Tema 12. Estructura dels àcids nucleics. El RNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bioquímica I
Año del apunte 2014
Páginas 11
Fecha de subida 02/02/2015
Descargas 13
Subido por

Vista previa del texto

Tema 12. Estructura dels àcids nucleics. El RNA CARACTERÍSTIQUES GENERALS DEL RNA L’àcid ribonucleic (RNA) és un polímer format per una llarga cadena de nucleòtids. Aquests nucleòtids consten d’una base nitrogenada (A, U, C, G) una ribosa i un grup fosfat.
Les principal diferències que presenten respecte el DNA és la presència d’uracil en lloc de timina (recordar que timina i uracil es diferencien per la presència d’un grup metil en la primera) i per la presència de ribosa en lloc de desoxiribosa.
El RNA forma estructures secundàries de doble cadena, anomenades estructures en forma de forquilla, però són molt curtes en comparació amb la doble hèlix del DNA. Per eliminar-les s’augmenta la temperatura als 80oC aproximadament.
Una altra diferència respecte el DNA és una menor estabilitat, que implica una vida mitjana més curta i una hidròlisi més ràpida dels enllaços fosfats entre nucleòtids.
POLIMERITZACIÓ DEL RNA L’enzim encarregat de la polimerització del RNA és la RNA polimerasa. Funciona en sentit 5’-3’ i fa servir una de les cadenes de DNA, anomenada cadena codificant, com a motlle. La transcripció del DNA requereix la prèvia separació de les cadenes, per això interessa que la doble cadena de DNA no sigui massa estable. A diferència de la DNA polimerasa, la RNA polimerasa no necessita iniciador per iniciar la transcripció i donada la menor estabilitat del RNA la no requereix tampoc una fidelitat tant elevada, doncs un error no es mantindrà durant tant temps i per tant no tindrà tantes implicacions.
La RNA polimerasa és un enzim complex amb diferents subunitats que són requerides per la correcta regulació espacial i temporal, és a dir, per permetre que la unió no es doni en qualsevol regió del DNA sinó que ho faci en un lloc específic en un moment determinat. La unió es dóna als promotors dels gens, regions dels gens que promouen la transcripció i que solen tenir seqüències riques en timina i adenina formant les anomenades caixes TATA.
TIPUS DE RNA 1) RNA missatger (mRNA) RNA codificant, conté la informació de la proteïna i representa aproximadament un 10% del total.
2) RNA de transferència (tRNA) Realitza un paper fonamental en la traducció, la formació de proteïnes a partir de RNA, transportant un aminoàcid concret cap als ribosomes.
3) RNA ribosòmic (rRNA) Forma els ribosomes, proporcionant-los el mecanisme per descodificar el mRNA i sintetitzar proteïnes.
4) RNAs no codificants (ncRNA) a. RNA petit nucleolar (snoRNA) b. RNA petit nuclear (snRNA) c. Altres petits RNAs reguladors - Regulen la traducció de proteïnes  MicroRNAs (miRNAs) *Són RNA no codificants tots aquells que  RNAs interferents curts (siRNAs) no es tradueixen en una proteïna, per tant inclou tRNA i rRNA.
 Piwi-interacting RNAs (piRNAs) d. Altres RNAs no codificants (sentit i antisentit) RNA MISATGER El RNA missatger s’obté a partir de la transcripció del DNA i conté la informació per a la síntesi de proteïnes, mitjançant el procés de traducció. La seva síntesi no es dona en la forma madura sinó que pateix un seguit de canvis.
Processament del mRNA Formació del cap L’extrem 5’ del mRNA es troba modificat per l’addició d’una base purínica metilada mitjançant un enllaç trifosfat. La formació del cap és crucial per la posterior traducció del RNA i alhora és també rellevant en l’estabilitat de la molècula. Pot implicar la modificació per metilació de la primera i la segona base.
Enllaç trifosfat Poliadenilació El pas a mRNA madur implica també la poliadenilació, consistent en la formació d’una seqüència final comuna per la incorporació de múltiples adenines. Aquest procés vindrà determinat per la presència d’una seqüència específica (AAUAAA) que implicarà el tall de la cadena més endavant i l’adició de la cua poli(A).
Cleavage: divisió La creació de la cua poliadenilada és rellevant per la traducció del RNA ja que aquest adquireix una estructura força circular en aquest procés i la presència de la cua permet que una sèrie de proteïnes uneixin els seus extrems. L’absència de la cua provoca que els extrems estiguin massa allunyats i no hi hagi traducció.
Gràcies a que tots els mRNA madurs presenten la mateixa cua, és possible disposar d’una columna de sefarosa que uneixi l’oligonucleòtid complementari.
Edició del RNA Alguns RNAs poden modificar en algun moment la informació que contenen mitjançant la modificació de la seva composició de les bases. Es defineix edició com el canvi d’una base per una altra. Una cintosina, per exemple, pot patir una desaminació hidrolítica i transformar-se en uracil. Aquesta modificació pot afectar la proteïna que tradueix el RNA. Per exemple, tot i no ser molt freqüent, la modificació podria derivar en el codó UAA, un codó de terminació que implica que la transcripció s’aturi, de manera que la proteïna sintetitzada serà més curta.
Splicing Els introns són seqüències del RNA primari que no es troben mai al RNA madur i que són eliminats mitjançant el procés d’splicing. Els exons són fragments que en algunes condicions trobarem al RNA madur, però que no tenen perquè aparèixer sempre. A la pèrdua d’un exó de la denomina splicing alternatiu.
Les seqüències d’introns normalment són més grans que les seqüències d’exons i aquests molt sovint coincidiran amb els dominis de la proteïna que sintetitza el RNA. La pèrdua d’un exó, per tant, implicarà que la proteïna sintetitzada perdi la possibilitat de realitzar la funció d’aquell domini.
S’observa que el límit exó-intró conté una seqüència amb bases comunes.
El procés d’splicing del mRNA per a l’eliminació dels introns es dóna a través de la formació d’una estructura relativament plegada anomenada lariat. Està catalitzat per l’acció de ribonucleoproteïnes amb snRNA, que permeten el plegament mitjançant la formació d’un complex amb el mRNA anomenat espliceosoma o complex de tall i unió.
L’splicing consisteix en un primer atac de l’adenina al fosfat que uneix l’intró al primer exó.
Aquest és alliberat i ataca pel seu extrem 3’ el fosfat que uneix l’intró amb el segon exó.
D’aquesta manera s’obtenen els dos exons units i l’intró en forma de lariat.
MÈTODES D’ANÀLISI DEL RNA Les principals tècniques d’anàlisi del RNA són el Northen Blot i el PCR acoblat a una retrotranscripció.
Northen Blot El funcionament del Northen Blot és assimilable al Western Blot per proteïnes i el Southern Blot per DNA. Permet la detecció d’una seqüència de RNA i la quantificació mitjançant tècniques de densitometria.
En primer lloc s’aplica un augment de la temperatura fins als 60 oC per desnaturalitzar les cadenes i eliminar l’estructura secundària i a continuació es realitza una electroforesi en un gel d’agarosa per separar les cadenes en funció de la seva mida, sabent que migraran més els RNAs més curts. La mostra separada es traspassa a una membrana de nitrocel·lulosa, més accessible. A continuació s’introdueix una sonda de DNA marcada radioactivament complementària a la seqüència que s’està buscant. En funció de si la hibridació ha de ser molt específica o si no es disposa d’una seqüència exactament complementaria es jugarà amb les condicions d’hibridació alterant la temperatura, la concentració de sal i SDS. Finalment es realitzarà una autoradiografia que permetrà determinar el pes molecular de la banda.
PCR acoblat a una retrotranscripció La retrotranscripció és el procés invers a la transcripció i consisteix en la conversió del RNA a DNA mitjançant una DNA polimerasa específica dependent de RNA anomenada retrotranscriptasa o transcriptasa inversa. Requereix la presència d’una seqüència iniciadora, com l’oligo DT. És important destacar d’aquest procés que el DNA resultat d’una retrotranscripció no serà igual que el DNA inicial, doncs el RNA madur pateix un seguit de modificacions que, entre d’altres, impliquen la pèrdua dels introns.
El PCR acoblat a una retrotranscripció (RT-PCR) permet determinar la quantitat inicial de RNA d’una mostra mitjançant la duplicació del DNA retrotranscrit en condicions controlades i en l’anàlisi del nivell de DNA en cada cicle mitjançant una electroforesi en gels d’agarosa. El número de cicles que es necessitin per la detecció del DNA indicarà la quantitat inicial.
La RT-PCR permet avaluar nivells de RNA i també seqüenciar-lo mitjançant una polimerasa d’alta fidelitat que no cometi errors i sigui capaç de corregir-los si n’hi ha. També es podria utilitzar per comprovar la presència o absència d’un exó concret utilitzant oligonucleòtids específics per aquell exó.
RNA DE TRANSFERÈNCIA El RNA de transferència (tRNA) es caracteritza per tenir una estructura secundària molt definida que recorda a la conformació a del DNA i que li confereix una estabilitat major que la presentada pel mRNA al tractar-se d’una estructura força compacta.
*Nota: Important recordar que el DNA b no es pot formar si una cadena no és de DNA.
Els “loops” són fragments de cadena senzilla del tRNA més fràgils i susceptibles a l’acció de RNAses. Per protegir-lo de l’acció d’aquestes, el tRNA presenta bases modificades en aquestes zones com:  Metilinosina (mI)  Ribotimidina (T)  Dimetilguanosina (m2G)  Inosina (I)  Pseudouridina (Ψ)  Dihidrouridina (UH2)  Metilguanosina (mG) Igual que succeïa amb el RNA missatger, el RNA de transferència no es sintetitza en la seva forma madura sinó que pateix un processament consistent en l’eliminació de l’extrem 5’, l’eliminació de l’intró i en la substitució de l’extrem 3’, on s’unirà específicament un aminoàcid, pel triplet ACC.
RNA RIBOSÒMIC El RNA ribosòmic (rRNA) constitueix els ribosomes juntament amb les proteïnes. Aquestes tenen una funció bàsicament estructural mentre i el rRNA n’és el constituent bàsic i encarregat de catalitzar les reaccions.
S: coeficient de sedimentació Igual que el mRNA i el tRNA, el rRNA no es sintetitza en la seva forma madura sinó que és processat. Als ribosomes trobem tres formes diferents de rRNA amb coeficients de sedimentació diferents (a la imatge anterior, RNA en groc, taronja i verd).
RIBOZIMES Un ribozim és un fragment de RNA amb activitat catalítica. Una de les seves funcions és l’autoprocessament del RNA, que pot donar-se en presència de nucleòtids tipus 1 i nucleòtids tipus 2, que actuen catalitzant la reacció com a RNAases. Existeixen també altres ribozimes com la RNAsa P d’Escherichia Coli, que actua processant tRNA. En certes condicions els introns de Tetrahymena són capaços de continuar cadenes de RNA actuant com a RNA polimerases i catalitzant la síntesi.
Autoprocessament del RNA Tetrahymena és un gènere de protozous ciliats que s’utilitza com a organisme model en les recerques biomèdiques. El procés d’splicing (eliminació dels introns) d’alguns introns a Tetrahymena es dóna com a procés autocatalític que no requereix la presència de cap enzim, sinó simplement nucleòtids de guanina en forma de GMP, GDP o GTP. Posteriorment es va observar que l’autocatàlisi dels introns en presència de guanina es donava també en altres introns però que això no succeïa en organismes vertebrats.
En aquest procés d’splicing autocatalític els introns realitzen un plegament molt específic adoptant estructura secundària i fins i tot terciària, de manera que l’autoplegament requereix un intró relativament gran. Els introns capaços de realitzar l’autocatàlisi en presència de nucleòtids de guanina són els introns tipus 1. Hi ha també introns capaços d’autocatalitzar-se sense la presència d’aquest nucleòtid. És el cas dels introns tipus 2, que també són força grans.
L’autosplicing consisteix en l’atac del nucleòtid de guanina a l’extrem 5’ de l’intró, fent que la base quedi adherida a aquest i que l’exó s’alliberi amb un grup alcohol al seu extrem 3’. Aquest grup alcohol ataca la unió entre l’extrem 3’ de l’intró i l’extrem 5’ de l’altre exó, provocant la seva separació de manera que l’intró s’allibera i els exons queden units.
El més habitual en les espècies evolucionades, però, és que la catàlisi de la reacció d’splicing o eliminació dels introns sigui realitzada per un spliceosoma o complex de tall i unió, com s’havia vist en la descripció d’aquest procés pel mRNA.
La capacitat del RNA per autoreplicar-se i autoprocessar-se és indicador de que aquesta va ser la primera molècula en l’inici de la vida.
RNA NO CODIFICANT La majoria del RNA transcrit (97-98%) a partir del genoma humà és RNA no codificant (ncRNA) que no produirà cap proteïna. El fet que el ncRNA constitueixi la majoria del programa transcripcional en eucariotes superiors explica el fet que les espècies puguin diferenciar-se per petites variacions en les seqüències codificants. Les diferències entre les espècies, però, podrien donar-se també per variacions en el ncRNA i ser igualment importants.
Tipus de ncRNAs  Small nucleolar NRA (snoRNA) Actua modificant els rRNAs.
 Small nuclear RNA (snRNA) Forma part dels espliceosomes.
 Small regulatory RNA  Micro RNA (miRNA) Desestabilització del mRNA i repressió de la traducció.
 Short interfering RNA (siRNA) Silenciament del transposó (seqüència capaç de desplaçar-se pel genoma), formació d’heterocromatina i desestabilització del mRNA.
 PIWI interacting RNA (piRNA) Degradació del mRNA  Long non-coding RNA (lncRNA) Implicat en el silenciament transcripcional d’altres gens i en la regulació de la traducció.
Micro RNA Els miRNAs també es processen després de la seva síntesi. Un cop processats s’uneixen al RNA missatger i en funció de la perfecció d’aquesta unió actuen desestebilitzant i degradant el mRNA o inhibint la seva traducció.
Long non-coding RNA (lncRNA) Els lncRNAs afecten la capacitat del mRNA ja sigui afectant el promotor i inhibint la transcripció o afectant l’splicing i inhibint la posterior traducció.
CONCEPTES IMPORTANTS Recordar les característiques principals de diferencien el RNA del DNA.
Indicar els diferents tipus de RNAs existents a la cèl·lula.
Mencionar les modificacions que pot patir el mRNA i indicar en què consisteix cada una.
Descriure les principals tècniques que es fan servir per determinar la presència d’un RNA específic.
Citar les característiques principals del tRNA.
Mencionar l’existència del rRNA i les seves característiques principals.
Entendre el paper dels introns tipus II com a enzims (rRNAses).
Comparar les diferents funcions i estructures dels m, t i rRNAs.
Recordar l’existència d’altres RNAs no codificants i indicar la seva funció.
...