Tema 3 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Tècniques Instrumentals Avançades
Año del apunte 2013
Páginas 9
Fecha de subida 17/10/2014
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María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 UNIDAD 3: ESPECTROMETRIA DE MASAS INTRODUCCIÓN La espectrometría de masas es la técnica central de la proteómica, ciencia que busca la identificación de las proteínas.
Esta técnica se ha hecho servir para muchas otras moléculas y debemos tener presente que estas deben ser calentadas, lo que supone un problema para las proteínas puesto que se desnaturalizan. Este es el motivo por el cual existen diferentes técnicas para volatizar las proteínas.
El punto de partida generalmente es un gel de electroforesis, en el que encontramos todas las “manchas” de las proteínas. Recortaremos la parte del gel que contiene más proteína para tratarla con una proteasa, como por ejemplo tripsina, que cortará nuestra proteína de forma específica dando lugar a péptidos.
Estos serán analizados per espectrometría de masas, por lo que esta técnica sirve para analizar secuencias de péptidos, calcular la masa molecular de una proteína (llega hasta la centésima de la masa de un protón, por lo que es muy precisa), analizar proteínas que han sido modificadas postraducionalmente….
El espectrofotómetro siempre debe ser calibrado antes de la elaboración de la técnica para evitar errores.
FUNDAMENTO DE LA ESPECTROMETRÍA La espectrometría de masas consiste en generar iones positivos, de la sustancia que queremos conocer la masa molecular, en presencia de un campo electro en el cual las moléculas adquieren energía cinética que dependerá de la fuerza de dicho campo y del número de cargas positivas de la molécula. Es un procedimiento similar a la electroforesis.
La energía cinética que adquieren las especies K se puede expresar como: en que debemos tener presente que:  Z es el número de cargas positivas que tienen la especie  e es el valor de la carga unitaria (carga del electrón pero con signo positivo)  E es el valor del campo eléctrico  S es la distancia de aceleración 1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 La energía que habrán adquirido las moléculas al llegar al final del campo eléctrico depende exclusivamente del número de cargas positivas que la especie tenga, no depende de la masa por lo que especies con masas diferentes pero con un número de cargas positivas iguales recorrerán la misma distancia.
A partir del final del campo las moléculas viajaran gracias a la energía cinética que hayan adquirido con anterioridad (en presencia del campo) y por eso en esta región no existe un potencial. Las moléculas viajan hasta un detector.
Las moléculas, como hemos dicho anteriormente, tienen una velocidad expresada como , que era independiente de la masa. Ahora en cambio se encuentran en un recorrido que no presenta ningún campo por lo que las partículas tendrán una nueva velocidad que será . Esta velocidad corresponde a la zona en la que ya no hay potencial, por lo que las moléculas se deben diferenciar en base a alguna característica, y se discriminaran en función de la velocidad que tengan durante este recorrido, que a su vez, dependerá de su masa.
Teniendo en cuenta las fórmulas anteriores podemos llegar a una fórmula básica para describir el movimiento que sufren las partículas en el espectrómetro de masas: Las diferentes especies viajarán a través del segundo tubo o espacio en función de su relación masa – carga: m/Z El tiempo de vuelo depende directamente de la masa y es inversamente proporcional a la carga: en la primera zona la energía adquirida únicamente depende de la carga pero después, esta energía también dependerá de la masa puesto que esta determina la segunda velocidad que adquiere la partícula (en la zona no cargada con un campo eléctrico). Es esta segunda velocidad la que determina el tiempo de vuelo.
Generalmente a medida que los picos aumentan también lo hace la resolución. Debemos pensar que algunos picos más pequeños pueden ser debidos a “ruido” de fondo, a interferencias.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 TIPOS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS La espectrometría de masas se ha utilizado desde hace siglos pero el gran problema era la utilización de esta técnica con macromoléculas (como proteínas o DNA) puesto que las medidas realizadas de m/z se elaboran en la fase gaseosa de las partículas. El aumento de temperatura o la aplicación de otras técnicas para llevar dichas macromoléculas a su estado gaseoso provocaban normalmente su rápida descomposición.
Con el tiempo se desarrollaron dos métodos diferentes para superar este problema, es decir, se desarrollan dos métodos para volatilizar este tipo de muestras y generar iones:  MALDI MS: espectrometría de masas de ionización/desorción por láser asistida por matriz  ESI MS: espectrometría de masas de ionización por electrospray La espectrometría de masas permite secuenciar proteínas porqué cada aminoácido tiene una masa diferente, como se trata de una técnica muy precisa podemos distinguir los diferentes aminoácidos de pesos moleculares distintos a excepción de la leucina y la isoleucina, que son monómeros por lo que tienen el mismo peso molecular.
Técnica MALDI- TOF Esta técnica se basa en mezclar las proteínas que queremos analizar con otra molécula que denominaremos matriz y que es capaz de absorber la luz. La matriz más utilizada es el 3-5 dihidrobenzoico, una molécula aromática que tiene su máximo de absorción a 337 nm.
Aplicaremos sobre dicha matriz un pulso corto de luz laser (en este caso será exactamente de 337 nm) por lo que gran parte de la longitud de onda será absorbida por la matriz y consecuentemente se introduce una gran cantidad de energía en la mezcla, lo que provoca la ionización de las proteínas y la desunión de la matriz, puesto que esta explota. Las proteínas que han sufrido una volatilización explosiva irán hacia el sistema de vació que queremos.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Sabemos que en la región libre de campo las partículas corren en función de su masa por lo que, las especies con mayo masa llegarán más tarde al detector para un valor de carga determinado.
Asumiremos que todas las moléculas son liberadas al mismo tiempo pero el pequeño error que exista se puede corregir aumentando la precisión pero este aumento muchas veces causa ruido de fondo que es molesto.
Cuando se elabora la volatización por láser la especie dominante es z=1 i esta no se conoce.
Para calcular la masa molecular se opera igual que en el método MALDI: si ampliamos el pico máximo observamos que está formado por diferentes picos puesto que hay microheterogeneidad (mutaciones puntuales de forma que un aminoácido puede ser sustituido por otro variando ligeramente el valor de Mr). La masa queda determinada como: Porque podemos escribir los picos como: Ejemplo Se estudia una proteína supuestamente homogénea y el espectrofotómetro registra datos que llegan a 50, 35, 29 i 25 ms.
Mostrar que los resultados son compatibles homogéneos en masa.
Supuestamente estos valores corresponden a la proteína con 4,3,2 y 1 protón de manera que el primer tiempo corresponde a la proteína con mayor número de protones y el último al que únicamente tiene un protón.
Primeramente debemos comprobar si la masa de la proteína según la carga es proporcional al tiempo que tardan en llegar al detector:     Estos valores son muy similares. Podemos calcular el % de error elaborando la diferencia entre el mayor y el menor por lo que podemos determinar qué: Podemos afirmar que efectivamente la muestra se trata de una solución monodispersa de una proteína homogénea. Por lo general si el error es mayor a 0,1% se trata de una proteína no homogénea o un error experimental.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Técnica ESI Este método se funda en hacer pasar un líquido a elevada presión por un capilar muy pequeño (del orden de pocas micras) donde hay una diferencia de potencial que contiene las proteínas y se generan unas gotas muy pequeñas donde cada gota contiene una molécula. Este proceso se elabora a temperatura ambiente y el agua se evapora, quedando las moléculas libres y protonadas, no se forman agregados. Estas moléculas entrarán más tarde en un detector.
Debemos tener presente que las gotas más grandes no nos sirven porqué contienen más de una molécula de soluto (nos interesan las gotas que únicamente tienen una molécula). La repulsión electrostática de las moléculas cargadas provoca la explosión de gotas grandes en gotas más pequeñas, por lo que el perfil esta vez tendrá muchos más picos.
Elaboraremos este proceso en un gel filtración para eliminar las sales que pueda contener la muestra puesto que estas se unen a la proteína dando lugar a una masa anómala, desplazando los protones.
Ejemplo 1 Supongamos que nos fijamos en dos picos consecutivos, siendo la masa molecular Mr=10000 y 5 y 4 cargas correspondientemente: También podemos formar un sistema suponiendo: M=10000 X=5 Podemos establecer como una asignación sencilla de forma general: 5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Comparación de los tipos de perfiles Debemos tener presente que por lo general en la técnica ESI obtendremos una cantidad mayor de picos: Perfil obtenido mediante MALDI-TOF Perfil obtenido mediante ESI FORMA DE OPERAR SEGÚN EL FUNDAMENTO Para empezar la experimentación digerimos la proteína con una encima, como por ejemplo tripsina, lo que nos dará diferentes péptidos con diferentes pesos moleculares, que se podrán distinguir con el espectrómetro de masas.
En un espectrómetro de masas está permitido, la maquinaria lo permite, extraer uno de los componentes de la proteína que nos interese (gracias a unas puertas) que por lo tanto, podemos analizar por separado.
Además también tenemos la opción de romper todos los enlaces peptídicos del péptido extraído. Debemos pensar que esta rotura es al azar, se elabora haciendo colisionar un átomo de energía cinética muy elevada con cada enlace peptídico, lo que genera roturas pero sin un orden. Ahora, los nuevos péptidos los podemos volver a pasar por un espectrómetro de masas, que nos dará los mismos fragmentos ordenados según su masa molecular. La diferencia entre las masas de dos picos nos permitirá identificar al masa de cada aminoácido puesto que la diferencia proviene de este (se ha roto el siguiente enlace peptídico o el anterior), es decir, las diferencias de masas corresponden a las diferentes masas de las cadenas laterales de los aminoácidos.
Por lo tanto, la diferencia de masas entre dos fragmentos se encuentra en el aminoácido final, corresponde a la masa de este. Por ejemplo supongamos que tenemos los siguientes péptidos: 100 110 120 130 140 A B C D E 6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Podemos elaborar dos series: Serie 1: Serie 2: A 100 E 140 A B 210 E D 270 A B C 330 E D C 390 A B C D 460 E D C B A B C D E 500 600 Si introducimos los péptidos en el espectrofotómetro los obtendremos ordenados según su masa molecular tal como se representa en el siguiente esquema: Podemos decir que la primera serie está compuesta por los fragmentos rotos de N-terminal hacia C-terminal mientras que la segunda serie está compuesta por fragmentos rotos de C-terminal hacia N-terminal. Esto lo sabemos gracias a tratamientos específicos que permiten que el extremo N-terminal no tenga carga, de manera que se puede observar en el espectrofotómetro, lo que nos permite eliminar una de las series para observar únicamente una.
TIPOS DE ANALIZADORES Los analizadores son una parte esencial de los espectrofotómetros de masas y de ellos dependen características como la resolución, sensibilidad, rango de masas, capacidad para la medida exacta de masas... Existen diferentes tipos de analizadores:  Analizadores del tiempo de vuelo (TOF)  Analizadores cuadroupolares  Trampa de iones 7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Analizador del tiempo de vuelo (TOF) El detector nos sirve para esta técnica porque todas las moléculas no salen a la vez aunque debemos tener presente que existen otros detectores que se basan en otro principio.
En la utilización de este detector o analizador del tiempo de vuelo, introducimos la muestra en la fuente iónica, que puede ser de impacto electrónico, desorición láser… una vez tengamos la ionización producida (no importa el método mediante el cual la obtenemos) se evita que los iones formados puedan salir de la fuente dispersos en el tiempo, por lo que son retenidos en la fuente gracias a un potencial de retardo de igual signo al de la carga de los iones.
Aplicamos un voltaje de extracción para que los iones que habíamos retenido salgan de la fuente de manera simultánea, para que sigan por un campo con un determinado voltaje, adquiriendo una elevada energía cinética que los impulsa a ir más rápidamente hacia el detector. Sabemos que el tiempo de vuelo dependerá de la relación m/z de manera que aquellos iones más pequeños alcanzaran antes el detector que los iones más grandes (si suponemos siempre que cada ion contiene únicamente una carga) Trampa de iones Este tipo de analizador consiste en un recinto (es como el tamaño de una pelota de tenis) definido por tres electrodos de superficie hiperbólica o circular. La ionización se produce por un impacto electrónico, mediante un filamento que opera de forma pulsante. Los iones producidos quedan atrapados mediante campos eléctricos en la cavidad de la trampa iónica.
Una vez tenemos esto elaborado se genera, inmediatamente, una rampa de radiofrecuencia aplicada al electrodo que rodea la cámara.
Una vez realizado este procedimiento iremos aumentando el voltaje de la radiofrecuencia, lo que provocará un aumento en la oscilación de los iones, que aumentaran por lo tanto, su amplitud del movimiento oscilatorio que hemos inducido anteriormente hasta un punto en que serán expulsados de la cámara, aquellos que salen por la parte inferior (pueden salir por la superior también) serán detectados por un multiplicador de electrones convencional.
La desestabilización de los iones se elabora gradualmente, los iones de masas crecientes se van desestabilizando ordenadamente de manera que a diferentes masas se van presentando de forma secuencial en el tiempo y por lo tanto existe una correlación entre el voltaje aplicado y la masa detectada, lo que nos permite obtener un espectro.
La gran ventaja de esta técnica es su sensibilidad puesto que tenemos una gran recolección de iones pero por el contrario, tienen limitaciones en cuanto a su capacidad de resolución y a la alta probabilidad que se puedan generar interacciones ion – molécula durante el tiempo de residencia de los iones en la cavidad.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T3 Analizadores cuadrupolares Este analizador está formado por cuatro barras o polos en forma de cilíndrico alineados paralelamente entre sí, y equidistantes a una distancia r0 de un eje central imaginario situado sobre el eje Z de las coordenadas cartesianas. A cada pareja de barras opuestas se les aplica voltajes de corriente continua y una radiofrecuencia superpuestos de manera que conseguimos que iones de masas determinadas puedan pasar por el “túnel” que configuran estos cilindros, siguiendo trayectorias oscilantes estables.
Las trayectorias de los iones los conducen a un detector (que está fuera del conjunto de barras). Si variamos los voltajes podemos ir enfocando de modo sucesivo las diferentes masas (funcionaria como un filtro de iones en función de la relación m/z) presentes para obtener un espectro determinado.
Para cada relación m/z existe una frecuencia que permite que el ión salga i vaya a parar al detector, en todas las otras condiciones dicho ion no se moverá. En ser un método oscilante debemos tener presente que en cada movimiento sólo dejará pasar una determinada relación m/z que irá cambiando con el tiempo (cal que modifiquemos las barras y hagamos un mantenimiento de ellas para el correcto funcionamiento).
Método para proteínas grandes: colisión con un gas noble Este sistema se utiliza para secuenciar péptidos según su masa y generalmente se utiliza para aquellas proteínas que tienen una masa muy grande. La celda de colisión está llena de Argón, un gas novel y a baja presión. La colisión de la proteína con dicho gas noble provoca la rotura del enlace peptídico en todas las combinaciones posibles (se elabora, como promedio, por cada enlace peptídico una rotura). Si analizamos los péptidos mediante el sistema anterior obtendremos la secuencia de la proteína.
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