Tema 5 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Química i Enginyeria de proteïnes
Año del apunte 2014
Páginas 50
Fecha de subida 14/10/2014
Descargas 36
Subido por

Vista previa del texto

Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 PLEGAMENT I DINÀMICA CONFORMACIONAL DE PROTEÏNES CONCEPTE DE PLEGAMENT El plegament és el que fa que una proteïna adopti una estructura tridimensional determinada.
Sabem que aquet aspecte està codificat a la seqüència, l’estructura tridimensional i la seqüència es troben codificades en el genoma. Per tant, en teoria, si sabem la seqüència genòmica (actualment la coneixem pels humans) podríem saber en teoria l’estructura tridimensional de totes les proteïnes (humanes, plantes...).
El que no es coneix és com funciona el plegament, com a partir de la seqüència proteica obtenim l’estructura tridimensional i això ho hem de saber pas a pas, com s’arriba a la proteïna totalment plegada. El plegament de proteïnes connecta el genoma amb l’estructura i per tant, amb la funció proteica i per tant, és doncs, una connexió molt complicada.
Tipus de plegament Plegament espontani El plegament espontani el segueixen aquelles proteïnes que adopten la seva estructura tridimensional sense necessitat de ninguna ajuda i generalment són proteïnes petites.
Plegament amb catàlisis Les proteïnes de tamany moderat o gran necessiten una ajuda per dur a terme el plegament. Hi ha una sèrie d’enzims que catalitzen la reacció de plegament però hem de tenir present que no la canvien perquè aquesta està sequenciada al genoma (el genoma té codificat com és l’estructura plegada i com arribar a ella). Tenim catalitzadors per aquells passos que són importants i que poden donar problemes com per exemple:  Formació de ponts disulfur: aquest treball és l’elabora les disulfurs isomerases, que són proteïnes especialitzades en identificar els disulfurs que s’han format incorrectament i donar una altra oportunitat de formació. És molt important aquest aspecte perquè una proteïna amb els disulfurs mal formats s’ha de degradar perquè no és funcional de manera que, això suposa un consum energètic.
 Canvi cis-trans de la prolina: sabem que la majoria de proteïnes tenen la prolina en formació trans però la relació és 4:1 per tant, quan la proteïna plega, la prolina pot ser que estigui en cis en l’estructura nativa i quedi en trans o al revés. Això suposa un problema que és solucionat per les prolil-cis-trans, que desfan l’enllaç i permeten que es formi la conformació més estable termodinamicament.
 Plegament i agregació: les txaperones són proteïnes que ajuden tant al plegament com a l’agregació de proteïnes.
Quan una proteïna no plega té els seus hidrofòbics exposats a solvent i això provoca l’agregació.
La cèl·lula dedica 1/3 de la seva energia en que les proteïnes pleguin correctament ja que si no ho estan pot arribar a morir.
1 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Passar de l’estat desplegat al plegat Aquesta és una reacció molt ràpida tant in vivo com in vitro, les màquines que mesuren el plegament estan dissenyades per captar reaccions en el rang dels milisegons (el rang en que es troba el plegament és de milisegons - segons) i ho fan gràcies a un algoritme, a un programa informàtic que permet plegar qualsevol seqüència. Un mal plegament, tal com hem dit anteriorment, pot arribar a causar la mort de la cèl·lula.
Fa 7 anys un investigador va demanar que deixessin la maquinària accessible per tal de poder treballar i després de reunir a un milió de voluntaris va aconseguir plegar el domini SEC 3 (un domini petit de 60 aminoàcids) al cap de 3 setmanes, mentre que la natura elabora el mateix plegament en un temps de 0,4 milisegons. Aquest experiment però va ser tot un èxit. L’any passat es va aconseguir plegar la mateixa proteïna en aproximament un dia i només ho pot elaborar una persona al món perquè és la única que té la maquinària necessària (hem d’entendre que això és un gran èxit).
Complexitat del plegament El plegament és un procés molt complex i es coneixen molt poc els aconteixements que es donen lloc durant aquest.
Existeixen dos problemes durant el plegament:  Direcció normal: tinc una seqüència i vull saber quina estructura adoptarà. Aquest és un problema de la biologia no resolt ja que podem conèixer les estructures per homologia però no podem arribar a saber com han plegat.
 Problema invers: aquest és també un problema molt important ja que donada una estructura, una funció, volem saber quines són les seqüències d’aminoàcids que serien idònies per donar aquests aspectes. Sabem que el que més varia és la seqüència, de manera que podem tenir moltes seqüències que donen lloc a una mateixa conformació o estructura i això és molt important perquè podem patentar una quinasa amb una seqüència no humana que doni lloc a una conformació amb homologia per sota del 40%. Aquest és un camp molt important pel disseny proteic.
DESNATURALITZACIÓ / DESPLEGAMENT (UNFOLDING) Aquests dos conceptes no són el mateix però sovint si que es tendeixen a barrejar, diferenciem entre:  Unfolding: procés reversible, despleguem una proteïna i aquesta tornarà a plegar de forma espontània  Desnaturalizació: procés irrevesible, nosaltres despleguem la proteïna però aquesta no tornarà a plegar tot i que retornem a les condicions inicials (un exemple és un ou ferrat, en que desnaturalitzem l’albumina) Hem de tenir present que una mateixa proteïna pot tenir unfolding i desnaturalització i que ambdós són processos cooperatius.
El desplegament ha de ser reversible per tal que pugui existir en la cèl·lula.
2 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Acció de la temperatura El procés de plegament i desplegament és un procés reversible ja que les proteïnes pleguen per elles mateixes i per tant, en principi les podem desplegar per acció de la temperatura i al tornar a les condicions normals la proteïna tornarà a plegar seguint una via inversa. Si introduïm a una proteïna un augment de temperatura al principi tindrem tota la fracció plegada però a mesura que avancem, la proteïna començarà a fluctuar, i al passar un cert límit de temperatura es trencaran totes les interaccions, perdent el plegament de forma molt ràpida. Si elaborem el procés contrari, tenim la proteïna a 100 graus i la refredem, al principi no tindrem les suficients interaccions per començar el plegament però hi haurà un moment que tindrem les suficients per poder plegar la proteïna.
Aquesta cooperativitat del plegament elabora dues coses: tenir una temperatura límit o llindar i que el temps de plegat sigui curt.
Acció agents químics Els agents químics que podem utilitzar són la urea i el clorur de guanidini. Essencialment el que fan aquests agents és que provoquen que la proteïna es desplega, com més concentració tenim d’agents caotròpics més desplegaré la proteïna. Observem en el següent esquema que el que seguim és la quantitat de proteïna plegada a cada concentració d’aquests agents: Al principi, per molt que augmenti la concentració la proteïna no ho nota, es manté estable, plegada. Quan continuem augmentant el que succeeix és un procés cooperatiu i arriba un moment en que perdo el 50% de l’estructura i això és el que anomenem urea o clorur de guanidini ½, com més gran és aquest valor més estable és la proteïna perquè necessito més quantitat d’agent cautròpic per desplegar-la.
Arriba un moment en que tenim la proteïna desestabilitzada, llavors s’inicia el procés cooperatiu i el desplegament és més ràpid. En els esquemes trobem 3 mutants de la proteïna i el qe es busca és el plegament més estable, que és el natural (marcat amb color verd) 3 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Diferències entre l’estat natiu i l’estat desplegat Característiques de l’estat natiu  L’estat natiu té la compactació òptima; normalment si no parlem de proteïnes fibroses és globular en que els grups polars estan a l’exterior i els apolars a l’interior.
 Té la mínima superfície exposada, de manera que té forma d’esfera  L’estructura està disposada amb una disposició jeràrquica de l’estructura (aplicació de dominis estructurals)  Les proteïnes no són rígides, sinó que són flexibles ja que per la seva funció les cadenes laterals s’han de moure.
Hem d’entendre sempre que la flexibilitat és l’òptima per no tenir problemes entròpics.
 Considerem que la conformació és única (això realment no és cert perquè la proteïna té diferents conformacions, elabora com moviments de respiració, però nosaltres considerarem que aquests són tant mínims i sempre al voltant d’una conformació única).
 Mínim energètic (termodinàmic) Característiques de l’estat desplegat  Té expansió màxima  No sabem que és un estat desplegat perquè aquest mai no s’ha observat. Entenem com estat desplegat a un estat teòric del qual no tenim cap mètode per determinar-lo. Anomenem l’estat desplegat com un conjunt de conformacions que confluctuen contínuament en el temps, de manera que és un continu moviment de les molècules. Hem d’entendre que és un estat ideal perquè quan introduïm una proteïna natural en dissolució aquosa estarà plegada i per desplegar-la introduirem algun agent com calor, agents cautròpics, però aquesta nova forma es troba molt a prop a l’estat plegat.
 Té una expansió màxima, té de 5 a 10 vegades el volum de l’estat natiu. Ocupa més volum que l’estat natiu perquè està fluctuant constantment i per tant, com que està girant ocupa una esfera més gran que una esfera compacta.
(normalment el millor valor és 10 vegades el volum plegat)  Màxima superfície exposada a solvent  Els grups R hidrofòbics estan exposats a solvent i això no passa mai si no tenim algun agent que ho permeti.
 No hi ha interaccions preferencials entre residus; es pot donar en un moment X una interacció però en un altre no es donarà la mateixa, és a dir, les interaccions no romanen en el temps.
 Podem considerar que existeixen infinites conformacions 4 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 ANÀLISIS DEL PROCÉS DE PLEGAMENT Necessitem unes eines que permetin desplegar o replegar les proteïnes. Podem elaborar dues coses: tenir la proteïna en agent natiu i posar agents que indueixin el desplegament o bé, a partir de l’estat desplegat podem observar com la proteïna arriba a l’estat natiu.
Processos que podem elaborar per desplegar la proteïna:  Temperatura: normalment la proteïna desplegarà perquè el que fem és jugar amb l’entalpia, trenquem els enllaços no covalents que mantenen l’estructura.
 Augmentar o disminuir el pH (normalment es baixa): quan baixem el pH el que fem es generar repulsions electrostàtiques que no haurien d’estar a l’estructura perquè genero càrregues.
 Agents cautròpics (normalment són sals): el tipus que utilitzem depèn del tipus de proteïna  Solvents orgànics: aquests el que fan és invertir la polaritat del medi, normalment la proteïna té un gel o superfície hidrofílica en que poso un solvent orgànic, el que provoca és que el core s’obri i per tant, la proteïna es desplega.
 Detergents (SDS): elabora el mateix que un solvent orgànic.
Mètodes per analitzar el plegament Els diferents mètodes es poden triar en funció de diferent aspectes: disposició del material, temps en que volem mesurar (temps radio, temps lent), si volem mirar estructura secundària, terciària....
5 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Florescència intrínseca Dels aminoàcids els que presenten florescència són el triptòfan i la tirosina, aquests absorbeixen llum en l’espectre visible i alliberen llum en el rang fluorescent (la florescència és més sensible que l’absorbància). Normalment aquests dos aminoàcids es troben dins la proteïna de manera que ens serveixen per saber quin és l’estat: quan la proteïna està plegada trobarem els aminoàcids dins de l’estructura de manera que la florescència serà baixa mentre que quan introduïm agents cautròpics aquests començaran a obrir l’estructura deixant exposats aquestes tirosines i triptòfans de manera que l’emissió de florescència augmentarà.
Observem un exemple de fluorescència de triptòfan i en el gràfic observem dos punts: negres i blancs, que corresponen a experiments diferents relacionats amb l’estat plegat i desplegat:  Punts negres: inicialment la proteïna no té agent desnaturalitzant i per tant està plegada. A mesura que afegim agent desnaturalitzant podem elaborar alicotes amb concentració diferent d’aquest agent, que deixarem incubar (normalment de 2-3 hores) i després el que hem de fer és anar al fluorímentre per mesurar la fluorescència.
 Punts blancs: en aquest cas posem la proteïna en 3M de clorur de guanidini, faig alicotes i ara el que fem és diluir el clorur de guanidini de les mostres, per tant, cada vegada tenim menys agent desnaturalitzat i per tant, el que fem és tornar a plegar la proteïna (aquesta és una reacció molt activa).
En una solució en la qual el 50% de les molècules estan plegades no vol dir que estigui a mig plegar sinó que unes molècules estaran plegades i altres no. La proteïna estarà plegada completament ja que el plegament és cooperatiu. Tot i que hi ha diversos dominis podria passar que tinguéssim un domini plegat i l’altre no tot i que aquests dominis solen tenir interaccions entre ells i per tant també és una mica cooperatiu.
ANS L’ANS és un composts que té afinitat per conjunt de residus hidrofòbics. Normalment aquest és el que es fa servir si no tenim triptòfan o tirosina ja que necessitem saber alguna cosa que ens determini si el core de la proteïna s’està obrint.
L’ANS s’uneix molt a poc a poc a les proteïnes plegades però a mesura que despleguem i el nucli hidrofòbic comença a aparèixer l’ANS s’uneix en aquests clusters i augmenta molt la seva florescència (és un compost de color blau que es pot observar). Aquest compost augmenta molt la florescència sempre hi quan els residus hidrofòbics estiguin a prop a l’espai ja que necessita més o dos residus per unir-se.
Cal tenir present que els residus no han de ser necessàriament aromàtics però si que cal que siguin hidrofòbics. L’ANS només s’uneix a residus hidrofòbics i per tant, no obtindrem el mateix perfil que amb fluorescència ja que no es tracta dels mateixos residus. Aquests perfils ens donen el mateix: temperatura mitjana d’obsert.
6 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 FRET Imaginem que tenim la proteïna en la qual tenim en N-terminal i C-terminal molt a prop quan estan plegades (un exemple d’aquest tipus de proteïnes és el domini SEC3) i si estan desplegades s’allunyen. Podem posar dos clomòfors, un a cada terminal, i il·luminem sempre el de més baixa freqüència (suposem vermell i blau).
Si per exemple il·luminem el blau i aquests dos floròfors estan a prop a l’espai no veurem color blau sinó que veurem una llum verda perquè hi ha una transferència d’energia. Si la proteïna sobre sabem que el blau i el vermell s’allunyen de manera que la transferència no es pot donar i per tant, veurem els dos colors. Això ens diu en general com es perd o com es guanya l’estructura terciària, el global de la proteïna i no hem diu res sobre la secundària (que generalment volem saber).
Dicroïsme circular Aquest mètode ens serveix per saber l’estructura secundària ja que és sensible a la rotació de la llum. Cal tenir present que la llum rota diferent si es troba en α o β.
Normalment no ens dona molta informació de la terciària però si que ens indica com perdem les senyals.
Si la proteïna és petita l’espectre del dicroïsme circular és igual que l’explica’t anteriorment: l’estructura secundària i terciària es perden a la vegada. Si la proteïna és gran no necessàriament hem de perdre les dues estructures a la vegada.
Tal com hem dit anteriorment el dicroïsme circular ens mesura l’estructura terciària però essencialment el que veiem és que quan fem en concentracions creixent de proteïna canvia i això és perquè la llum gira diferent si la proteïna està plegada o no ho està. Per dur a terme l’experimentació hem de seleccionar un punt en que hi hagi canvi: el que fem és saber la intensitat d’aquest punt en funció de la concentració de proteïna i això ens donarà una corba com la florescència.
Gel natiu amb un gradient d’urea Aquest experiment ja no es fa perquè es molt elaboriós, es tracta d’un gel natiu en el qual a la vegada s’ha fet un gradient d’urea. El que hem fet és que a mesura que anàvem posant el gel de poliacrilamida es fa un gradient creixent d’urea.
Tenim un gradient de 0 a 8 i això molts cops costa molt de fer però si surt es definitiu perquè en aquest veig el desplegat realment. Això és una única butxaca en la que carreguem la proteïna i ens ho muntem perquè la diferència de potencial corri a favor meu, si la proteïna està carregada negativament al final de l’electroforesi posem el pol positiu.
Si no hi hagués urea al core la proteïna obtindríem una banda però quan la proteïna es troba amb la urea es desplega, quan corre amb una bola, no ocupa molt espai mentre que quan està desplegada ocupa més espai i per tant és més lenta.
Observem un gel tenyit (amb comassic) i efectivament el plegament és cooperatiu.
7 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Calorimetria diferencial d’escanatge (differential scanning calorimetry) Aquest és un altre mètode de mesurar el desplegament d’una proteïna en que escalfem la mostra però ara no tenim cap sensor (com en altres cassos ho és el triptòfan) sinó que el que mesurem és la capacitat calorífica de la solució.
Tenim sempre dues cubetes: una amb la proteïna i la dissolució i una altra cubeta (cubeta referència) en que només tenim la dissolució de manera que els canvis que observarem seran deguts únicament a la proteïna. Això cal que ho elaborem perquè l’aigua té una gran capacitat calorífica i sinó elaborem aquesta referència mesuraríem únicament aigua.
Quan arriba un punt determinat aquesta proteïna es desplega el que produeix un augment de temperatura per culpa del trencament dels enllaços disulfurs. És important saber que no només estem mesurant l’efecte de trencar els enllaços covalents de la proteïna sinó que comparem les mesures de proteïna i aigua amb els d’una mostra únicament d’aigua; això hem permet veure quin és l’impacte del desplegament de la proteïna sobre l’aigua, és a dir, hem permet mesurar l’efecte hidrofòbic, com afecta a l’aigua l’exposició de residus hidrofòbics que abans no estaven exposats.
Tal com observem en els esquemes anteriors, la capacitat calorífica de la proteïna és proporcional a la superfície apolar que es veu després del plegat, és a dir, la capacitat calorífica és proporcional a la mida del core hidrofòbic: com més gran és el core hidrofòbic, quan la proteïna es desplega més impacte tindrà sobre l’entropia de l’aigua. Per tant, permet mesurar quina és la quantitat de residus apolars que s’exposen a solvent quan la proteïna es desplega (no tenim cap altre tècnica que ho permeti) 8 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 RESUM DELS MÈTODES D’ANÀLISIS DEL PLEGAMENT Mètodes d’anàlisis termodinàmica L’energia lliure de Gibbs (∆Gº) és l’estabilitat termodinàmica de la proteïna; perquè la proteïna sigui estable el valor d’aquest ha de ser negatiu (podem trobar articles en els quals aquest valor sigui introduït en valor absolut). Aquests són mètodes de punt final (que només diuen la diferència entre el punt final i inicial), és a dir, permeten calcular la diferència d’energia lliure entre l’estat natiu (N) i el desnaturalitzat (U). ∆Gº és doncs, l’estabilitat termodinàmica de la proteïna (com més alt és el valor en termes negatius, més estable és la proteïna), entenem que aquest valor, quan la proteïna sigui estable ha de ser molt negatiu.
Mètodes d’anàlisis cinètica Necessitem saber quina és la barrera, hem d’intentar aproximar-la i això s’elabora mesurant velocitats i necessito saber com mesurar aquesta. Quan hem observat els gràfics anteriors i ens marca el punt mitjà cal saber que s’ha aconseguit a una determinada concentració d’agent desnaturalitzant (s’ha aconseguit introduint urea i proteïna), aquest punt no ens diu com de ràpid hem arribat sinó la concentració que necessitem per arribar.
Per saber com s’arriba a l’estat desnaturalitzant necessitem un mètode cinètic que ens permeti monotoritzar la reacció, que ens digui si la reacció és ràpida o lenta. Per elaborar aquesta experimentació necessito una maquinària especial (només hi ha 4 en tota Espanya), cara però molt senzilla. El que observem és una cinètica real (en la imatge és una reacció de desplegament).
El problema de mesurar el plegament en temps real és que té lloc milisegons, és un procés molt ràpid. Quan hem barrejat les dues pipetes (mètode experimental) ja estem a la meitat de la desnaturalització o bé al màxim. Aquest fet provoca que hem de trobar una manera de saber com augmenta el desplegament en temps real de manera que la maquinària ho elabora en pistons molt ràpids.
Sistema de maquinària El que tenim és la dissolució 1 (Urea 8 M) i suposem que fem desplegament. En una dissolució 2 tenim la proteïna en condicions natives. Tenim dues xeringues en les quals òbviament el desnaturalitzant encara no ha tocat la proteïna; el que fem és disparar (és un botó mecànic controlat per ordinador) i hem de saber la concentració final que volem, el que volem posar de cadascuna (parlem de cubetes de 25-50 µl).
9 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Tenim un mixter i una llum per florescència, ja que el que mesurem és com la tirosina, triptòfan, ANS... Això és un tub que quan disparo les dues xeringues entren a la vegada però no entren en un recipient sinó en un tub. En el mateix moment que disparo hi ha una xeringa nova que pressiona en sentit contrari, el que genera un compartiment, que aconsegueix detenir el flux, de manera que la solució té una vida de milisegons. Tenim un flux que hem parat per mesurar: necessitem els pistons i un florímetre que sigui capaç de mesurar en milisegons.
Un cop hem mesurat obtindrem una cobra com la de la imatge anterior i el que hem aconseguit és desplegar la proteïna que estava plegada. El que mesurem és el pendent que està relacionat amb la barrera cinètica: més fort és el pendent més ràpida és la reacció, més baixa és la barrera de l’estat de transició.
PLEGAMENT: CARACTERÍSTIQUES I MODELS Experiment Anfinsen’s És un experiment crucial en l’estudi del desplegament, el que proposa és que el desplegament de les proteïnes i l’estructura final està codificada en la seqüència i per tal de demostrar-ho el que fa és agafar RNAs i la va reduir (té 4 ponts disulfur), va ficar urea i per tant, la va desplegar i més tard va treure la urea i el βmercaptoetanol i va observar que tornava a guanyar l’activitat de la proteïna (no podia veure l’estructura, només mesurava l’activitat) i per tant, s’havia tornat a plegar. Aquest fet li permet afirmar que la seqüència era suficient per plegar la proteïna (guanya el premi Nobel).
Després va elaborar un segon experiment per demostrar el primer: va fer el mateix però va treure el reductor abans de treure la urea de manera que els ponts disulfur s’elaboren a l’atzar ja que no hi ha estructura. Després va treure la urea i va recuperar molt poca funció, d’aquesta forma demostra que feia falta una disposició de l’estructura terciària correcte per formar el plegament i donar funció.
Quan la proteïna es purificava en pàncrees existia el factor plegador, un factor que catalitzava el plegament de les proteïnes, que deia a les proteïnes com plegar-se. El que va fer és purificar la proteïna un 99% per l’experimentació i després la va sintetitzar en condicions reductores i desnaturalitzants (recordem que la síntesi química es produeix al revés que la natural) Hem vist l’experiment clàssic a partir del qual es va demostrar que la seqüència implica un plegament. No hi ha cap dubte en què les proteïnes es pleguen espontàniament. A continuació estudiarem els diferents models de plegament proposats per a les proteïnes.
10 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Models de plegament Es va proposar que les proteïnes un cop les despleguem després es pleguen de manera espontània. Un cop es va proposar aquest paradigma es comença a mirar quin és el mecanisme que explica el plegament proteic. Es van proposar 4 models, entre els quals trobem alguns que són més acceptats que altres.
Model del glòbul fos i col·lapse hidrofòbic El model del glòbul fos (molten globules) és un model molt senzill que proposa que el plegament proteic comença amb la formació d’un nucli hidrofòbic. La formació d’aquest nucli és el que dirigeix el plegament i esdevindrà en un glòbul fos que té una estructura secundària més o menys definida.
Cal tenir present que la estructura del molten globule és molt més esponjosa, és a dir, no és tan compactada com la estructura nativa. A partir del molten globule es defineix l’estructura terciària de la proteïna.
Framework model El framework model proposa el contrari al model anterior. En aquest cas es creu que el primer que té lloc és la formació de l’estructura secundària de la proteïna i que això s’ha de donar el més ràpid possible. Se sap que la formació de les hèlix alfa és el que es dóna més ràpid ja que les interaccions entre les hèlix són locals, en canvi, en les fulles beta les interaccions es donen a distància.
Framework model hipotetitza que sobre l’estructura secundària de la proteïna es va formant la resta. En el cas de la imatge veiem com la beta es diposita sobre les alfa.
Nucleation growth El model de nucleation growth proposa un mecanisme on el primer que es forma no és un element d’estructura secundària complert sinó que és una determinada regió on l’estructura secundària pot ser alfa, beta o un beta turn.
Hi ha una proporció de la proteïna que té tendència a estar en estat natiu, aquest fet permet que aquesta regió es plegui i faciliti el plegament de la proteïna. Com a conseqüència d’això obtenim l’estructura secundària nativa de la proteïna i posteriorment la terciària. Es crea una mena de nucli de plegament a partir del qual es produeixen girs fins trobar l’estructura correcta.
11 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Model trencaclosques El model jigsaw (trencaclosques) proposa que cada molècula de proteïna pot seguir una via diferent de plegament, de manera que no hi ha cap ruta de plegament general.
A la imatge veiem un esquema dels models de plegament explicats anteriorment: Avui en dia se sap que el primer i tercer model dels que hem estudiat són certs, de manera que qui ho va proposar no estava equivocat. Van arribar a conclusions diferents pel que fa al model de plegament de proteïnes perquè van utilitzar proteïnes diferents i aquestes tenien diferents mecanismes de plegament. El més habitual és que el mecanisme sigui una combinació entre el molten globules i nucleation growth, és a dir, que es produeixi la formació d’un nucli hidrofòbic que servirà com a estructura a partir de la qual propagar el plegament. L’últim model està pràcticament descartat, se sap que cada molècula segueix una trajectòria diferent però no segueixen models tan extrems com Framework i jigsaw.
A la imatge veiem una simulació de plegament d’una proteïna. Inicialment la proteïna està poc estructurada. Poden formar-se uns certs nuclis però aquests desapareixeran si no són estables. Seguidament es comencen una sèrie d’intermediaris que són més estables. Cal recordar que en qualsevol reacció ha de passar per un estat de transcició, ja que un plegament és una reacció química molt complexa.
Aquest estat de transacció, és a dir, el màxim energètic s’assembla molt a l’estat natiu.
Aquest fet ho podem observar a la imatge. Veiem que s’assembla molt perquè a l’esquema no es mostra les cadenes laterals ja que el que falta són orientar-les a l’espai. Tot i això en termes topològics són molt semblants.
12 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Característiques del plegament Les proteïnes globulars normalment no són molt estables sinó que són marginalment estables. Veurem que no només la termodinàmica sinó que també la cinètica és crucial pel plegament. Avui dia hi ha màquines per mesurar la cinètica del plegament.
També veurem un exemple de com els glòbuls fosos actuen com a intermediaris de plegament, que de forma genèrica són els directors en moltes proteïnes.
Per una altra banda també veurem l’efecte hidrofòbic en el plegament i que en alguns casos les rutes de plegament no tenen perquè ser úniques, és a dir, poden ser múltiples.
Estabilitat de les proteïnes Entre l’estat desnaturalitzat i el natiu només hi ha entre uns 20-60 KJ/mol, aquesta és una diferència energètica molt petita.
Això és sorprenent ja que l’estat natiu és el termodinàmicament més estable i amb aquesta diferència no és moltíssim més estable. Sabem que, en principi, quan més estable sigui un estat de plegament, més ràpidament arribarem a ell.
El fet que la natura no hagi buscat o evolucionat cap a proteïnes més estables té diverses causes. Per una banda, les proteïnes han de ser flexibles, sobre tot les seves cadenes laterals, per poder interaccionar amb un substrat, lligand... o bé per canviar de conformació. Per una altra banda, les proteïnes no sempre les volem tenir a la cèl·lula, de manera que si la proteïna és molt estable no hi haurà recanvi proteic. HI ha proteïnes que tenen vides mitjanes de minuts i que fan la seva funció i són degradades. Això no ho podríem aconseguir si fossin molt estables perquè per ser degradada és indispensable que estigui desplegada.
A més a més, el desplegament d’algunes proteïnes actua com a marcador d’estrès. Això és molt important ja que la cèl·lula està molt al cas de quines són les seves condicions externes: temperatura, pH, pressió osmòtica,etc. Qui ho detecta són les proteïnes que al ser marginalment estables es despleguen parcialment i són reconegudes per les xaperones que les ajuden a plegar. Aquest fet actuaria com a marcador d’estrès. Hi ha algunes proteïnes que són sensibles a mitja unitat de pH, cal tenir present que es tracta d’una escala logarítmica i per tant que mitja unitat és molt gran.
13 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Contribucions al plegament La energia lliure de Gibbs (ΔG) és el resultat de la diferència de dos grans nombres. Qualsevol d’aquests nombres per sí mateix és superior al valor de ΔG. Així doncs, la estabilitat de les proteïnes depèn de dos factors que contribueixen de forma semblant però en sentits oposats:  La entalpia (ΔH) que fa referència, essencialment, a les interaccions.
 La entropia (ΔS) que juga amb el grau de plegament de la proteïna i és més elevada a l’estat desplegat.
La pèrdua entròpica ha d’estar compensada amb un guany entàlpic. Aquest fet és molt important ja que és el que permet que les proteïnes es pleguin i es despleguin de forma senzilla. A partir de la pèrdua de poques interaccions la proteïna es pot desplegar.
Cal tenir present que les proteïnes quan les escalfem es despleguen perquè la temperatura (T) està multiplicant la entropia i això juga en contra del plegament proteic. Arriba un moment en el qual el terme entròpic no es pot compensar a partir d’interaccions (terme entàlpic).
Pel que fa a les contribucions entròpiques trobem:  La gran diferència de conformacions que s’experimenten a l’estat desplegat, gairebé infinites, respecte la conformació que permet l’estructura nativa, que sol ser 1 tot i que en alguns casos en podem trobar alguna més.
 Les molècules d’aigua estan menys ordenades quan la proteïna està plegada ja que quan està desplegada els residus hidrofòbics estan exposats a solvent i per tant l’aigua crea una capa de solvatació fent que les molècules s’ordenin. Aquest és un efecte entròpic molt important ja que juga a favor del plegament. Cal tenir present que sense aquest efecte no hi hauria plegament.
Pel que fa a les contribucions entàlpiques trobem:  Les contribucions entàlpiques fan referència, principalment, a les interaccions entre les proteïnes. Trobem interaccions febles com ara les interaccions de van der Waals o els ponts d’hidrogen que aporten una gran quantitat d’energia ja que hi ha moltes al llarg de tota la molècula i a més a més actuen de manera cooperativa.
 També trobem interaccions més fortes com és la dels ponts salins.
14 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Termodinàmica del plegament de proteïnes Si ens fixem en l’esquema, podem determinar que ΔG és molt petita si ho comparem amb qualsevol altre factor. Per una banda l’entalpia conformacional es manté en contra del plegament però la suma de les interaccions internes i l’efecte hidrofòbic és major i per tant es produeix el plegament proteic. Els ponts disulfur el que fan és disminuir la diferència entre l’estat plegat i desplegat, és a dir, fan que la entropia conformacional sigui més petita.
Així doncs, tenim només tres maneres de tractar l’estabilitat proteica: 1.
La entropia conformacional es pot modificar, bàsicament, amb la formació de ponts disulfurs 2.
Les interaccions internes es poden fer més fortes a partir del redisseny de les hèlix, fent que els contactes entre i+3 i i+4 siguin més favorables.
3.
L’efecte hidrofòbic es pot augmentar si aconseguim més residus al nucli hidrofòbic de manera que aquest sigui més fort.
Tots aquests models es resumeixen en l’esquema de la dreta: un embut on la molècula comença a plegar i la trajectòria que seguirà serà per les parets de l’embut i serà diferent en cada cas. Essencialment és fàcil d’entendre, si nosaltres representem en l’eix X l’entropia i en l’Y l’energia, podem veure que a mesura que la proteïna comença a plegar la entropia comença a disminuir. Si ens fixem en el molten globule és molt més estret que quan comença a plegar la proteïna però és molt més estret encara en la estructura nativa de la proteïna: és un sol punt.
15 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 En termes energètics, l’estat natiu és el més estable, és a dir, el que té una energia (ΔG) més negativa. Ens fixem que als costats de l’estat natiu hi ha uns pics que s’assemblen molt en energia. De manera que podem passar fàcilment entre aquestes dues conformacions. Això fa que en molts casos el plegament no sigui eficient perquè es qeuda clavat en un punt que és gairebé igual d’estable que l’estat natiu. Les xaperones i les foldases, entre d’altres, són les que ajuden a les proteïnes a acabar de trobar la conformació nativa.
El molten globule no l’hem de veure mai com una conformació única sinó que l’hem de veure com un conjunt de conformacions contactades.
Els factors cinètics són importants al plegament Paradoxa de Levinthal Suposem una proteïna de 100 aminoàcids, de manera que es tracta d’una proteïna petita. Aquesta només pot girar pels angles fi i psi. Cal saber que aquí no considerem que tenim 100 cadenes laterals ja que les cadenes laterals, en principi, poden adoptar diferents conformacions però no podem veure quan giren i per tant no op podem saber quines conformacions poden adoptar les cadenes laterals. Els rotàmers són les orientacions preferents de les cadenes laterals.
També suposem que per cada angle diedre només hi ha 3 possibles conformacions, això és fals ja que cadascun té 180 en un costat i 180 a l’altre.
Aquestes dues infraestimacions ens dóna un nombre de conformacions d’aproximadament: .
Per una altra banda suposem que la velocitat de fluctuació conformacional, és a dir, la velocitat d’aquestes conformacions és la de formació d’un enllaç simple, és a dir: . En aquest cas estem fent una sobreestimació.
Per tant, obtenim que el temps necessari per explorar totes les possibles conformacions és de . Això és impossible ja que aquest és més temps del que l’univers està creat. Se sap que les proteïnes pleguen en milisegons, de manera que la proteïna no pot explorar tots els camins possibles i per tant ha d’haver-hi rutes de plegaments, és a dir, camins preferencials que una proteïna ha d’agafar per tal d’arribar a l’estat natiu.
Fins fa poc temps, aquest era el principal problema pel qual no podem plegar proteïnes in situ ja que en aquest cas es treballava amb la força bruta: es treballaven amb totes les possibles conformacions i es mirava el valor energètic.
Avui dia se sap que, les proteïnes quan es pleguen, si un tros el tenen ben plegat no es desfarà, de manera que únicament es desfarà allò que no correspongui a l’estat natiu. Així doncs, les proteïnes quan troben una interacció correcta no la desfan i per tant, el següent intermediari no haurà d’explorar tot l’espai conformacional, s’haurà d’anar explorant de forma successiva. Tot i això, refinar l’estructura porta molt de temps ja que quan la proteïna s’assembla molt al seu estat natiu, falta acabar de concretar on es troba cada residu.
16 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 La forma nativa d’una proteïna és la més estable des del punt de vista termodinàmic. Cal afegir que és la més estable de les que són cinèticament accessible ja que és possible que existeixi una forma més estable que la del estat natiu.
Suposem que la proteïna va baixant en energia fins arribar a N. Sabem que no arribarà a la conformació “N” ja que per fer-ho ha de saltar una barrera energètica molt gran i que al llarg de la seva vida no la sobrepassarà.
Tenim altres opcions on la barrera energètica es troba just després de l’estat natiu de la proteïna, això el que fa és adormir la proteïna. Per tal d’arribar a l’estat més favorable termodinàmicament s’ha de saltar una barrera energètica molt gran i per fer-ho s’haurien de desfer enllaços, és a dir, desplegar proteïna i això de manera espontània no passarà. Aquesta situació la trobem en el cas de les fibres amiloides o quan tenim ponts disulfur formats incorrectament i la proteïna globular formada és molt compacte i amb molt poca entropia. En menor mesura succeeix quan les prolines estan en cis o en trans i han d’estar en l’altre conformació.
El que ens permet sortir d’aquests “pous” són proteïnes especialitzades que permeten passar barreres cinètiques. Per una banda trobem les xaperones que eviten l’agregació, les proteïna disulfur isomerases que ens permeten formar els punts disulfur correctament i les prolinisomerases que ens permet tenir la prolina en la forma correcta. Totes aquestes proteïnes que ens ajuden a saltar barreres energètiques han de desplegar la proteïna. Cal tenir present que aquestes molècules que ajuden no dirigeixen el plegament sinó que donen una altra oportunitat.
PREGUNTA TIPUS EXAMEN: L’estat funcional de les proteïnes és el termodinàmicament més estable? Fals.
Trobem molècules i assemblatges molt més estables que l’estat natiu. Un exemple són les fibres amiloides que són moltíssim més estables. Se sap que passar de natiu a amiloide és possible però al reves és impossible.
Els glòbuls fosos són intermediaris del plegament.
El glòbul fos és el típic intermediari de plegament i el trobem en proteïnes que comencen a tenir una mida gran. Les proteïnes petites solen plegar en dos estats, això ho veurem més endavant. En canvi, les proteïnes més grans han de poblar uns intermediaris: molten globule.
El glòbul fos és un intermediari de plegament que es forma tan ràpid que fins i tot a les màquines no es pot veure la formació. El molten globule ens dóna informació sobre l’estructura secundària, encra que pot ser que la hèlix no estigui complerta o bé que la beta no tingui totes les cadenes que ha de tenir. Però majoritàriament té tota la estructura secundària.
Alguns empaquetaments entre les cadnes laterals tot i que són menys compactes que a l’estat natiu. És molt important que les cadenes hidrofòbiques encara no estiguin empaquetades completament. Sabem que a l’estructura nativa formaven una mena de cristall. Així doncs, com que l’estructura secundària encara no està definida i els loops i el core encara “ballen”.
17 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Cal tenir present que el molten globule no és una única conformació. El primer col·lapse que es produeix ens dona la primera estructura a partir de la qual hem de formar la nostra proteïna amb la seva estructura nativa. Per passar del molten globule a l’estat de transició hi ha una barrera energètica molt alta de manera que comporta un temps, el suficient com per monotoritzar el procés.
El molten globule és més estable que l’estat desplegat però no gaire més i per això es coneix com a mínim local d’energia. Se sol intentar aconseguir mínims locals a partir dels quals començar a simular.
Hi ha alguns casos en els quals es pot aconseguir visualitzar l’estructura tridimensional d’un molten globule. Això es pot fer perquè hi ha condicions en les que es pot estabilitzar aquesta estructura, normalment amb el pH, fent que no progressi cap a l’estat natiu. A l’estat natiu veiem un esquema del citocrom b56 on el molten globule s’assembla molt a l’estructura nativa tot i que una hèlix no està del tot formada.
Interiorització de les cadenes laterals El tret de sortida del plegament ve donat en la majoria dels casos per la interacció de formacions hidrofòbiques, normalment es forma el nucli primer. Això és degut que els enllaços d’hidrogen són més estables dins de la molècula que fora.
La formació del core hidrofòbic és el que dóna l’impuls cinètic del plegament tot i que després es produeixi la formació d’estructura secundària. Els residus hidrofòbics tenen tendència a situar-se al llarg de tota la seqüència i això es així perquè quan compactem, tanquem la molècula amb un nucli hidrofòbic.
A la imatge veiem un domini Sec3 que és molt petit, de 62 aminoàcids i un core molt gran de 9 residus. El core hidrofòbic és tan important que és la regió més conservada d’una proteïna excepte el seu lloc funcional. S’ha aconseguit dissenyar nuclis hidrofòbics mirant quins són els residus més conservats en una família de proteïnes per a una determinada funció.
Dissenyar nuclis hidrofòbics és molt difícil ja que estan empaquetats a màxima densitat, motiu pel qual estan tan conservats. Així doncs, si canviem un residu gran per un petit queda un forat per on pot entrar l’aigua. Al revés tampoc es podria fer ja que hi hauria impediment estèric i la proteïna s’obriria.
18 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 De manera que, perquè es produeixin canvis en el core han d’existir mutacions compensatives. Com que el core és molt important per la estabilitat i les mutacions es formen de manera molt esporàdica, serà molt difícil que es produeixin dues mutacions compensatòries.
Es van preguntar si es podien redissenyar nuclis hidrofòbics per a aquesta proteïna, tan estables com els originals però que no fossin iguals. Cal tenir present que això no es pot fer mutació a mutació, sinó que s’havien de simular tots els nuclis hidrofòbics suposant 6 tipus de residus hidrofòbics. Això només es pot fer amb un ordinador, on es generen un alt nombre d’estructures per després avaluar l’estabilitat de cadascuna d’elles des del punt de vista computacional. Van agafar les TOP10 entre les quals es trobava el wild type. Aquestes 10 seqüències no s’assemblaven entre elles ja que són combinacions noves, no podem mantenir el nucli amb una alta similitud i només fer 1 o 2 canvis.
Les rutes poden ser úniques o múltiples Avui dia se sap que les rutes de plegament poden ser úniques o múltiples. Quan fem referència a rutes múltiples vol dir que són molt diferents. Hi ha proteïnes com la barnasa, que es tracta d’una RNAasa, que la posis en la solució que la posis sempre segueix el mateix camí de plegament. Mentre que altres proteïnes en funció de les condicions segueixen una ruta o una altra, un exemple és el lisozim (una proteïna més complexa).
Canviar una via de plegament d’una proteïna única és una tasca no aconseguida. Si aconsegueixes això el que estàs fent és canviar el codi de plegament sense canviar la seqüència. El fet que no podem veure els intermediaris dificulta que podem entendre el plegament.
La “nova” versió del plegament (K. Dill) Aquesta versió del plegament ens mostra que una molècula pot plegar directament, una altra que quedi atrapada en un determinat punt, una altra en un altre punt, etc. Es veu que a mesura que s’apropa a l’estat energètic de la conformació nativa, l’amplada de possibilitats és més petita.
19 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Anàlisi del valor fi.
L’ANÀLISI DEL VALOR FI ENTRARÀ A EXAMEN SEGUR!!! Recordem que no podem veure un estat de transició. Per tal de poden entendre el plegament ens seria molt útil saber què és el que està format a l’estat de transició ja que tindríem una imatge estructural de la via de plegament.
Un investigador es va inventar un mètode anomenat anàlisi del valor de fi que és un mètode de l’enginyeria de proteïnes i ajuda a entendre el plegament. La idea és que a partir d’anàlisis cinètics del plegament hem d’aconseguir esbrinar si una interacció està formada o no a l’estat de transició. Cal tenir present que no podem saber la estructura però sí podem saber si una determinada cadena lateral està ja en una posició nativa o no.
Per fer-ho el que es fa és agafar una proteïna determinada (X) i aproximadament cada 2-3 residus, en funció de la grandària de la proteïna, es fa un mutant on canviem la cadena lateral que sigui per alanina. Normalment acabem tenint uns 40 mutants. Amb aquest mètode no mutem ni glicines ni alanines. Imaginem que la proteïna és tota hèlix alfa, que té 3 hèlix, començarem amb el residu 3 mutat, després amb el 5 i així successivament. El fet que el canvi es produeixi per alanina és degut que és l’aminoàcid amb la mínima cadena lateral i que no ens distorsiona la conformació de la proteïna. A això s’anomena sheeting o bé tallar ja que és com si talléssim la cadena lateral del primer carboni.
A l’estat desplegat, D, el mutant i el salvatge (wild type,WT) seran iguals. A l’estat desplegat hem tret una interacció de manera que, molt probablement el mutant serà menys estable que el WT. Quan més important sigui aquesta interacció menys inestable serà, fins al punt que si el canvi produït és molt important no es podrà examinar. A l’esquema veiem representat en blau el wild type i en vermell el mutant.
Per tal de fer aquest anàlisi hem de mirar quins canvis energètics es produeixen a l’estat de transició. El valor dels canvis energètics sí que els podem obtenir, el que no podem veure és l’estructura. Tenim diverses opcions respecte el valor energètic de l’estat de transició del mutant i del WT, cal tenir present que com només hem tret una interacció el que obtindrem serà degut a aquell aminoàcid:  Si l’estat de transició és igual d’estable que el natiu vol dir que aquesta part que hem canviat no està formada a l’estat de transició i per tant dóna el mateix si la canviem o no.
 Si l’estat de transició del mutant és energeticament superior al natiu, és a dir, és menys estable vol dir que hem desfet una part que ja estava formada.
 Cal tenir present que l’estat de transició del mutant mai no serà més estable que el salvatge ja que estem traient una interacció 20 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 A partir de la següent fórmula podem calcular el valor de fi que ens permet mesurar com impacta el canvi a l’estructura de l’estat natiu en relació a com impacta el canvi a l’estructura de l’estat de transició.
Aleshores podem dir que si no hi ha efecte, és a dir, que els dos estats de transició tenen la mateixa energia, el valor fi és igual a 0. En canvi, si tenen energies diferents i l’estructura estava completament formada valdrà 1. El valor fi pot prendre valors entre 0 i 1, sent 0 quan no està en absolut format i 1 quan està tan formada que al desfer la interacció disminueix l’estabilitat de l’estat de transició. Cal tenir present que a nivell experimental trobem valors que es troben entre mig.
L’estudi del valor fi ens permet a partir de l’estructura nativa, que hem de tenir per fer-ho, saber que està format i que no a l’estat de transició. Podem fer esquemes on els colors freds s’apropen a una Φ=0 i els colors càlids s’apropen a una Φ=1, és a dir, fem una escala arbitrària.
Amb això el que estem obtenint és una estructura estàtica de com plega la proteïna. En el cas esquerra podem arribar a la conclusió que el beta hairpin es forma abans que es formi res, de manera que es pensava que es produïa el contrari, és a dir, primer la formació de les alfa que de les beta. Cal tenir present que això no vol dir que la alfa groga no estigui formada, només que no està contactada on ha de ser-hi. En el cas de la dreta veiem que primer es forma una triple cadena beta i l’últim que sorprenentment l’últim que s’incorpora és la hèlix alfa.
Per tant, estem fent anàlisis cinètics i termodinàmics simultanis però estem obtenint dades estructurals. Podem veure com la proteïna s’està plegant en el temps.
Per fer obtenir el valor fi hem de fer una sèrie de mesures cinètiques en cada mutant, i per tant el que hem de fer és mesurar velocitats a partir d’un scop flood. Així doncs, per mesurar les energies d’activació ho fem a partir de velocitats, és a dir, necessitem saber si ha canviat o no l’energia d’activació i per tant si ha canviat o no la velocitat del plegament. A la imatge, cada punt representa un càlcul d’una barrera cinètica. Amb això obtenim un chevron plot que ens dóna informació sobre dues coses.
21 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Per una banda nosaltres volem saber quina és la velocitat de plegament i desplegament en aigua (condicions fisiològiques), el que fem és plegar la proteïna en diferents concentracions d’urea o de clorur de guanidini i per cadascuna d’elles calculem la velocitat. Ho fem en un medi amb urea o guanidini perquè si la proteïna està en aigua no desplegarà o plegarà per si sola.
El que fem és mirar com plega o desplega la proteïna a diferents concentracions d’urea i elaborem un chevron plot. Això ens permet calcular quina és la velocitat de plegament o desplegament en aigua a partir dels diferents mutants ja que les interaccions importants quan són eliminades, baixaran la velocitat de plegament. Aquestes velocitats estan relacionades amb les distàncies entre ΔGN-D.
A partir dels càlculs de les diferents velocitats obtenim un plot que té dues branques i el punt on es tallen fa referència a la velocitat de plegament de la proteïna en aigua. La velocitat de desplegament serà més lenta que la de plegament ja que sinó hauria més preferència a estar en l’estat desplegat que en el plegat. Si tenen velocitats de plegament i desplegament semblants, la proteïna serà menys estable que si la velocitat de plegament fos molt més petita.
ESTUDI DEL PLEGAMENT EN PROTEÏNES AMB DISULFURS Hem dit que els intermediaris habitualment no els podem veure de manera que ens inventem un mètode indirecte per intentar saber com són. Les proteïnes que tenen disulfur són una excepció ja que a l’estat desplegat i reduït tenen les cisteïnes lliures. Així doncs, la formació de disulfurs no es dóna a pH àcid, és necessari que estigui per sobre de 6,5, ja que sinó trobem els sulfhídrics formats. Hi ha una forma per tal de saber quins són els ponts d’hidrogen que estan formats i els que no.
Estudi de la proteïna BPTI BPTI va ser la primera amb la qual es va descobrir una via complerta de plegament amb els seus intermediaris. Es va seguir un procés per tal d’aconseguir-ho que consisteix en: 1.
Primer de tot reduir completament la proteïna. Amb això aconseguim que els ponts disulfurs es trenquin i que la proteïna es desplegui.
2.
Un cop hem fet això la deixem replegar en condicions en les quals els disulfurs es formin molt lentament. Fent això aconseguim arribar a la forma nativa però de forma molt lenta. Aquest procediment se sol fer a un pH d’aproximadament 8 i a cada minut acidifiquem el medi, és a dir, anem parant la reacció de formació dels disulfurs al llarg de temps.
22 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Com que la formació dels disulfurs ens dóna informació sobre quina part està estructurada i quina no, ens permet saber quin és l’ordre de plegament de la proteïna. Recordem que els disulfurs es formen un cop la estructura secundària de la proteïna està formada.
El model de plegament del BPTI segueix una via molt complexa. Cap dels tres intermediaris inicials que obtenim amb la formació dels disulfurs és la forma nativa, encara s’han de modificar. A la imatge, entre claudàtors trobem quins són els ponts disulfurs que es formen. Hi ha alguns ponts disulfurs que es formen que no són natius.
Estudiar el plegament de proteïnes que tenen disulfurs amb aquest mètode és més adient ja que és més potent que els que havíem vist.
Caracterització estructural de intermediaris de plegament: LCI Es va fer un experiment, entre els investigadors trobem Ventura, S. On treballaven amb LCI que es tracta d’una proteïna petita que conté 4 ponts disulfur.
Les condicions que van fer servir de plegament va fer que la proteïna trigues unes 48 hores mentre que dins la cèl·lula es produeix de manera molt més ràpida. Això és degut que en l’experiment no tenim protein disulfur isomerasa (PDI), per tant, els disulfurs que es formen de forma anòmala queden atrapats i es desfan molt més lentament. Així doncs, estaven representant el mateix que passava a la cèl·lula però en una escala de temps molt més gran. Si nosaltres afegim PDI la reacció s’accelera molt però els intermediaris són els mateixos. Recordem que les foldases són catalitzadors del plegament però no canvien les lleis de plegament.
L’experiment consisteix en fer una columna com la de separació d’aminoàcids però en aquest cas no hi ha càrrega.
Recordem que és una matriu en la qual con més hidrofòbica és la proteïna, més s’enganxa. Així doncs, si la proteïna està desplegada és més hidrofòbica que si està plegada. Sabem que tot i tractar-se de la mateixa proteïna, serà més o menys hidrofòbica en funció dels residus hidrofòbics que tingui exposats a solvent 23 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 A la imatge, cada pic fa referència a una combinació diferent de ponts disulfur que és molt complexa. Sigui complexa o no, el que passa sempre en aquesta proteïna és que tenim dues formes, en 24 h i 8h, que es formen i es mantenen en el temps. Això és degut que és un intermediari metaestable, és a dir, està en un mínim energètic.
Fins ara el que podem fer és agafar el pic, assignar els disulfurs i saber quins d’ells estan formats. També podem produir proteïna suficient com per purificar el pic i resoldre l’estructura tridimensional.
Ells el que van fer és purificar el tercer pic que trobem a les 8 hores, està marcat amb un requadre vermell. Aquest és un procés molt laboriós. Ho van poder fer perquè l’intermediari s’acumulava en el temps de manera que es podia aïllar, aquest provenia directament de la via de plegament.
L’intermediari i la proteïna nativa són pràcticament iguals. Es va veure que si l’intermediari es posava en front de la proteasa per a la proteïna nativa funcionava de la mateixa manera. El fet que s’assemblés molt a la proteïna nativa explicava perquè s’acumulava.
La estructura que observem és de RMN i és un promig obtingut de la resolució d’unes 20 conformacions possibles. A la imatge podem veure la cadena principal. En el cas de l’intermediari hi ha molta més fluctuació conformacional, en aquest cas l’entropia és major ja que no ha baixat fins al punt energètic possible mínim.
Una de les preguntes que es van fer és perquè la natura ha seleccionat una proteïna amb 4 ponts disulfur si amb 3 ja es pot plegar fins i tot més ràpidament i pot continuar fent la seva funció. La LCI és una proteïna alliberada a la sang on hi ha una elevada quantitat de proteases, de manera que s’ha de crear una estructura molt estable i compacta perquè les proteases de la sang no la degradin. Si la LCI està fluctuant constantment estarà més exposada a les proteases i per això fa falta el quart pond disulfur ja que permet que l’estructura estigui més compactada.
24 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Van intentar purificar un altre intermediari però com que per fer RMN la proteïna cal que estigués pura i només tenien un intermediari no ho van aconseguir. Els disulfurs ens donen un avantatge i és que l’intermediari que ara volien purificar no el podien purificar amb homogeneïtat però sí que podem saber quins ponts disulfur estan formats i quins no. Es va analitzar la proteïna i es va veure que el pont disulfur entre 19 i 43 no estava format, aquest és el pont que uneix la alfa i la beta. El que van fer és un anàleg d’intermediari, en el qual es van canviar aquestes dues cisteïnes per alanines i obtindrem una proteïna que simularà com és l’intermediari, únicament li faltarà el pont disulfur que no estava format. Això ja es fàcil de purificar ja que tenim una sola espècie, es pot produir de manera recombinant, purifificar-la i a partir d’això obtenir l’estructura cristal·lina. Tornem a veure com aquest intermediari és pràcticament igual a la forma nativa.
Així doncs van aconseguir purificar i resoldre l’estructura tridimensional de tots el intermediaris de la via. Aquestes són proteïnes altament flexibles degut als ponts disulfur.
La RMN ens permet veure contactes i amb això van determinar que existia una xarxa de contactes entre tres parts de la proteïna: beta 2, beta 1 i beta 3. Aquesta estructura és important perquè podem veure quins són els primers contactes que s’estan formant amb el plegament, podem veure el nucli del plegament. Es tracta una cosa semblant a l’anàlisi de fi però en aquest cas ho podem veure. Com que van poder parar la reacció van poder veure els intermediaris de la reacció.
25 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 PLEGAMENT INCORRECTE DE LES PROTEÏNES Fins ara hem vist que les proteïnes neixen desestructurades i formen intermediaris, alguns ràpids i altres lents però que tots donen una forma única ben plegada i que és la proteïna funcional.
A l’esquema, la part blava fa referència a aminoàcids polars i la vermella a aminoàcids hidrofòbics, cal tenir present que això no és totalment cert ja que no estan seguits en seqüència. Per arribar a l’estat natiu necessitem passar per un intermediari que té estructura preformada. En la conformació nativa el nucli hidrofòbic està amagat i rodejat per residus polars, però en canvi, en l’intermediari el nucli no està format del tot, està fluctuant i exposat a solvent.
Si tenim residus hidrofòbics exposats a solvent i estan en dissolució s’autoensamblen i poden produir agregats. Això sol passar si tenim un intermediari que no és natiu que es pot produir en condicions d’estrès, falta d’oxigen ,etc. Els intermediaris no natius agreguen amb els intermediaris productius i aquests agregats ja no són funcionals. Quan la proteïna no plega bé, normalment, agrega.
Malalties conformacionals El mal plegament proteic dóna lloc a malalties conformacionals que de forma genèrica podem dir que són aquelles malalties que s’originen pel mal plegament de proteïnes. Qualsevol malaltia que es produeixi per missofolding dóna lloc a aquest tipus de malalties. En molts casos es produeixen perquè la proteïna mal plegada agrega però, aquesta no és sempre la causa.
Amiloïdosis Quan la proteïna agrega, parlem d’un tipus especia de malalties conformacional que són les amiloïdosis. Es tracta d’un grup heterogeni de malalties humanes, és a dir, que no tenen una causa comuna. El seu origen pot ser degut a proteïnes totalment diferents que no estan relacionats ni en seqüència ni en estructura.
La gran majoria de vegades, el problema és que la proteïna que abans era soluble, ara agrega. La agregació pot donar-se en diferents teixits:  Amiloïdosis sistèmica quan els agregats es formen en diferents teixits.
 Amiloïdosis localitzades quan els agregats es formen en el mateix teixit. Les amiloïdosis localitzades més conegudes són les neurodegeneratives.
26 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Exemples d’agregats proteics: En aquests casos passa el mateix: una proteïna que originariament hauria de ser soluble, deixa de ser-ho i agrega. Forma un agregat que pot ser de diferents tipus. En el cas de l’Alzheimer és extracel·lular, en les plaques priòniques és intracel·lular i en la malaltia de Huntington i Parkinson entra dins del nucli. De manera que, pot agregar en diferents parts dels teixits però el resultat sempre és el mateix ja que l’agregació és tòxica.
Aquestes malalties tenen més frequencia a mesura que ens anem fent gran. Cal present que aquestes proteïnes no són mutades de manera induïda sinó que són naturals. Les xaperones són les que eviten el mal plegament i quan som grans tenim menys energia per fer-les funcionar i que es pleguin bé. Tant les xaperones com les proteïnes que s’encarreguen de desfer els agregats i plegar proteïna tenen un rendiment energètic menor. Aquest és el principal motiu.
Els problemes d’aquestes malalties són molt severs. Podem veure al PET, que mesura l’activitat cerebral, l’escàner d’un cervell normal i un amb Alzheimer quin és el consum de glucosa que tenen.
Hi ha malalties transmissibles com ara la de les vaques boges.
Per què es produeix l’agregació? L’agregació es produeix perquè les proteïnes no pleguen correctament. A la imatge veiem el panel de plegament on hi ha intermediaris, estats parcialment plegats que són molt semblants a l’estat natiu. En certes condicions pot passar que la via de plegament ni tan sols passi pels intermediaris i se’n vagi o bé que passi però que també se’n vagi cap a la part fosca de l’esquema.
27 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Al costat clar es donen interaccions intramoleculars, és a dir, dins de la mateixa molècula i al costat fosc es donen interaccions intermoleculars, és a dir, entre diferents molècules. En el costat fosc una proteïna interacciona amb una altra per donar uns agregats que poden ser molt ordenats com les fibres amiloides o amb formes amorfes. Qualsevol d’aquest tipus d’agregat és molt més estable energèticament que l’estat natiu. Per tant, són més difícils de desfer. Les xaperones no solen ser capaces de desfer-los. De manera que aquests agregats s’acumulen i donen lloc a diferents malalties.
Les proteïnes no es poden veure al microscopi electrònic però les fibres amiloides causants de Parkinson o Alzheimer sí que es poden veure. Aquestes estructures s’autoensamblen en estructures fibril·lars molt ordenades (macromoleculars), de manera que con més proteïnes hi hagin ensamblades més estable és la fibra, la reacció es retroalimenta. Poden tenir essencialment dos tipus d’estructures: una estructura que fa com una mena d’hèlix (esquerra) o bé una estructura on s’associen lateralment (dreta). Les dues estructures són igual d’estables. Aquestes estructures són de les més estables que es coneixen.
ESTRUCTURA DE FIBRA AMILOIDE Fins fa molt poc, només podíem imaginar com era una fibra amiloide. Podíem suposar que eren fulles beta ja que és la forma de formar un contacte intermolecular perfecte. Això servia perquè teníem mesures d’estructura secundària i sabíem que la proteïna quan canviava era una beta. No se sabia gairé més perquè aquestes estructures fibril·lars són massa grans per resoldre una estructura tridimensional. No es pot fer RMN perquè ha d’estar en solució i aquestes proteïnes precipiten.
Per una altra banda, tampoc es podia fer servir cristal·lografia de rajos X ja que es necessita una proteina molt definida i no la teníem.
Es va utilitzar la tècnica Solid State NMR (ressonància magnètica nuclear en estat sòlid) que és una tècnica molt nova per veure proteïnes però que és molt antiga en materials ja que és el que feien servir per mirar estructura de materials. Se’ls va ocorrer utilitzar tècniques per observar materials, per observar fibres amiloides. Amb això es va aconseguir per primera vegada visualitzar l’estructura tridimensional d’un amiloide.
28 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Abeta42 La Abeta42 és el pèptid causant d’Alzheimer. Té 42 residus i on les fulles beta s’estenen de forma gairebé inifinta. Trobem diversos beta hairpins i podem veure com va girant lleugerament. Aquesta estructura és molt estable i té una similitud a la beta hèlix. Aquesta estructura no està dissenyada sinó que és una anòmalia. Però des del punt de vista d’estructura terciària és una proteïna més.
A la imatge no podem veure les cadenes laterals ja que l’únic que es va poder resoldre va ser l’esquelet carbonat.
Estructura de HET prion HET es tracta d’un prió de fong. La diferència entre un amiloide i un prió és que el prió és un plegament amiloide transmissible. En aquest organisme (fong) la seva funció és matar a les cèl·lules que no tenen el mateix genotip. Així doncs, les cèl·lules que no estan en el mateix estat priònic moriran.
Aquesta és l’única estructura de prió que ha estat resolta (2008). La seva estructura ens recorda a una beta hèlix però aquestes van ser descobertes molt abans. La diferència entre elles és que en les beta hèlix els colors que observem en la figura corresponen a una única cadena polipeptidasa, en canvi, en el prió, cada color fa referència a una cadena polipeptídica diferent.
Aquesta és una proteïna que està en estat desplegat però quan passa a l’estat priònic adopta aquesta estructura priònica.
Observem en la imatge c les cadenes laterals que ha estat resolta per RMN. La estructura poc flexible que trobem fa referència al coil hidrofòbic de la proteïna (part més densa). Aquesta proteïna és un amiloide funcional on té un coil hidrofòbic com els altres i els residus polars cap a fora. Això demostra que les lleis que regeixen la formació de proteïnes també poden dirigir el coil hidrofòbic.
29 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Formació de les fibres amiloides Les fibres amiloides es poden formar de moltes maneres i seguint diferents teories. Per a nosaltres el que passa és que una estructura monomèrica, pel motiu que sigui (la cèl·lula s’estressa, hi ha una mutació... )es forma un molten globule.
Aquest molten globule té un coil hidrofòbic no empaquetat totalment i això fa que els cores hidrofòbics puguin autoensamblarse. La estructura nativa de la proteïna la protegia d’aquest assemblatge. El fet que es produeixi l’agregació pot donar lloc a petits oligòmers qeu són poc estables i per tant pot tornar cap enrere (cap a molten globule i a la forma nativa) mitjançant xaperones.
En el moment que es formen els seeds el procés ja és poc reversible i acabarà donant fàcilment fibres amiloides. Els seeds són estructures amiloides amb cadenes molt unides que s’enrotllen entre elles per formar agregats.
La estructura de la proteïna un cop ha format les fibres amiloides pot ser tot alfa, tot beta, etc. O bé que sigui desordenada.
A la imatge veiem una estructura tot alfa en ratolí. Quan passa a la seva forma priònica trobem algunes betes. Així doncs, algunes de les alfa es desestructuren i formen contactes intermoleculars en comptes de mantenir els contactes intramoleculars, necessaris per formar alfa.
A més a més, en aquest cas la proteïna és infectiva, és a dir, si agafem l’agregat i l’introduim en el cervell d’una persona el que podem fer és que aquest agregat propagui la seva conformació de manera que, la proteïna que és alfa passarà a ser beta. Hi ha un canvi conformacional que és propagable.
30 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 En aquesta imatge veiem el cervell d’una persona amb una malaltia priònica. El que està de color blanc vol dir que no hi ha neurones, en condicions normals hauria de ser tot rosa. Aquesta malaltia és coneguda com encefalopatia espongiforme ja que el cervell queda com una mena d’esponja.
Com s’ha pogut demostrar que la proteïna és la responsable de la transcripció? Existeix una tècnica que s’anomena PCR de prions. Aquesta experimentació es prova amb ratolins transgènics que tenen el gen humà i que desenvolupen la malaltia (fenotip del prió) molt rarament però, si els hi injectem amb extracte de cervell humà, una major quanitat de ratolins esdevenen malalts ja que la proteïna acaba agregant.
Abans no se sabia que era la proteïna la causant d’això i per aquest motiu se li anomenava factor X.
Es va fer un experiment per intentar purificar el factor X. S’agafava un prió purificat produït en bacteris, que no fos infecciós. Per tant, amb la proteïna sola es veu que no és suficient per generar la infecció (PrPc). Aleshores van afegir una petita quantitat de proteïna en estat priònic estreta de cervell. Aquesta estructura quan contacta amb la proteïna soluble la converteix en forma agregada ja que va propagant la seva conformació. Això genera unes fibres que es poden trencar amb sonificacions, és a dir, amb un tub. Ho trenquen en diferents fragments que depenent per on es trenquin tindrem més quantitat de prió de cervell o menys. Això es posa en contacte amb la proteïna purificada d’un bacteri i obtenim que s’autopropaga. Això es torna a repetir més vegades.
Així doncs, aconseguim fer una dilució seriada de la proteïna original de cervell.
Sabem que això ho podem fer tantes vegades com vulguem fins que arribarà un moment en què no tindrem en cap extracte de cervell. De manera que, si injectem això al ratolí sí que serà infecciós i per tant, sabem que la proteïna convertida per l’extracte de cervell segueix sent infectiu.
La formació d’amiloides tòxics és una propietat rara de les proteïnes? Hi ha 4 malalties associades a la formació d’amiloides que impliquen 4 proteïnes diferents i que no tenen relació en seqüència. La formació d’amiloides és pràcticament una propietat genèrica de les cadenes polipeptídiques. Molts grups de recerca han aconseguit formar fibres amiloides tant amb les que formen malalties, com amb proteïnes com ptt que no té res a veure amb cap malaltia.
Aquesta capacitat sembla una capacitat comuna en moltes proteïnes i això és un problema ja que a la cèl·lula les proteïnes estan lluitant entre un estat funcional i un estat tòxic. Per tant, moltes de les malalties en què no hi ha cap genotip associat segurament seran causades per fibres amiloides.
31 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 TRANSICIÓ AMILOIDE EN UNA PROTEÏNA AMB PLEGAMENT BARRIL BETA Fins el moment no s’havia demostrat qeu el barril beta pogués formar fibres amiloides ja que es tracta d’una estructura molt estable. Es va introduir la alfa quimiotripsina (barril beta) en presència de TFE que és un solvent que indueix la formació d’hèlix alfa. Amb això el que s’aconsegueix és que la proteïna sigui menys estable i en conseqüència agrega. Cal tenir present que el fet que la proteïna agregui no vol dir que sigui un amiloide.
Es va analitzar quina era la estructura dels agregats que es formaven i es va veure per microscopia o raigs X que el que formava eren fibres amiloides. Aquest és l’únic fold beta que està demostrat que forma amiloides. Se pensava que la presència d’una beta preformada era indispensable per la formació de l’amiloide.
El que van fer és agafar mioglobina o citocrom C que són estructures tot alfa i es va veure si eren capaces de formar fibres amiloides. Van arribar a la conclusió que no fa falta tenir cap beta preformada per tal de formar fibres amiloides.
De manera que, pots agafar una proteïna amb estructura tot alfa, escalfar-la de manera que perdi la seva estabilitat i la 32 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 seva tendència per formar agregats augmenti. Si forma fibres amiloides es pot tenyir amb thioflavin –T que permet veureles (aquesta tinció s’utilitzar per realitzar biopsies). Es va veure que el citocrom C no genera amiloides in vivo.
També es pot fer servir espectrometria d’infraroig que ens permet veure l’estructura secundària, tant en l’estat soluble com en l’agregat. Si el que fem és un espectre de diferència entre com enra la proteïna abans i després (una resta) allò que s’hagi creat apareixerà com un pic positiu i el que s’hagi desfet com un pic negatiu. Veiem que la beta apareix com un pic positiu.
La existència de hot spots d’agregació A la imatge veiem dos dominis SH3 que tenen una propietat molt diferent i és que quan els posem a pH baix (aproximadament de 4), PI3 forma fibres molt definides però l’espectrina no les forma tot i estar en les mateixes condicions. Posteriorment van veure que afegint sal a l’espectrina s’aconseguia que formés fibres. En aquestes condicions un té molta tendència a agregar.
33 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Tenim dos dominis que són estructuralment i seqüencialment molt semblants i el que van fer és comparar seqüències. Van veure on hi havia diferències i si aquestes diferències en seqüència serien capaces o no d’explicar les diferències en el plegament. Van trobar una regió de 8 residus que era marcadament diferent en caràcter. Aquesta regió tenia una cosa molt peculiar i és que tenia dues lisines que estan molt conservades en tota la família excepte en la PI3 on hi ha una histidina (que també seria una carga conservada) i una leucina que està exposada a solvent.
El que van fer és agafar els pèptids i introduir-los en les mateixes condicions que estava abans. Aquest donava imatge de microscòpia electrònica completament idèntiques a les de la proteïna completa de manera que no es podien distingir unes de les altres. El fragment corresponent a la proteïna que no agregava, hi ha la hipòtesi que una regió molt curta és capaç de respondre al comportament amiloide. La idea era demostrar que això passa a les proteïnes. Per fer-ho van realitzar dos experiments.
Abolint la capacitat amiloide de PI3 – SH3 Van canviar alguns residus que formaven part del nucli d’agregació i amb això van aconseguir que PI3 que formava fibres deixés de formar-les.
Promovent la capacitat amiloide de SPC – SH3 La prova definitiva que regions curtes són les responsables de la formació de fibres va ser aquesta. Aconseguir que una proteïna que no havia estat amiloigènica, si li treiem 8 residus naturals i li afegim 8 residus de la proteïna amilogènica és suficient perquè una proteïna soluble formi fibres.
De manera inequívoca, basten regions molt curtes per iniciar l’agregació.
34 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 La predicció de “hot spots” d’agregació en proteïnes implicades en malalties conformacionals Per tal de trobar dianes terapèutiques no podem fer experiments. S’ha de fer un algoritme que ens permeti identificar aquestes seqüències dianes.
Per tal de fer aquesta experimentació es va assumir que no tota la seqüència és igual de rellevant, a aquestes zones se li anomena hot spots o HPR. Per una altra banda, la propensitat a agregar des d’un estat desplegat segueix una via comú.
Si estudiàvem una regió amiloide (nucli amiloide curt) i traiem la informació de com els residus influenciaven en la seva agregació, això ho podíem fer servir per predir qualsevol regió amiloide. Aquesta era la hipòtesi.
La diana per realitzar els experiments va ser la Abeta42, el pèptid de l’Alzheimer. Té 3 regions d’agregació que no s’havien definit com a tal. Veiem a la imatge el CHC (centre hidrofobic core) al C-terminal. El que van fer és agafar aquesta proteïna i al CHC sabien que el residu en posició 19 és molt important ja que està en el centre d’agregació.
El que van fer és generar 20 variants de Abeta42 i per tant, el residu que és Phe el van canviar pels 20 aminoàcids naturals i van veure quina era la tendència d’agregar.
Això es va fer en un ambient in vivo on la Abeta42 es va unir a una GFP i s’expressava dins de la cèl·lula. De manera que si la mutació li donava tendència a gregar no es veia fluorescència ja que la GFP també agregava. Si pel contrari, era soluble donaria molta fluorescència. Això va permetre veure si la mutació feia que el pèptid agregués o no i es va fer una escala de propensitat intrínseca d’agregació dels aminoàcids.
Veiem que quan tenim residus hidrofòbics, l’agregació és superior a quan tenim residus carregats o polars.
35 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Generació d’un perfil d’agregació proteica Ara que ja tenim una escala el que fem és generar un programa que agafi seqüències i que generi un perfil d’agregació. Aquest perfil d’agregació es genera segons la seqüència. Cal tenir present que si per cada aminoàcid introduïm el valor que hem obtingut a l’assaig serà caòtic ja que hi haurà molt ziga –zaga. De manera que el que s’ha de fer és suavitzar el perfil mitjançant un algoritme. Es defineixen unes finestres que van avançant de 5 en 5 o de 7 en 7 aminoàcids. A cada aminoàcid li donem un valor que és el seu menys el promig dels quatre que hi ha al costat. Així doncs, estem promitjant àrees i en conseqüència el perfil es suavitza.
Agafem tota la seqüència i obtenim un perfil. Definim com a regió d’agregació qualsevol regió de 5 o més residus qeu tinguin un valor d’agregació per sobre de la mitjana de la proteïna (Això és una cosa que es van inventar).
Observem en la proteïna Abeta42 hi ha 3 regions que agreguen. La regió que està predint és el core de l’amiloide, de manera que aquesta és la seva seqüència diana.
La gracia està en què aquest programa (Aggrescan) funciona en la gran majoria de proteïnes en dissolució. És capaç de trobar regions que tenen propensitat a generar amiloides.
36 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 EVITAR L’AGREGACIÓ AMB EL DISSENY DE PROTEÏNES L’agregació és una propietat genèrica de les proteïnes però podem utilitzar disseny proteic per evitar que agreguin. La proteïna que veiem és GFP. La GFP quan la escalfem agrega de forma irreversible però en aquest cas no forma un amiloide.
Imaginem que volem treballar amb aquesta proteïna a alta tempartura, per exemple per catàlisi. Si volguessim veure una proteïna durant una pasteurització, la GFP agregaria a una temperatura vermella.
Per solucionar això van fer redisseny de proteïnes. En blanc veiem les zones no carregades, en vermell càrregues negatives i en blau càrrega positiva. Ells van fer un Supercharging Proteins. Van fer modificacions, en un cas de -30 càrregues (Vermell) i un altre de +30 càrregues addicionals (blau).
La proteïna nativa és funcional perquè el core no l’hem tocat, quan la bullim no hi ha agregats i l’important és que quan es refreda la proteïna torna a ser funcional. El que fan es introduir molta repulsió electrostàtica i així evitar que els hidrofòbics s’enganxi completament.
Al gràfic podem veure com la proteïna va agregant en el temps però en el cas de les proteïnes mutades veiem que no es produeix agregació, són solubles inclús quan estat desnaturalitzades. Així doncs, donat que la seqüència és important, podem jugar amb ella tant a favor com en contra.
De manera que podem utilitzar disseny per evitar l’agregació de proteïnes.
37 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Aquest experiment, és el que s’anomena com group principal? Cal tenir present que una proteïna que posteriorment es pugui fer servir per un ús humà no se li afegiran 36 càrregues ja que podria tenir conseqüències molt negatives.
Al 2007 es va publicar un article, és a dir, no fa gaire temps i ha obert un camp. Avui dia hi ha un gran interès per les protein terapeutic però aquestes tenen un problema i és que agreguen. Es tracta de proteïnes molt grans que es purifiquen difícilment i un cop les tens purificades les has de mantenir a la nevera ja que tenen una gran tendència a agregar. Així doncs, és important en la investigació del redisseny de proteïnes que amb canvis mínims es pugui aconseguir una proteïna que sigui més soluble. El fet d’aconseguir això en aquestes proteïnes té un valor afegit ja que té dos problemes. Per una part, quan agrega deixa de ser funcional i per tant quan li injectes al pacient, li estàs injectant menys de la dosi que se li ha d’administrar. Per una altra part, els agregats són tòxics de manera que donen una resposta immunogènica.
Havíem vist Aggrescan que funciona sobre seqüències. Recentment, s’ha creat Aggrescan 3D que actua sobre estructures.
Busca sobre les proteïnes quines són les regions més perilloses per tal de fer una o dues modificacions com a màxim per tal d’augmentar la seva solubilitat.
38 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 PLASTICITAT ESTRUCTURAL Cal tenir present que, el fet de desplegar-se i formar estructura beta no sempre es pot fer. Hi ha proteïnes que utilitzen aquesta capacitat per fer la seva funció: les serpines. Es tracta de serin proteïnes inhibidores. Se sap que l’estructura adequada per fer la funció de proteasa és d’alfa/beta barrel, on hi ha un centre actiu accessible al solvent per on es tallarà al substrat. Tot i això, les serpines no tenen aquesta estructura i el seu inhibidor tampoc.
Els inhibidors, serpins, són molècules petites i normalment el que fan és tapar el centre actiu. Actuen com un anàleg del substrat de manera que és tallat per la proteasa però tenen una estructura molt peculiar que els hi permet aprofitar en certa manera aquest tall per formar una estructura semblant a la de les fibres amiloides.
Imaginem una fulla beta de 5 cadenes (imatge), i la serpina (inhibidor) té un loop molt desestructurat. Aquest no es mantindria així sinó tingués una funció. L’estratègia que se segueix consisteix en què l’inhibidor deixa que la proteasa el talli i quan el talla és com una goma. L’estructura inferior té una forma de fulla beta amagada que es manté en estat random perquè està connectat a la hèlix alfa. Quan tallem per aquí, aquesta regió s’incorpora com una nova beta i el que fa és que a la proteïna li dóna un cop (com una catapulta) canviant la seva conformació i desestructurant a la altra proteïna. Aquesta és una reacció totalment irreversible. De manera que, desfa proteïnes que després no es podran tornar a plegar.
Aquesta estructura és la formació d’una fulla beta que no és nativa, ara bé, té problemes. Hi ha una sèrie de malalties que s’anomenen serpinopaties. El mecanisme de les serpines està molt bé si només passa intramolecularment. Hi ha a vegades que el que passa és que hi ha mutacions i el que s’integra a la proteïna és el loop d’una altra molècula, de manera que es forma una altra molècula on la serpina queda penjant. A aquesta serpina se li pot unir un altre loop i així successivament, fent que s’acabin formant oligòmers grans que formaran fibres. L’oligòmer és ric en fulla beta i és tòxic.
39 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 FORMACIÓ DE FIBRIL·LES La formació de fibril·les sembla una propietat genèrica de les proteïnes. Sabem que aquesta propensitat s’evitaria si les proteïnes fossin molt estables ja que d’aquesta manera no es desplegaria i per tant no donaria lloc a la formació d’espècies tòxiques. Però, recordem que les proteïnes només són marginalment estables en la conformació nativa.
El fet que la freqüència de fibril·lació en les proteïnes sigui tan baixa és degut a l’existència de les xaperones. En general, en la gran majoria de cèl·lules es gasta una gran quantitat d’energia en el correcte funcionament de les xaperones, en alguns casos fins a un terç.
La proteïna està constantment competint entre l’estat plegat i el desplegat. Tot i això, si la proteïna agrega perquè les xaperones no han pogut fer res hi ha un altre mecanisme molt important que ens permet el correcte funcionament cel·lular i aquest és la degradació proteica. Està dissenyat per treballar conjuntament amb les xaperones de manera que allò que no puguin plegar, serà degradat.
PROTEÏNES QUE ASSITEIXEN AL PLEGAMENT D'UNES ALTRES PROTEÏNES.
Foldases Les foldases són un tipus de proteïnes que assisteixen al plegament d’altres proteïnes. En trobem de dos tipus: protein disulfur isomerases i prolil cis – trans isomerasa.
Les protein disulfur isomerases ajuden a què els ponts disulfur es formin correctament ja que tot i que es formin de manera incorrecta la proteïna continua sent molt estable perquè té covalents formats i és compacta. De manera que sortir d’aquests mínims energètics sense ajuda és molt difícil.
Les prolil cis – trans isomerases permet fer el canvi de cis a trans o de trans a cis en les prolines. En aquest cas també ens trobaríem en un mínim energètic ja que l’estructura és molt semblant a la nativa i per tant, és molt difícil sortir sense la ajuda d’aquestes proteïnes.
Les foldases són catalitzadors de la velocitat limitant del plegament de les proteïnes. Com per exemple, la formació de ponts disulfur o la isomerització cis –trans en els residus de prolines. Són catalitzadors i per tant els podríem definir com a enzims.
Cal tenir present que les foldases no canvien la via de plegament, l’únic que fan és catalitzar la reacció. Si la barrera energètica és suficientment alta, aquest procés no es podria donar sense foldases.
El producte és més estable que el reactiu de manera que la reacció sí que s’acabaria donant, però si la barrera energètica és molt alta, trigarà molt temps. Així doncs, en temps biològic, aquesta reacció no es donarà i cal accelerar el procés.
40 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Protein disulfur isomerases (PDI) Les PDI o les tiol oxidoreductases s’encarreguen de reduir o oxidar els grups tiol (SH). El nombre de ponts disulfur que es poden fer, si tingués lloc el plegament a l’atzar, augmenta amb el número de cisteïnes que tenim a la cadena.
Concretament, creix de forma exponencial. Si tenim 6 Cys, tindrem 3 disulfur natius però hi ha 15 possibilitats diferents. Si tenim 8, s’hauran de formar 4 ponts disulfur però en aquest cas hi ha 105 possibilitats. Per últim, amb 16 cisteïnes hi ha més de 2 milions de ponts disulfurs possibles. De manera que és molt probable que en la via de plegament, si has de triar entre tantes possibilitats t’equivoquis, i que una fracció de les molècules es pleguin de manera errònia. És per aquest motiu que necessitem de les PDI, són proteïnes essencials de manera que si les bloquegem a la cèl·lula, aquesta mor.
PDI d’E. coli A l’esquema observem el mecanisme de la DsbA que és la PDI de E. coli. Fins fa poc no hi havia cap estructura de PDI humana però, en l’actualitat ja s’han trobat dues i són molt semblants a aquesta.
El que té la PDI és una seqüència del tipus Cys – Gly – His – Cys on els tiols són molt més reactius que en una proteïna normal.
Llavors, una forma de fer-los actius és mitjançant una de les estratègies que ja hem estudiat. Es pot fer mitjançant una propietat de les hèlix alfa, recordem que aquestes tenen un dipol elèctric que si no és compensat, es desmonten. El que fa la natura és utilitzar això per treure-li electrons a les Cys de manera que siguin molt reactives. Aquestes són capaces de reaccionar tant amb les formes reduïdes com amb les oxidades de manera que, són capaces d’oxidar i de reduir.
Nosaltres, en humans, no volem una proteïna que sigui oxidoreductasa i que pel reticle vagi oxidant i reduint proteïnes a l’atzar. Només volem reduir o oxidar aquelles proteïnes que estan malament plegades. De manera que, aquesta proteïna està dissenyada per reconèixer zones hidrofòbiques que en condicions normals no estan exposades a solvent. Així doncs, si es troben zones hidrofòbiques voldrà dir que la proteïna no està ben plegada.
De la mateixa manera que les xaperones, aquestes proteïnes també tenen la capacitat de seleccionar el substrat. Cal tenir present que són selectives però a la vegada promiscues, és a dir, no busquen seqüències específiques com faria una proteasa sinó que busca una regió hidrofòbica exposada a solvent. És per aquest motiu que una PDI pot funcionar amb més d’una proteïna. Cal recordar que, la forma reduïda trenca els disulfurs i la forma oxidada els forma.
41 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Esquema funcionament Imaginem una proteïna molt senzilla en la qual els ponts disulfur natius són 1 – 4 i 2 – 3. La proteïna ha anat plegant i s’ha quedat atrapada de manera que, 1 s’ha unit amb 2 i 3 amb 4. Si no tenim res que ens ajudi a desfer això, no es desfarà. Així doncs gràcies a la PDI reduïda podrem trencar els ponts disulfurs.
El cor hidrofòbic que està exposat a solvent és reconegut per la PDI com que no està ben plegat. En aquest cas, el primer que es trenca és el disulfur entre 1 – 2 i la PDI queda enganxada amb la cisteïna 1. En aquest moment tenim un complex mixte entre PDI i la proteïna. Cal tenir present que en molts casos PDI és més gran que la pròpia proteïna.
Així doncs, queda un disulfur lliure que és reactiu i que té tendència a anar cap a la seva estructura nativa i per tant atacarà el pont disulfur entre 3 i 4 i es formarà el primer pont disulfur natiu. Un cop ja s’ha format el primer enllaç natiu, la reacció és directa. El que fa el següent tiol és atacar el pont disulfur que s’està formant amb la PDI, de manera que s’acaba alliberant PDI per una banda i per l’altre la proteïna ben plegada. La PDI pot tornar a entrar a un altre cicle, la tenim reduïda i pot treballar amb altres molècules.
Altre cosa que pot passar és que el plegament sigui molt lent. En aquest cas PDI pot ajudar a formar els ponts disulfur. Per fer-ho cal que estigui oxidada i per tant que tingui format el pont disulfur. PDI oxidada s’apropa a una regió desplegada i és atacada, de manera que es forma un complex mixte que el que fa és tancar l’estructura ja que s’està reconeixent zones hidrofòbiques. La PDI aconsegueix apropar els tiols que han de formar el pont disulfur.
Un cop es formen, la proteïna queda oxidada. Aquest mecanisme és una catàlisi que forma ponts disulfur natius, aconsegueix treure les proteïnes de trampes cinètiques i accelerà el procés.
En aquest cas la PDI no es regenera, és a dir, no la tornem a tenir oxidada. Per tal de tenir-la oxidada cal una altra proteïna que ho faci. Se sap que la formació de disulfurs en molts organismes està associada a la cadena respiratòria.
42 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Isomerització cis – trans de prolines Tenim un enllaç peptídic. Com passem d’un costat a l’altre si l’enllaç peptídic funciona com a doble enllaç parcial? De forma espontània, es relativament impossible, si ens quedem atrapats, ens quedem atrapats.
Necessitem ajuda.
El que fa això és dedicar-se exclusivament a isomeritzar l’enllaç. Però és un catalitzador, ell no sap quina de les dues conformacions és més estable, l’únic que fa és trencar (de fet no trenca, ja us ho explicaré més endavant) afavoreix i deixa que la prolina busqui la seva conformació més estable.
Ni la PDI ni la protein isomerasa saben quin es el codi més estable, el codi esta a la seqüència i finalment a la estructura, l’únic que fan es que els hi donen una altre oportunitat.
Si no funciona actuarà una altre vegada, i si no funciona actuarà una altre vegada (repetidament). Un cop la prolina esta a la seva conformació correcta, ja no tindrà exposició de hidrofòbics, la isomerasa ja no actuarà més.
Quan fem plegament, nosaltres el fem en “stop flow?” , en equilibri, el fem bàsicament agafant una proteïna, una dissolució, normalment a mes a mes diluïda perquè no volem que ens agregui, volem veure només plegament, 100µM10µM, en aigua, amb un tampó i una mica de sal. Això funciona perfecte i plega molt ràpid. Però resulta que això que es el que fem tots, no s’assembla en res al que passa dintre de la cèl·lula.
Quan la proteïna surt del ribosoma (la imatge es de E.Coli) es troba amb això (imatge). Això es un esquema del que s’anomena el “crowding” , la població, del citosol.
Quan dibuixen el líquid del citosol, això es el que hi ha a dins, està completament ple de macromolècules. Quan la proteïna neix al ribosoma ho fa desplegada, per tant té moltes possibilitats d’interaccionar de forma anomala amb altres molècules. Gran problema, perquè o agrego jo i soc tòxica, o igual no sóc tòxica però m’emporto una proteïna essencial. Això s’ha de solucionar i això ho fan les xaperones.
43 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Xaperones Les xaperones es diferencien de les foldases perquè són unes estructures molt més complexes i es dediquen al plegament.
Actualment s’estan realitzant moltes investigacions per tal de trobar molècules que actuïn com a xaperones, i això dóna molts diners.
Les proteïnes agreguen perquè no hi ha suficients xaperones o bé perquè no hi ha prou energia per formar-les i fer-les funcionar. Hi ha moltes xaperones però nosaltres veurem les Hsp (Heat shock protein). En trobem de diferents tipus que segon quin sigui el seu pes molecular (KDa) reben un nom o un altre: Hsp100,90,70,60,40 i small hsp.
Els investigadors van col·locar al bacteri durant un temps a alta temperatura (heat shock) i es feia córrer per un gel d’electroforesi. Van observar que apareixien unes bandes molt intenses de Hsp amb els pesos moleculars que veiem a la taula. Això és degut que estàvem induint estrés tèrmic, i com que les proteïnes són marginalment estables, si augmentem la seva temperatura, es despleguen. Les cèl·lules han adoptat estratègies per tal de tenir promotors que són sensibles a aquests canvis, entre altres coses, detecten que certes proteïnes es despleguen i això el que fa és augmentar la síntesi de xaperones.
44 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Xaperona Hsp 70 La Hsp 70 més coneguda és la DnaK que es va trobar en bacteri, tot i això és una proteïna ubiqua, és a dir, que està en tots els organismes. La DnaK és una proteïna essencial si tenim problemes, és a dir, si estem a la temperatura correcta no necessitem de la Hsp 70, en canvi, si la temperatura augmenta la necessitem per tal d’ajudar a plegar. Aquesta proteïna es troba a mitocondris i reticle endoplasmàtic.
Aquesta proteïna té dos dominis: Un que no veiem aquí i que té activitat ATPasa. Fa referència a l’extrem N- terminal i uneix ATP i l’hidrolitza. De manera que necessita ATP, sense ell no funciona. Aquest domini té uns 44 KDa.
Pel que fa al domini C – terminal, de 25 KDa, té a la vegada dos subdominis:  Una estructura amb conformació de barril beta aixafat, sandwich beta, que té un solc que reconeix residus hidrofòbics.
 A sota té una estructura que és tot alfa i que funciona com una tapa.
El que fa aquesta xaperona és, no plegar, si no evitar l’agregació. Això es fonamental. El que fa és reconèixer residus hidrofòbics exposats a solvent, els uneix i tanca la tapa (els grapa) i els deixa fins que estan en un entorn més estable, o els porta fins a una xaperona que plegui. La seva funció es evitar que agregui. Aquesta té molta importància en el moment en que les proteïnes surten del ribosoma, que estan desplegades amb els hidrofòbics exposats.
L’ATP el que fa és canviar la conformació de la tapa, de oberta a tancada. Quan la xaperona ha de rebre un substrat ha d’estar obert, perquè sinó no entra, i quan tinc el substrat haig de tancar.
Està molt lluny la activitat de unió de ATP i la ATPasa, fan falta el que s’anomenen moviments coordinats. Quan allibero el substrat quedo obert i vaig a per un altre, o a vegades a per el mateix.
Funcionament Hsp70/Hsp40 (DnaK/DnaJ) Recordem que les xaperones uneixen ATP i això provoca canvis conformacionals. Aquesta és la estructura de les xaperones.
La part vermella és la que uneix els pèptids que quan està activa va girant i ho tanca. Això protegeix la proteïna de l’agregació, és una hèlix bastant rígida què depèn de l’entrada i sortida d’ADP. A la proteïna trobàvem:  Domini N ter: uneix ATP i té activitat ATPasa.
 Domini d’unió al substrat: forat amb afinitat als pèptids amb residus hidrofòbics, fins a 7 aminoàcids.
 Domini C ter: Amb varies hèlix alfa. Funciona com una tapa del domini d’unió del substrat.
La proteïna DnaK carregada amb ATP es troba oberta, té poca afinitat pel pèptids però suficient per reconèixer-lo, està casant pèptids. Quan es produeix la hidròlisi ATP augmenta l’afinitat perquè la tapa es tanca i queda ancorat, aquest seria el motiu d’unió de la Hsp70 o de la DnaK, és de la família de les Hsp70.
45 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Funcionament Hsp70/Hsp40 (DnaK/DnaJ) El que fem és agafar una sèrie de pèptids, fas recombinatòries i mires quan s’uneix i quan no, es va veure que s’uneix quan tenim encarat Phe, Trp (residus grans i hidrofòbics) cap al solc d’unió hidrofòbic ja que aquests acostumen a estar al nucli, per tant si estan exposats serà perquè la proteïna està mal plegada.
Hsp70 s’uneix a l’ATP quan la seva activitat ATPasa és molt baixa. Normalment la trobem carregada negativament sense substrat. En aquesta conformació té poca afinitat pels pèptids però suficient per reconèixer-los. La presència del pèptid fa augmentar l’activitat ATPasa, per tant, el mateix pèptid fa que la tapa es tanqui, ha petit un canvi conformacional. La hidròlisi augmentada per la presència del pèptid encara és molt lenta, les xaperones en general necessiten coxaperones anomenades també Hsp. Aquestes no són xaperones , només ajuden a les xaperones perquè funcionin bé.
En el cas de les Hsp70 la coxaparona principal és la Hsp40, com que és important pel plegament de la proteïna diana, aquestes també són activables per estrés. El que fa és augmentar molt la velocitat de hidròlisi, la pinça es tanca molt ràpid, el què fa és que el pèptid s’uneix i un cop unit comença la hidròlisi d’ATP i aquesta senyal és suficient perquè Hsp40 s’uneixi a Hsp70 i augmenti la hidròlisi.
Una vegada tancat tenim un problema perquè està carregat amb ADP, això fa que el substrat no pugui sortir, està tancat.
Necessitem un factor GrpE (de fet és una xaparona) però s’anomena factor d’intercanvi de nucleòtids, perquè és la funció què fa, canvia ADP o ATP. El que fa el factor és treure l’ADP i carregar-lo amb ATP, aleshores queda carregat s’obra i surt el substrat.
Cal tenir present que la coxaparona no té cap funció de plegar només carrega o descarrega, ajuden a la regulació depenent d’ATP.
Familia Hsp 60 o xaperonines Les xaperonines són molt grans que les Hsp70 perquè formen complexos macromoleculars, capses de plegament. Aquestes si que es veuen al microscopi perquè formen complexes.
De fet les proteïnes són més petites que Hsp70 perquè el complex la constitueixen xaperones Hsp10 + Hsp60 , el que passa és que s’uneixen per formar una estructura macromolecular molt gran.
Les xaperonines estan constituïdes per:  GroEL: format per 14 proteïnes de 57 kDa, per això s’anomena Hsp60. formen dos anells de 7 proteïnes (7 a sota (color blau) i 7 a dalt(vermell)). Tenen una estructura amb forma de donut doble.
 Gro-ES: té una estructura molt similar a l’anterior, radial, però més petites de 10 kDa cada una, aquestes formen com una cúpula (groc).
46 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Sistema: pateix canvis conformacionals depenent d’ATP, cada cicle són 7 subunitats d’ATP que es sintetitza, per tant, gasta molt ATP. Això li permet fer dues coses, per una banda canviar la mida de la cavitat i per una altra unir o desplaçar la cúpula.
Les xaperonines tenen 3 dominis:  Equatorial: és tot alfa  Intermedi: alfes llargues amb molts loops, per tant molt flexibles.
 Apical: alfa i beta barrejades.
GroEL Els forats que tenen el complex és perquè entri i surti ATP. Quan hi ha unió ATP hi ha un canvi conformacional que fa més gran la cavitat i està tapada. Es fa més gran perquè la proteïna ja està dins, li donem espai perquè plegui.
El domini apical està a la part de dalt i exposat a solvent, és hidrofòbic, sobretot el loop que té que fa la funció d’enganxar proteïnes que estan malament plegades. Tant el de baix com el de dalt.
Domini intermedi: nota, sent i reacciona el què passa aquí a baix.
Domini equatorial: Aquest domini és important perquè és el domini que fa la connexió entre els dos anells, és la única unió que hi ha. És el responsable de la transmissió dels canvis al·lostèrics. Aquesta part és la que nota i reacciona amb el que passa a baix. El de a dalt uneix, el de a baix nota i sent i el del mig es canvia de conformació per tal de permetre el plegament.
GroEs GroEs és un petit barril beta de set subunitats cadascuna disposades sobre un domini apical. Te uns loops que formen roof beta hairpin mirant cap endins perquè d’aquesta manera tapen la cavitat.
Perquè tenen la funció de tapar la cavitat. Grup beta-haiping, estructura peculiar molt allargada que en solució no es manté, fluctua de forma continua però quan tenim 7 subunitats tenim contactes entre ells de manera que, la proteïna està estabilitzada Té uns altres loops que estan dibuixats però que no es veuen perquè és una estructura cristal·lina, és dir, es tracta de loops que s’estan movent. No tenen una distribució a l’espai determinat, es van movent, són molt flexibles amb un caràcter hidrofòbic perquè s’han de col·locar físicament sobre la capsa. S’uneixen a GroEl i noten els canvis conformacionals.
47 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Possible cicle d’actuació de GroEl/GroES Imagineu que tenim una proteïna desplegada (groc). Inicialment tenim en solució aquesta complex sense la proteïna, sense cap nucleòtid, carregada amb ADP i una tapa (GroEs) que ens indica el lloc per on ha d’entrar la proteïna, dóna direcció.
Aquesta zona es susceptible per rebre proteïna desplegada, descarregues ADP i Groes que pateix canvi conformacional. GroEl i Gro Es no actua de forma única sinó que dona moltes oportunitats de plegament, per plegar un substrat requereix varis cicles per actuar la proteïna, sinó ve Hsp90 que se l’endu cap al proteosoma i la degrada.
Un cop unida comencem a plegar-la, no pot estar en contacte amb el solvent.
Carregues ATP, pateix un canvi de conformació que entri GroEs i quedi tapada.
ATP s’hidrolitza, surten 7 Pi cosa que provoca un canvi conformacional molt important que fa que la proteïna plegui. Entren 7 ATP a sota per preparar la sortida, tenim ADP carregat, ATP carregat, ADP surt, ATP s’hidrolitza i surt tota la tapa. Qui dona la senyal de sortida de la tapa i la proteïna plegada és la hidròlisi de la subunitat de sota, perquè dóna energia. Descarregar l’ADP no en dóna. La última conformació (f) s’assembla molt a la (b), però no hi ha tapa. Torna entrar una nova molècula o la mateixa si no s’ha plegat.
En resum: 1.
Carrego, trec la tapa i trec l’ATP, ara tenim la proteïna per començar el cicle.
2.
Has d’assemblar la cavitat i posar la tapa.
3.
Carrego ATP canvi conformacional, GroES tapa 4.
Hidrolitzes ATP canvi conformacional a la cavitat de la part de dalt.
5.
Prepares la cavitat de sota per la sortida de la proteïna plegada.
6.
Hidrolitzes ATP, GroES salta i la proteïna salta 7.
Probablement la tornaràs agafar a dalt, en posició que tens ADP, això molesta i torna a saltar.
8.
Quan acabes de treballar es torna a col·locar la tapa i podrà tornar a començar al cicle.
48 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 Com plegues la proteïna dins la cavitat? El complex agafa la proteïna perquè té una zona hidrofòbica. La hidròlisi dels 7 ATPs el que fa és que la molècula gira, els residus hidrofòbics que abans contactaven amb la proteïna ara queden amagats totalment, ara queden exposats al solvent de la cavitat residus polars alguns carregats.
Estem en una cavitat fas que els residus hidrofòbics estiguin en contacte amb els hidrofòbics, cal tenir present que no es pot formar un agregat intermolecular perquè només hi ha una molècula dins de la cavitat, únicament hi cap una. A la part externa de la cavitat hi ha un grup hidrofílic, i el grup hidrofòbic passarà a estar en contacte amb ell per desplegar la proteïna i donar-li una altra oportunitat. Per tal de poder entendre com funciona ho hem de mirar des del punt de vista termodinàmic. Si pensem en el plegament, en les forces que estabilitzen una proteïna hem de pensar en entropia, entalpia i contactes hidrofòbics. En la caixa, l’entropia baixa comparat amb la proteïna que es troba dissolta en el solvent, de manera que l’entorn té un mínim energètic més baix. Quan treus la tapa (sense canviar de conformació), la primera surt, es descarrega l’ADP, gira i torna a agafar una altra molècula per fer el mateix.
Així doncs, és més fàcil plegar la proteïna perquè l’entorn hidrofílic més una disminució de l’entropia, estabilitza la proteïna.
Per tal d’estudiar com funciona el complex es van dur a terme una sèrie d’experiments, que consisteixen en:  canvies la subunitat d’ATP, no hi ha funcionament  canvies hidrofòbic per hidrofílics, no hi ha enganxament  canvies hidrofílics interns per hidrofòbic, no hi ha alliberació.
Mida de les proteïnes que les xaperones poden ajudar Vermell i verd: representen quina és la mida de substrats.
Blau i groc: distribució dels dominis en el proteòmer.
Si comparem en quins substrats funcionen veiem que funcionen molt poc en substrats petits perquè els que estan entre 020 kDa són tant petites que pleguen de forma autònoma. Les xaparones han evolucionat per reconèixer proteïnes mitjanament grans entre 20-40 kDa, 40-60 kDa però més de 60 kDa ja no perquè no i podem entrar.
49 Judith Gonzàlez Gallego Química i enginyeria de proteïnes T5 El domini més comú d’una proteïna és de 20 kDa, perquè és la mida d’un domini que no necessita assistència per les xaparones, poden plegar de forma autònoma, per això quan separes dominis aquests poden separar de forma autònoma.
Normalment les proteïnes grans triguen molt a plegar o les xaparones tenen poc afinitat per elles? El que passa és que han evolucionat per ser solubles, les reconeix només el DnaK o porpteïnes semblants que eviten la seva agregació, però ningú les pot ajudar a plegar. N’hi ha molt poques en la cèl·lula per això no són cap problema.
FLEXIBILITAT CONFORMACIONAL La flexibilitat conrformacional és un tema en sí mateix i NO entra a l’examen. Només cal saber que les proteïnes no tenen una estructura única sinó que fluctuen, tenen un moviment continuu de cadenes laterals que és molt ràpid.
50 ...