcid que tenen unit. Això permet generar molta variabilitat (no hem de canviar tota la seqüència per generar una proteïna diferent sinó només modificar-la a nivell glucídic) Interacció entre sucre i proteïnes Hi ha unes proteïnes, les lectines que s’encarreguen de reconèixer els sucres com si d’una altra proteïna es tractés. La lectina té una superfície plana per tal de contactar amb el sucre; es col·loca sota el sucre de forma paral·lela i el reconeixement la majoria de vegades es dona per triptòfan que ataca a la mart més hidrofòbica del sucre. Això permet uns reconeixements molt específics, les lectines permeten reconèixer determinats sucres.
Un exemple és un limfòcit amb diferents proteïnes, en aquest cas necessitem que dues lipoproteïnes siguin reconegudes perquè es produeix l’internalització del limfòcit cap al lloc on hi h la inflamació. El limfòcit, que està recobert per glicoproteïnes va rodant pels vasos sanguinis fins arribar a un lloc on els receptors estan en una concentració prou elevada perquè es doni el reconeixement de les dues lipoproteïnes de forma simultània i això només passa si el limfòcit té unit el sucre, sinó mai no es dona el reconeixement.
6 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 TRANSPORT I MODIFICACIONS ASSOCIADES Observem seqüències senyals que són regions curtes situades sempre a l’extrem N-terminal i que serveixen per dirigir la proteïna a un compartiment en la majoria dels cassos. Quan la proteïna arriba al seu destí, aquesta seqüència senyal ja no serveix i és eliminada per una proteasa, generant, la proteïna madura. Quan purifiquem la proteïna d’un compartiment (com per exemple el mitocondri) aquesta proteïna no començarà per Meteonina sinó que ho farà per un altre aminoàcid (com per exemple alanina) i la primera seqüència serà tallada perquè només serveix per portar-la al compartiment adient.
Aquestes seqüències senyals són curtes i estan disponibles quan la proteïna està plegada i generalment tenen unes certes propietats: càrrega positiva, residus petits i regions hidrofòbiques. Es pot predir 100% que ens donarà una seqüència senyal i per tant, saber si la proteïna tindrà un pèptid senyal. Observem en el següent esquema algunes seqüències senyals de proteïnes eucariotes: Aquestes característiques que presenten són per un motiu: hem de pensar que les membranes tenen càrrega negativa i per tant, si volem anar cap a la membrana ho fan gràcies a l’atracció entre la càrrega positiva i negativa. Un cop el pèptid o proteïna ja està a la membrana ha de presentar regions hidrofòbiques per poder-la traspassar i finalment són petites perquè les peptidases que tallen el pèptid senyal (signal peptidases) reconeixen regions específiques en que hi ha un “forat” en la densitat total de la proteïna.
7 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Transport a mitocòndria Una proteïna que hagi d’entrar a una mitocòndria ho pot elaborar per mitjà d’un transport actiu o passiu, i un cop en aquesta les proteïnes poden anar a diferents compartiments: espai intermembrana, membrana interna o citosol Les proteïnes plegades generalment no passen a través de la membrana i per tant han d’entrar desplegades tot i que tinguin tendència natural a plegar. Per causa d’aquesta tendència a plegar hi participen les xaperones chap80 que s’uneix a l’estat desplegat quan aquest s’està sintetitzant. La seqüència senyal és la que s’encarrega de portar la proteïna al seu compartiment a través d’un transport actiu que es dona a través de la càrrega.
En el procés de transport hi participen dos sistemes: TOM (trans over membrane) i TIM (trans inner membrane) i la proteïna s’uneix a la chaperona i passa desplegada fins la matriu, on una proteasa tallarà la seva seqüència senyal i en absència d’aquesta la proteïna tallarà gràcies a l’acció de les xaperones (hsp 70).
Transport al cloroplast (tilacoid) En aquest cas no existeix un transport (s’ha de passar dos compartiments, la matriu i el tilacoid) de manera que les proteïnes tenen dues seqüències senyals, una darrera de l’altre: la primera seqüència em permet travessar la membrana externa, i un cop en la matriu una proteasa específica tallarà la primera seqüència.
Aquest tall generar una regió carregada nova, que és la segona seqüència, que permet el transport fins a l’interior del tilacoide.
Hem de tenir present que si la proteïna presenta les seqüències senyals desendreçades no podrà transportar-se fins al seu destí. Llegint la seqüència d’una proteïna podem saber si es cloroplàstica o de la matriu del tilacoide.
8 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Transport al nucli Hem de tenir present que la gran majoria de seqüències senyals s’eliminen un cop la proteïna arria al seu destí però en el cas del nucli això no és així. El concepte de transport és bàsicament sempre el mateix: transport actiu/passiu, tall i plegament tot i que el cas del nucli és una excepció ja que pot ser un transport reversible.
Proteïnes que es queden sempre en el nucli El transport passiu només es dona quan hi ha un gradent: quan la proteïna està plegada i sense la seqüència senyal ja no és la mateixa espècie de manera que, seguirà entrant la proteïna al nucli. Aquesta és una forma d’activar o desactivar l’entrada de la proteïna (augmento la concentració efectiva i la proteïna no sortirà).
Proteïnes que entren i surten del nucli Sabem que si la proteïna ha d’entrar i sortir això no es podrà elaborar si sobre la proteïna actua una proteasa, ja que el tall és irreversible. Les proteïnes que senyalen, que han de sortir del nucli, tenen una seqüència senyal que no és tallada, una regió anomenada NLS (nuclear localitzation signal), que es troba al interior de la proteïna, en una estructura de loop perquè ha de ser reconeguda.
El que s’encarrega del transport són les importines:  Importina α: reconeix la seqüència senyal  Importina β: reconeix la importina α quan està unida a la seqüència senyal perquè pateix un canvi conformacional El complex marxa cap al nucli (existeix un consum energètic perquè és un transport actiu). Un cop la proteïna està en el nucli les dues importines marxen per tal de ser reciclades. Hem de tenir present que necessitem energia perquè les dues proteïnes (tant la del interior com la de l’exterior) són iguals.
9 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Transport al reticle endoplasmàtic rugós L’entrada al reticle endoplasmàtic rugós (ER) no és de forma causal sinó que és un transport controlat per mitjà d’un mecanisme de translocació molt important perquè totes les proteïnes que han de ser secretades cal que es controlin. A mesura que anem passant pel ribosoma (i va llegint el RNAm) aquest va generant la proteïna, però com aquesta ha de ser secretada ha de tenir una seqüència senyal, que serà el primer que sortirà perquè es troba en N-terminal.
Aquesta seqüència senyal és reconeguda per la signal recognition particle (SRP), que està dissenyada per reconèixer aquestes seqüències (el que reconeix és el plaster hidrofòbic). La SRP s’uneix a la seqüència senyal, el que atura la síntesis proteica ja que la síntesis no es pot donar al citosol.
En la membrana del RE encarada cap al citosol hi ha dos receptors: un receptor del ribosoma, que té unit el peptide translocation complex i un receptor de la seqüència senyal. Aquests dos receptors han d’estar adjacents i a una distància curta ja que són reconeguts i permeten que la síntesis continuï a través del complex i té lloc finalment a l’interior del lumen del Reticle. Just al costat d’aquest complex hi ha una signal peptidasa que talla la seqüència senyal abans que la síntesis finalitzi.
10 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Estructura de la SRP L’estructura d’aquesta molècula va ser reconeguda fa relativament poc (6 anys) i é una estructura molt curiosa perquè és una ribonucleoproteïna, és una estructura que té RNA i proteïna:  El RNA que té és un RNA estructual, es plega a l’espai i tot i que sigui RNA és de doble cadena.
Aquest legament genrea una espècie de scaffold, de motlle on es col·loca la proteïna.
 La regió de la proteïna és la que ha de reconèixer la seqüència senyal de caràcter hidrofòbic Aquesta estructura tant complexa fa que el reconeixement pel seu receptor sigui molt específic.
Glicosilacions en el reticle endoplasmàtic A la vegada que la proteïna s’està processant en el reticle endoplasmàtic generalment és glicosilada. El dolicohol fosfat és la molècula que carrega els sucres a les proteïnes i és una molècula que pot ser més o menys llarga en funció de l’espècie però que sempre presenta dos caps: un cap polar i un cap polar amb un grup fosfat.
La seva posició normal és amb el cap apolar dins i el cap polar fora i sobre aquest fosfat es comença a construir el sucre, per tant, el sucre es comença a construir en el citosol. El primer que s’introdueix són N-acetilglucosamines i després manoses, el que va construint un petit motlle de sucres sobre el fosfat. Una vegada tinc aquesta estructura bàsica, que és comunia per totes les proteïnes, la molècula elabora una reacció de flip-flop, es capgira per la membrana de manera que, el que estava fora passa a estar encarat cap al lumen del reticle endoplasmàtic. Els sucres, ja encarats cap al reticle es van modificant en més manoses i glucoses.
11 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Una vegada construït el segon arbre ja el puc transferir a una proteïna; en aquest cas la transfereixo a una asparagina de manera que és una N-glicosilacio. Els transfereixo a la vegada que al proteïna s’està plegant i de fet això, en molts casos és beneficiós perquè els sucres són solubles. La proteïna plegada després anirà al Golgi i a la membrana, al camí però pot anar perdent o guanyar sucres.
PROTEÒLISIS LIMITADA La proteòlisis limitada no és més que produir un tall, que elaborarà una modificació reversible i la limitació ve donada perquè talla per un únic punt i és la que hem vist en les seqüències senyals anteriors. Una proteïna que té aquesta seqüència, quan se li talla pot passar a ser activada o inactivada tot i que, generalment el que passa és que activo la proteïna (faig un tall que elimina un fragment el que genera una remodelació de la proteïna i es genera una activació que abans no teníem).
Aquest és un mecanisme de control de l’activitat molt important i afecta a un gran nombre de proteïnes com aquelles relacionades amb la digestió o la modulació sanguínia.
La proteïna quan no és activa rep el nom de zimògen o pro-proteïna perquè el fragment que talla és el pro-segment. Una proteïna pot ser sintetitzada com una pro-proteïna i per tant, ha de ser tallada una vegada o bé pot ser sintetitzada com pre-pro-proteïna, que haurà de patir dos talls per actiar-se. Hem de tenir present que la seqüència senyal només permet portar la proteïna al compartiment en que ha d’actuar però el tall d’aquesta no modifica l’activitat de la proteïna sinó que és la proteòlisis la que permet la seva activació o no.
Com es tracta d’un tall irreversible ha d’estar controlat: es produeix en zones desestructurades (l’estructura secundària mai no és tallada) com per exemple en els loops que connecten dominis i normalment el tall té lloc en l’extrem N-terminal. El fragment que s’allibera és el segment d’activació o pro-segment i per tant tenim inhibidors de les proteases perquè la proteòlisis no es produeixi descontroladament.
12 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Tipus de proteases en funció del residu important en el centre actiu Observem la següent taula per saber els tipus de proteases que tenim: Tipus Característiques del zimogen/activació Serina peptidases Els canvis que es produeixen són molt petits i es tallen en l’extrem N-terminal. El centre actiu està performat però no definit, li falta un canvi conformacional per poder estar actiu.
Cisteïna peptidases Aquestes es poden activar de dues maneres diferents: es perd un segment que tapava les cisteïnes, que ara queden exposades a solvent o bé, es produeix una catàlisis redox, les cisteïnes passen a estar reduïdes i per tant, s’activen.
Aspàrtic peptidases Aquestes s’autoactiven quan canvien a pH àcid, quan arriben a un compartiment com el lisosoma. Una de les dues s’activa de forma espontània i aquesta ja és capaç d’activar i tallar la resta de molècules.
Metalo peptidases En aquest cas el centre actiu està preformat i conté un ió metàl·lic però no funciona perquè (centre actiu amb un hi ha un tap, un impediment físic que no permet que el centre actiu sigui accessible a metall ) solvent (si sintetitzem substrats molt petits poden difondre i són tallats eficientment) Totes aquestes proteases són sintetitzades en forma de zimogen o pro-enzim, en forma inactiva i són activades només en el temps i en el lloc en el qual es necessària la seva funció (el mecanisme d’activació és diferent).
Les proteases són proteïnes molt important des del punt de vista industrial (60% dels enzims utilitzats) i formen part de molts dels detergents que nosaltres utilitzem i generalment, són additius de detergents ja que el menjar conté proteïnes i per tant, aquests enzims els degraden. Que un detergent contingui proteases pot causar problemes com reaccions al·lèrgiques si la concentració d’enzim és molt elevada tot i que actualment porten entre 0,4 i 0,8 d’enzim. Hem de tenir present que no hi ha cap altre compost químic que pugui degradar proteïnes de forma tant eficient com les proteases.
Síntesis d’insulina La insulina es sintetitza com preproinsulina el que permet dirigi-la fins al compartiment. La forma activa de la insulina és el que veiem de color gris en el dibuix: dues cadenes curtes de 30 i 21 aminoàcids que estan unides per ponts disulfur; un pont intracatenari (en la cadena A) i dos intramoleculars (entre A i B).
La insulina en la medicina fa uns anys es feia servir de porc ja que només té un canvi respecte la insulina humana el que generava en algunes ocasions algunes reaccions immunològiques.
13 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Es va intentar sintetitzar insulina humana de novo i el primer que ho va aconseguir va ser una empresa americana; diferents companyies i laboratoris intentaven reproduir el que era la forma activa de la proteïna i el principal problema que presentaven és que aquesta nova forma no podia plegar.
L’experimentació es basava en generar una proteïna humana a partir de la forma recombinant en un bacteri: clonaven el DNA codificant per cada regió i l’expressaven en bacteri o bé la sintetitzaven químicament ja que no són cadenes gaire grans.
Un cop tenien les dues cadenes el que feien era reduir per si de cas s’havia format algun pont disulfur i permetien el plegament. El gran problema que presentava aquesta proteïna és que l’estat actiu quasi no té estructura, són dues cadenes unides per un disulfur el que provoca que no hi hagi res que la porti al plegament i sabem que els ponts disulfur es donen a l’atzar i per tant, tens totes les combinacions possibles el que genera una gran quantitat de problemes: com purifiques les cadenes que han format el pont disulfur correctament i com et desfàs de les altres formes que són altament tòxiques.
Existeix una segona idea que es basa en generar un plasmid que expressi les dues cadenes a la vegada però el resultat serà el mateix i encara pitjor perquè es dona en el citoplasma de E.Coli.
L’empresa americana el que fa es produir la proteïna tal i com es produeix a la natura, genera la proinsulina, el que suposa produir quasi ve un terç de més de proteïna que no servirà per res. Quan es produeix aquesta en E.coli es genera correctament, per tant, el que queda fer és tallar aquesta proteïna entre glicina – arginina i alanina – arginina de manera que tripsina talla darrera d’arginina: tinc dos punts de tall i per tant s’ha d’eliminar de forma eficient: ens queda una arginina, el que es farà servir és una carboxipeptidasa en C-terminal que tallaran aquests dos, obtenint la insulina (aquest és el mètode que es fa servir en el pàncrees dels humans).
Actualment la insulina humana que obtenim es produïda en llevats.
Processament de neuropèptids Els neuropèptids o hormones neuronals són molècules molt petites que acostumen a tenir entre 10 i 13 aminoàcids i per tant, aquestes no es poden produir al ribosoma perquè té una longitud mol gran i es quedarien ancorats allà (té un mínim de 40 aminoàcids tot i que 60 aminoàcids és el més òptim). Els neuropèptids s’han de formar com una proteïna més gran i després són processats.
Vasopressina El que veiem en gris claret és un pèptid senyal perquè aquests es sintetitzen molt en la pituïtària però han de sortir a l’exterior gràcies a aquests pèptid. Els puntets de color negre són aminoàcids bàsics perquè les proteïnes que els processen són del tipus tripsin like, s’assemblen a l’activitat de la tripsina (són més específiques), l’activitat fonamental i hidrolítica és la mateixa, és el tall d’un residu que és una arginina o lisina.
14 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 El gran avantatge d’aquest aspecte és que hi ha una copia per cadascuna d’elles, són equimolars de manera que tenim la relació molar necessària per la funció. A més proximitat (al tallar-les estaran juntes) tenim també funcions críptiques, si es talla per un altre lloc tindrem una altra hormona, per tant, sintetitzant una hormona podem aconseguir diferents en funció del lloc de tall.
Hem de tenir present que certs teixits tindran els enzims de reconeixement i els altres no els tindran. Partint d’una mateixa seqüència el cas més clar d’explicar la funció críptica esmentada anteriorment és la opiomelanocrtina. Aquesta és una proteïna molt llarga que al pituïtària es talla en uns pèptids però en un altre òrgan es tallaria en uns pèptids diferents.
L’activitat ve determinada no per la proteïna sinó per les proteases que la tallen, alliberant una hormona o una altre (entenem per hormona a un neuropèptid).
Plasminogen (vermell) i plasmina (blau) El plasminogen és un zimogen que no és actiu, és una d’aquestes peptidases que tenen el centre actiu format però no definit.
Aquesta forma no és activa mentre que la plasmina és la forma més activa i la diferència entre ambdues és un triptòfan i una valina.
El tall activador es produeix just davant de la valina de manera que el fragment que queda a la seva dreta no existeix després de la proteòlisis, és un fragment exposat a solvent que és fàcilment tallable i alliberant, generant un nou extrem N-terminal.
Aquest nou extrem N-terminal s’apropa a l’aspàrtic i la valina però no pot format ponts d’hidrogen de manera que qui els forma és la cadena principal de la valina, que tindrà una unió de 2 ponts d’hidrogen amb l’aspàrtic el que genera un canvi conformacional que gira al triptòfan a l’altre costat. Aquest canvi, que és molt gran i amb molt de volum, obre el centre actiu per l’entrada de substrats.
Hem de tenir present que el tall es produeix en un extrem però el canvi de conformació es genera en un altre lloc de la molècula. Aquest aspecte és degut perquè l’estructura de la proteïna es manté per unions cooperatives, per tant, petits talls o canvis poden generar canvis en un altre indret molt grans.
15 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Procarboxipeptidasa Aquesta és la proteïna capaç de tallar els extrems C-terminal i en aquest cas és del tipus A, a més, trobem un zinc en l’estructura de manera que podem dir que és una metalocarboxipeptidasa.
En la imatge, la forma de l’esquerra és la forma de zimogen i la de la dreta és l’activa. Si mirem l’estructura sabem que les podem superposar, no hi ha canvis estructurals entre les dues formes.
Aquesta proteïna és activada per tripsina, que talla el final de la hèlix, que es desmunta, el que permet que salti el segment (domini d’activació), convertint la proteïna en la forma activa (ja no pots aturar la seva activitat).
L’activitat d’aquest enzim es veu alterada per inhibidors, com per exemple LCI, un inhibidor de sangoneres. El que fa aquesta molècula és anocrar-se a sobre de la proteïna tapant el centre actiu; no bloqueja l’activitat sinó que elabora contactes a nivell de µmolar, el que genera que siguin molt estables. Els inhibidors proteics són reversibles, si la constant d’associació és molt feble el tindrem associat i dissociat, tot i que sigui reversible, hem de desplaçar l’equilibri perquè es comporti quasi sempre de forma irreversible.
Cascades de coagulació: participació de les proteases Cascada de digestió de proteïnes (zimògens pancreàtics) La digestió de proteïnes es dona en l’intestí prim (duodè) i tenim tres proteases digestives: tripsina, elastasa, caroxilpeptidasa i α-quimiortipsina. Aquestes proteïnes estan al pàncrees, els sucs pancreàtics, entre d’altres tenen aquestes tresproteïnes i aquests enzims són molt actius però cal tenir present que en el pàncrees es troben en forma de zimogen i només es poden activar en arribar a l’intestí.
16 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Les formes taronges de la imatge anterior es troben emmagatzemades en el pàncrees. En l’intestí el que tenim és l’enteropeptidassa i el procés funciona com: tens gana  secretes sucs i per tant, arriben tots els enzims en forma de zimogen. L’enteropeptidasa només ha d’elaborar el primer tall, és una proteasa molt poc funcional, quasi no degrada res.
Quan el tripsinogen passa a tripsina, les molècules de tripsina poden generar un loop positiu per activar els altres zimògens de manera que, només hem d’activar la primer molècula (sempre per un senyal extern). Observem doncs que tenim un enzim capaç d’activar tripsinogen  tripsina i és aquesta tripsina la que inicia tota la cascada de digestió.
Aquest és un procés irreversible, quan es produeix el primer tall es genera una cascada amb una amplificació molt forta del senyal i per tant, de forma irreversible.
És molt important que tota aquesta cascada no es produeixi en el pàncrees i és per això que tenim el pancreatic tripsin inhibidor perquè si accidentalment s’activa una tripsina la puguem inhibir (és un inhibidor amb una constant d’afinitat molt elevada). Per formar aquest tipus de mecanisme, regulat, activable... necessito un gran consum energètic en un altre compartiment per evitar la compactació i per tant, aquests mecanismes requereixen que una part de l’organisme tingui un gran control (en aquest cas el pàncrees).
Cascada de coagulació sanguínia La principal diferència entre aquesta cascada i l’anterior és que: aquí el reconeixement és molt més gran (la tripsina podia tallar totes les proteïnes mentre que aquí cada proteïna només pot tallar al de sota seu). És un zimogen que passa a ser activat per una proteasa per donar lloc a la seva forma activa, que a la vegada és una proteasa, que activa el factor de sota, que activarà una altra proteasa, que activarà un altre factor...per tant es genera una cascada molt gran, ràpida i amplificable.
Hem de tenir present que aquesta cascada ha de ser controlable perquè sinó està relacionada amb patologies, com és un exemple l’hemofilia, en que un dels factors no és activable i per tant, la cascada de coagulació no es dona correctament.
La cascada de coagulació sanguina té una sèrie de característiques:  Ràpida  Localitzada  Activable (sinó sempre tindrem coàguls de sang)  Autosegellant, ha de tancar el problema per ella mateixa Durant la coagulació la sang per liquidesa, es tora un gel i aquest es compacta i es torna sòlid, el que permet tapar la ferida que s’ha elaborat en el vas sanguini.
L’efector final és la fibrina, el que forma el coàgul. En la sang tenim una proteïna coagulant molt important (és molt abundant i soluble), el fibrinogen, que pateix un tall proteolític el que genera que sigui completament insoluble i que generi agregats fàcilment, forma la fibrina, el que permet generar el coàgul de sang.
17 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 En la sang hi ha 12 factors de coagulació i hem de tenir present que estan numerats per ordre de descobriment de manera que el factor 19 podria actuar abans que el factor 9. En aquestes reaccions intervenen 12 proteïnes però a més a més, actuen fosfolípids (són molt importants per la seva càrrega negativa) i calci (molt important perquè les proteïnes tenen dominis amb γ-carboxiglutamasa). Aquestes proteïnes es sintetitzen al fetge i circulen en sang però de forma molt inactiva (hi ha zimògens que poden tenir una activitat residual però en la cascada de coagulació no es dona).
La reacció és molt ràpida perquè una molècula talla a una altra, que a la vegada pot tallar a múltiples molècules de manera que, hi ha una amplificació de la senyal fins que arriba al fibrinogen, que forma fibrina. L’efector final és la trombina i fa falta només tallar una molècula a l’inic perquè arribem a processar milions de molècules de trombina.
Hi ha dos vies per les quals es pot donar la coagulació de la sang:  Via intrínseca (activador és el col·lagen)  Via extrínseca (activador és factor tissular) El nom és una errada històrica ja que es pensava que la via intrínseca no necessitava res més però actualment sabem que les dues necessiten d’una lesió que doni el senyal.
El mecanisme bàsic sempre és el mateix:tenim un enzim activat, un substrat no activat (proenzim) i un cofactor que possibilita la reacció, permetent que aquesta sigui localitzada. El tall es dona per serina proteases i per tant és molt similar al tall de la tripsina (tripsin like) i cal tenir present que un factor només reconeix al factor següent, per tant és molt específic.
Quan ens falta algun factor es genera una hemofília, no puc coagular la sang. Aquesta és una malaltia multigènica, moltes mutacions a diferents gens poden donar la mateixa malaltia, que és més gran com més amunt de la cascada es generi.
Via intrínseca Aquesta es dona quan hi ha una lesió a la membrana de l’endoteli i llavors la sang entra en contacte amb les fibres de col·lagen (el col·lagen normalment no es veu a l’endoteli, si el veiem és perquè hi ha un problema) i s’inicia la cascada de coagulació sanguina. El col·lagen el que dona és una superfície carregada negativament que permet iniciar la reacció (quan es fan proves de coagulació normalment es posa en un porta amb càrrega negativa, ja que aquesta permet que la reacció sigui més ràpida).
El que passa durant la via és que el col·lagen interacciona amb l’activador del factor 12, la precal·licreïna que interacciona amb el factor 12 i aquesta interacció fa que s’activi lleugerament la cal·licreïna, que talla (no molt perquè té poca activitat) el factor 12. Aquesta és una mesura de control, el procés és lent. El factor 12 però és molt bon processadors de la cal·licreïna (està en els teixits) de manera que activarà tota la precal·licreïna, que a la vegada generarà cal·licreïna que tallarà més factor 12 (es genera una espècie de bucle d’ampliació del senyal).
18 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Una vegada tallo el factor 12, aquest talla el factor 11 en presència de calci (reacció molt controlada). Quan arriben les plaquetes el factor 11 talla al factor 9, que s’uneix a calci i als fosfolípids de la membrana de les plaquetes (s’uneix gràcies al calci, que és positiu i per tant, permet que s’introdueixi a sobre dels fosfolípids, de caràcter negatiu) el que permet que aquesta plaqueta no difongui per la sang sinó que es quedi ancorada en el vas sanguini.
El factor 9 elabora la reacció de tall del factor 10 sobre la superfície de la plaqueta, que està a la ferida. Aquest factor 10 és l’efector final, comú en les dues vies (més tard veurem la via comuna).
Via extrínseca És molt semblant a la via anterior però és més ràpida (dura segons mentre l’altre pot durar minuts) ja que requereix de menys reaccions. En aquest cas qui dona la senyal és un factor tissular (lipoproteïna), aquest és una proteïna que normalment està dins de la cèl·lula de manera que quan es detecta fora, a l’endoteli és perquè hi ha una problema (les cèl·lules en trencar-se alliberen factor tissular).
En presència de calci es produeix el tall del factor 7, que és activat i que gràcies a fosfolípids i calci s’uneix a la membrana de les plaquetes (localització), el que permet activar, un cop unit, el factor 10.
Via comuna Hem de tenir present que les dues vies poden tenir lloc simultàniament en una mateixa regió o ve es poden donar per separat (com per exemple in vitro). A partir de l’activació del factor 10 les dues vies segueixen la via comuna. El factor 10 el que fa és tallar la protrombina, el que dona lloc a trombina.
El factor 10 pot ser activat també per factor 5, que és activat per la trombina (genera una amplificació de la cascada). Hem de pensar que un cop tenim el factor 10 activat ja estem a baix de la via i l’activació d’aquesta ha de ser més ràpida i aquest bucle generat per l’actuació de factor 5 permet que la generació de trombina sigui més ràpida. La trombina permet tallar el fibrinogen a fibrina, el que genera el coàgul en formar agregats per la seva insolubilitat.
Els tubs d’extreure sang estan recoberts de EDTA, un quelant de divalents mol comú: si quelem el calci la reacció de coagulació s’atura ja que moltes reaccions requereix de la unió proteïna – calci – lípids. Amb EDT evitem la coagulació.
19 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Enzims que participen en el procés Aquests enzims són serina proteases (tenen una serina en el centre actiu) i per tant, tallen darrera de residus carregats positivament (han de reconèixer una seqüència). Generalment tenen les següents parts:  Domini catalític i enzim actiu (vermell): aquesta regió és pràcticament idèntica a la tripsina, que acabaria sobre la regió blava i amb un segment d’activació més curt.
 Segment d’activació: en aquest cas és molt llarg i això és perquè ha de donar reconeixement de fosfolípids, calci.... en general podríem dir que són dominis complexos.
 GLA dominis: són dominis molt abundants i rics en carboxiglutamats.
La trombina La trombina és una proteïna molt important a nivell biotecnològic perquè si volem resoldre un problema de coagulació es buscarà solucions en aquesta proteïna ja que està al final de la via i es comuna per les dues possibles vies, és l’efector final.
És una lipoproteïna d’uns 600 aminoàcids i 12 ponts disulfur intracatenaris (cada kringle domini té aproximament 3 ponts disulfur, són proteïnes globulars, petites i mantingudes per disulfur, que si el tallem es manté plegat). És una serina proteasa.
És activada (llavors es trombina, abans era protrombina) per factor 10, que elabora dos talls diferents:  El primer tall s’elabora entre arginina 271 i arginina 272 el que allibera un propèptid, que té uns 32 KDa (la mida normal d’un domini és de 20 KDa de manera que és gran que una proteïna normal). La proteïna encara no és activa però el que si no té el propèptid, seria equivalent a tenir el centre actiu d’un enzim definit però no activat (és una molècula molt poc activa).
 El segon tall es dona entre arginina 320 i isoleucina 321, el que no allibera res perquè la regió que hauria de saltar queda unida gràcies a un pont disulfur. El que si que es genera és una remodelació del centre actiu, que ja pot tallar al responsable de la coagulació, el fibrinogen.
El fet de requerir un segon tall és un mecanisme de control: si es talla casualment la trombina serà molt poc activa.
20 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Fibrinogen El fibrinogen és una proteïna estructural no té activitat (com la seda, col·lagen...) té 3 cadenes a, b, c que són anomenades α, β, γ en el cas de la fibrina (no es pot administrar de forma espontània, ha de ser produïda). Aquestes tres cadenes formen una triple hèlix (no s’assembla a la del col·lagen) el que dona lloc a estructures íntimament lligades; tenim una molècula allargada amb un eix de simetria central. El que mateix unides les dues dobles cadenes son els ponts disulfurs.
Aquesta proteïna té regions molt riques amb anells de ponts disulfur, que grapen la triple hèlix pels dos costats. La proteïna, és allargada i de caràcter fibril·lar i per tant, té tendència a ser insoluble perquè és molt gran.
La proteïna circula en sang i és molt soluble gràcies a 4 cadenes que surten del costat dels ponts disulfur (marcades amb una fletxa verda) que són anomenats fibrinopèptids i que estan extremadament carregats negativament (tenen aspàrtics i glutàmics). Aquests pèptids també tenen modificacions postraduccionals on les tirosines estan unides pel seu hidroxil (gràcies al oxigen) al grup sulfat, per tant, són pèptids que tenen una densitat de càrrega negativa molt alta que provoca que quan dues molècules de fibrinogen es troben experimentin una alta repulsió electrostàtica.
El que fa la trombina és tallar entre arginina i glicina (darrera d’arginina) de manera que talla els fibrinopèptids i per tant, les càrregues negatives que generaven al repulsió desapareixen i s’exposa una regió que és hidrofòbica el que desencadena un autoassemblantge del fibrinogen en fibrina de forma automàtica.
21 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Es generen unes xarxes. Aquestes interaccions en el coàgul de fibrina cal tenir present que a l’inici el coàgul és molt tou perquè les interaccions que tenim no són covalents de manera que el següent pas es generar interaccions covalents noves (com les que formen el col·lagen). Això ho elabora la transglutamina, un factor de la sang molt important, que forma enllaços entre glicina i glutamina de cadenes adjacents, el que ens permet unir les cadenes.
En aquest moment el que necessita la molècula és un lligand perquè no hi ha proximitat, aquest lligand no es trencable per reaccions redox i el lligand es fàcil d’aconseguir ja que es dona per la reacció entre una amida i un carboni, el que genera un enllaç isopeptídic i l’alliberació d’amoníac. Si en algun moment volem desfer el complex necessitem una proteòlisis, que és elaborada per la plasmina, una serina proteasa que s’encarrega de trencar els aglomerats de fibrina.
Síntesis del carboxiglutamat En moltes de les reaccions ens fa falta carboxiglutamant i existeixen el que anomenem radomen, dominis o regions molt riques en aquest composts, que el necessitem perquè és un reactiu bidentat.
La síntesis d’aquest composts depèn de vitamina K, que participa en un procés en el que s’elimina l’hidrogen i el glutàmic de manera que el carboni queda activat. Amb l’entrada de CO 2 es podrà generar carboxiglutamat (el que fa d’acceptor és la vitamina K). Si tenim un dèficit de vitamina K també es genera un problema de coagulació (per això direm que la vitamina K és essencial), afortunadament però la vitamina K es troba en molts aliments i si l’organisme no presenta cap problema de formació no hi haurà repercussions.
El diacomarol o la warafina es fan servir com anàlegs de la vitamina K i aquest aspecte és interessant perquè puc subministrar aquests per tal de bloquejar l’enzim que s’encarrega de la síntesis de la vitamina K el que provocarà un dèficit en el carboxiglutamat i per tant, tindrem el mateix efecte que si no introduïm calci; l’organisme presentarà problemes de coagulació. Els anàlegs no s’administren perquè les dosis s’han de controlar molt i es poden fer servir com potents verins perquè l’organisme els processa i no queda rastre d’ells.
22 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Control per inhibició Un hematòfag és un animal que s’alimenta de sang com per exemple la sangonella, garrapata, mosquits... aquests animals tenen una gran importància biotecnològica ja que tenen una gran quantitat de proteïnes anticoagulants molt efectius (més dels que nosaltres tenim i molt més efectius que qualsevol inhibidor químic). Algunes plantes també tenen anticoagulants.
Observem en la següent imatge l’inhibidor més potent de la trombina, la hirudina, que s’uneix mol estretament a aquesta, hi ha una unió total sense que quedi espai entre elles. Aquesta és una proteïna que segrega la sal o bé que es segrega en les glàndules salivals i que inhibeix l’efector final ja que el fibrinogen no passa a fibrina i per tant, no es produeix la coagulació de la sang.
Aquesta molècula (trombina + hirudina) està patentada.
Intein autoproteolysis Les inteïnes són els exons i introns que conté el genoma eucariota en abundància. Les inteïnes són doncs proteïnes que contenen en el seu interior altres proteïnes, podem considerar que la inteina és la proteïna que està pròpiament dins.
Aquesta és una proteïna descoberta relativament fa poc i després de ser sintetitzada pateix un procés de splicing que no requereix de la presència d’altres proteïnes sinó només d’ella mateixa, el que allibera: exteina i inteina.
Aquesta inteina no sempre, però si en molts cassos, és el que anomenem una home endonucleasa, aquesta endonucleasa està codificada i amagada dins d’una altra proteïna i la seva funció és tallar gens per dins el DNA.
23 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 El processament és un mecanisme complex, tenim exteina – inteina – exteina i el darrer aminoàcid és la N-exteina que generalment és una serina, treonina o cisteïna. Després de la síntesis el que es produeix és que aquest residu ataca al seu enllaç peptídic (penúltim enllaç ja que l’últim és el de connexió amb la inteina). Aquest ataca fa que es produeixi un anàleg que es reconegut pel primer residu de la C-exteina, que és serina, treonina o cisteïna. El que es produeix és un atac que incorpora la cadena lateral dins la cadena principal.
Això forma una estructura terciària que ja conté l’extrem N-terminal, que serà el definitiu de la inteina però conté una estructura terciària que té la part Nterminal i C-terminal de la exteina i la part central de la cadena lateral.
El darrera aminoàcid trenca l’enllaç peptídic que hi ha immediatament després de l’aminoàcid en qüestió, que expulsa i allibera dues coses:  La inteina, que sempre té en C-terminal un enllaç amida  Exteina ja unida Observem doncs, com la proteïna ella sola és capaç d’autosplicing d’una forma molt eficient.
La primera persona en descobrir aquest mecanisme el va patentar ja que aquests ens permet sintetitzar híbrids de la proteïna que vulguem (actualment es fa) i per tant, ens permet veure reaccions i altres característiques mai vistes.
Una aplicació d’aquest aspecte és en l’estudi de l’estructura proteica; sabem que l’estructura es pot estudiar per ressonància magnètica (el que ens dona ressonància són els protons o els isòtops, com d’hidrogen o de carboni) de manera que, podem marcar un domini amb isòtops i l’altre no, el que ens permet veure com interaccionen entre ells, diseccionar la proteïna.
24 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 DEGRADACIÓ DE PROTEÏNES La degradació proteica és una modificació postraduccional i s’elabora sempre que la proteïna s’ha d’eliminar. Aquesta degradació és molt important per varis aspectes:  Eliminació de proteïnes mal plegades  Eliminació d’enzims no necessaris  Regulació del cicle cel·lualr La degradació és tant important com la síntesis i per tant, es gasta tanta energia com en la síntesis (si es consumeix gran part d’energia és perquè és un procés important). Les proteïnes dins la cèl·lula es degraden en diferents compartiments.
Via mitjana de les proteïnes La vida mitjana d’una proteïna depèn de:  Seqüències PEST, regions riques en aquests aminoàcids  Extrem N-terminal ja que només canviant aquest pots canviar la vida mitjana d’una proteïna. Podem generar variants que difereixen dels aminoàcids que trobem en aquest extrem. Trobem aminoàcids que són: o Estabilitzants: tenen una vida mitjana de més de 20 hores i en general es tracten d’aminoàcids petits o Desestabiltizants: el pitjor aminoàcid és l’arginina En general quan es dissenya una proteïna cal tenir present que és molt important no col·locar una arginina a prop de l’extrem N-terminal ja que aquesta indica que la proteïna ha estat tallada i per tant, la cèl·lula té una tendència a creure que s’ha donat una proteòlisis limitada no correcte i intenta eliminar la proteïna.
Observem en el següent quadre els aminoàcids que poden donar diferents tipus de vida (cal saber aquests aminoàcids): 25 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Degradació en lisosomes La degradació en aquest compartiment cel·lular suposa un transport, els lisosomes són compartiments cel·lulars molt ben protegits que tenen un pH àcid i contenen proteïnes cathepsines, que són cisteïnes proteases i que són proteïnes molt actives a un pH àcid (pH≈5). El trencament d’un lisosoma no presenta un gran problema ja que aquestes proteïnes només funcionen i son actives en el pH del lisosoma i per tant, el sistema d’ubiquitines podria ser suficient per eliminar aquestes proteïnes sense causar cap dany.
El lisosoma degrada la gran part de les proteïnes o com a mínim dona un lloc de tall i aquest internament de proteïnes pot ser:  No selectiu  Selectiu (es reconeixen certes seqüències, com per exemple KFERQ, una seqüència de degradació. Generalment aquestes seqüències la tenen les proteïnes de vida mitjana curta).
Degradació per mitjà d’ubiquitines Aquest és un procés molt complex que es basa en la marcació de la proteïna per ubiquitines. La proteòlisis mediada per ubiquitines està relacionada amb una gran quantitat de funcions biològiques.
El cicle cel·lular està format per diferents proteïnes (ciclines) que es sintetitzen durant determinants moments del cicle i a continuació es sintetitza la següent ciclina necessària el que provoca que en cada entrada en nova fase cada ciclina ha de ser degrada (hi ha una gran síntesis i degradació de ciclines) i l’encarregat de dur a terme aquesta funció és la ubiquitina proteosoma.
La ubiquitina és una proteïna molt petita, formada per 6 aminoàcids i amb un pes de 8,6 KDa i hem de tenir present que es torba en tots els organismes de manera que la seva seqüència està molt conservada (ultraconservada) i de moment mai no s’han detectat un organisme amb dèficit d’aquesta proteïna.
26 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Mecanisme d’assemblatge d’una ubiquitina Si una proteïna està marcada amb ubiquitines està condemnada a anar al proteosoma i per tant, a ser degrada. Perquè no es produeixi cap error sempre es marca una proteïna amb una cadena d’ubiquitines i no amb una solament perquè no es pugui deure a una reacció aïllada i es degradi al proteïna sense cap motiu.
La ubiquitina té sempre en C-terminal una glicina que s’enllaça amb E1 (enzim 1), aquest té una cisteïna activada i per tant, està reduït i amb un consum d’ATP (perquè així ens assegurem un control) es produeix un enllaç entre el carboni i el sofre. Aquest mecanisme només té la funció de transferir la ubiquitina a l’enzim E2, que actua i funciona igual, és a dir, té una cisteïna activada que s’enllaça i substitueix a la que tenia E1, que surt intacte per poder ser reciclat. El que tenim ara és el complex ubiquitina – E2, de manera que pot intervenir la proteïna que ha de ser marcada.
E1 i E2 són enzims genèrics i només requereixen d’ubiquitina de manera que no tenen cap selectivitat. E3 és l’enzim important que decideix la proteïna a degradar de manera que en tenim centenars de diferents (des altres tenim pocs) i cada E3 s’encarrega de la degradació específica d’una proteïna (per exemple de ciclines). E3 reconeix dues coses:  Proteïna que ha de ser degradada i per la qual té afinitiat  E2 carregat amb ubiquitina Aquest enzim el que fa és aproximar i catalitzar la formació d’un enllaç de tipus isopeptídic entre una lisina de la proteïna i l’extrem C-terminal de la ubiquitina. El fet que sigui una lisina és perquè té exposats a solvent grups Ɛ-amino i el que s’aprofita és la reactivitat per formar l’enllaç.
Exemple de degradació de la ciclina B L’enzim E1 carrega la ubiquitina, que la transfereix a E2 el que permet l’alliberació de E1 i el seu reciclatge. E2 transfereix la ubiquitina a E3 i també s’allibera. Per últim E3 uneix la ubiquitina amb la ciclina B, que en aquest cas és presentada amb cdc2 (aquesta molècula ens indicia que la ciclina ja està en la seva fase final). La ciclina B es marca varies vegades el que la portarà al proteosoma que fa saltar: ubiquitines, cdc2 (ambdós seran reciclats) i els pèptids de la proteïna.
27 Judith González Gallego Química i enginyeria de proteïnes T6 Proteosoma El proteosoma està present en tots els organismes perquè cal tenir un mecanisme de degradació de proteïnes. El que elabora l’acció proteolítica són dos anells de 7 (en eucariotes cada anell β de 7 és diferent) que generen una gran cambra de 53 Å dins. Hem de tenir present que les subunitats α que trobem adalt i abaix no són catalítiques de manera que les úniques subunitats catalítiques són les β, que tenen activitat quimiotripsina i tripsina.
Les subunitats α són les encarregades de definit una capitat de 13 Å de manera que la proteïna s’ha de desplegar per entrar.
Així doncs tenim la proteïna estirada i entrarà a la cavitat definida per les subunitats β (tenen els centres actius mirant al interior) el que permet tallar la proteïna.
Adalt i abaix es col·loquen les 19S (provinent del coeficient de sedimentació) que consta de 10 subunitats a la base, de les quals 6 tenen activitat ATPasa (volem activitat ATPasa per tirar la cadena cap avall). 9 subunitats conformen la tapa i són qui reconeix i deslliga la ubiquitina.
Quan el proteosoma es bloqueja la cèl·lula presenta problema perquè les proteïnes no es poden degradar. A més a més, cal tenir present que el proteosoma elabora altres funcions com tallar les proteïnes en pèptids petits, que després són tallats, generant aminoàcids. Així doncs el bloqueig del proteosoma genera dos problemes:  No degradació proteica  Cap subministre d’aminoàcids lliures per incorporar a les proteïnes (sobretot el triptòfan suposa un gran problema) Esquema general de la degradació amb ubiquitines: 28 ...