TOT Biotec RECERCA (1 unic doc.) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura Biotecnologia recerca
Profesor C.C.I.A.
Año del apunte 2016
Páginas 43
Fecha de subida 22/10/2017
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

CTRIGUERO Apunts classe BIOTEC – RECERCA (No passat a net) FARMACOGENOMICA: determinar els canvis d’expressió en mRNA i proteïna= perfil genòmic.
Quan dones una droga, algunes baixaran, altres pujaran.
La resposta aquesta es la resposta farmacogenètica Quan comparem les expressions entre cels normals i cels patològiques, les cels patològiques expressaran a alguns gens i altres no -> Gens diferencialment expressats -> es poden utilitzar com a nous FARMACOGENÈTICA: Resposta diferencial a les drogues depenent el teu backgraung genètic Depenent del polimorfisme que tu tinguis, pot ser que estigui afectant a un gent que codifica per un enzim que metabolitza una determinada droga i potser a una persona li fa més efecte i a una altre no.
FARMACOGENOMICA Intentar aplicar de manera especifica la droga que li pertany a cada persona The new way -> a cada persona la dosis i el fàrmac que li toca.
TECNIQUES PER DETERMINAR LES VERIACIONS Microchips - Uns determinen els nivells d’expressió de mRNA - Altres determinen si un determinat gen te una mutació en un determinat nucleòtid.
Els polimorfismes són mutacions. Han d’estar en un 1% de la població per que es consideri polimorfisme .
Foto: cada puntet representa un gen S’hibrida amb un cDNA verd q prové de les cels normals i després s’hibrida amb un CDN marxat vermell i que prové de les cels patològiques.
Els que queden taronja es que no han variat la seva expressió Els verds són els que s’ha infraexpressat en les patològiques Els vermells s’ha sobreexpressat GENÒMICA DEL TRACTAMENT AL MTX Per molt específic que sigui un inhibidor d’una proteïna o inclús els aliments, fan variar la teva expressió gènica.
DESENVOLUMAPENT DE NOUS FÀRMACS FENT SERVIR FARMACOGENÒMICA TARGETS IN FARMACOGENETICA - Receptors - Transportadors - Metabolitzadors - Diferències entre ètnies->Cada ètnia te polimorfismes específics GENS CLASSICS SUBJECTES A VARIACIÓ FARMACOGENÈTICA - Citocroms P450: Cyp2D6...
- TPMT: Tiopurinametil transferasa - UGT: glucuronitzen molts fàrmacs - MDR1 - ADH - DPD 1 CTRIGUERO CYP450 Serveixen tant com a activador de pro-drogues com inactivador Es determinen les variacions polimòrfiques en els CYPS En el genoma tenim 10 milions de SNP (Single Nucleòtid Polimorphism) Exemple: CYP2D6 converteix la codeïna a morfina Menys els que tenen ...
Tenim dues copies per cada gen, si aquestes dues copies son bones -> Extensive Metabolizers (dos copies normals) -> majoria de la població, metabolitzen normal Si una de les copies est a malament, nomes tenim una -> Intermediate Metab.
Poor -> menys droga per que no s’acumuli Ultra-Rapid -> es metabolitza massa ràpid i s’ha de donar més.
EL numero després del * defineix el tipus de polimorfisme que te el gen CYP2C9 Metabolitza la warfarina (que esta inhibint la VKor) i no es recicla la vit K EL cyp2c9 te variacions i s’acumula més l o menys la warfarina i el temps de coagulació serà diferent.
S’ha de determinar el polimorfismes del VKOR i del CYP2C9 per ajustar la dosis POLIMORFISMES Son mutacions No passa res per tenir-les, no tens patologies greus. Nomes es important quan et donen una certa droga Es transmet Ha d’estar en mes de un 1 % de la població Poden ser silencioses, poden ser ...
SNP-DATABASES 20/09/16 Azathioprine Depèn de les variants polimòrfiques de la TPMT -> si hi ha molta activitat TPMT no hi haurà gaire efecte citotòxic (hi haurà poca thioguanina) i al reves.
*1/*1 molta activitat -> poca hiogunina concentrada *1/*3 mitja *3/*3  mutació -> no tindria pràcticament activitat-> s’acumularà molt la thioguanina.
Per dosificar s’ha de tenir en compte tot això. (sinó et pots quedar curt, sense efecte, o passar-te (toxicitat)) 2 CTRIGUERO Irinotecan (inhibidor de la topoisomerasa) Quan es metabolitza -> SN-38 (actiu) UGT1A1 -> enzims que glucuronitzen per excretar En aquest cas no és un aminoàcid de la seqüència del CDs el que està mutat. El polimorfisme està en el promotor del gen Quan hi ha 6 repeticions és el normal Si hi ha 7 repeticions és el mutant, ja no funciona bé el promotor -> la expressió de la UGT1A1 serà més petita i la concentració de SN-38 serà més elevada.
En resum: en el cas del ironotecan, també s’ha de mirar si la persona te un polimorfisme o no ( si te 6 o 7 repeticions).
Tamoxifen metabolism El tamoxifen es metabolitza a Endoxifem mitjançant el CYP2D6 Si el CYP2D6 està inhibit per alguna raó no es metabolitzarà tan tamoxifen Antidepressius inhibeixen el CYP2D6 -> mortalitat superior S’ha de controlar quan es donen 2 o més drogues.
TEST FARMACOGENETICS aprovats per la FDA Taula diapo 3 CTRIGUERO 23/09/16 EXEMPLE SIMVASTATINA Estatines Es transportada per la SLCO2B1 Metabolisme: CYP 3A4 Les estatines són inhibidors del enzim HMGCR ( és l’enzim limitant de la via, el cricial, si l’inhibeixes inhibeixes tota la via) -> no es forma Mevalonat i Colesterol EFECTE ESTATINES - Disminueix colesterol - Antiinflamatori - Immunomodulador - Antioxidant - Antitrom Hi ha moltes statines Farmacòfor comú Al 2001 es va retirar la Cerivastatin després de 100 morts associades A partir d’aquí es va investigar i es van veure efectes adversos (miopatia, miàlgia...) 2010 FDA-> altes dosis de estatina causen miopaties.
Efectes secundaris estatines: - Debilitat - Alopècia - Dificultat per moure’s - ...
En aquest moment la gent va començar a pensar que potser estava associat a la genètica.
2008: Polimorfismes del gen SLCO1B1 rs4149056 Hi haurà: - TT - TC - CC (les dos copies mutades  més risc de patir miopaties) Els que tenen TT, al llarg del tems no acumulen miopaties Els que tenen el genotip CT comencen a acumular Però els que tenen CC, ja al mig any comencen a patir miopaties.
Els polimorfismes es degut a que tinguis les copies normals o alterades Hi ha molts polimorfismes.
Un gen son 20 kb-> cada 1000 nucleòtids tenim una variació.
Podem tenir unes 20 variacions : algunes no faran res i altres si.
4 CTRIGUERO Els rs es poden classificar segons la població: HapMap T521C (canvi de una T que esta a la posició 521 per una C) Val174Ala (això implica que la valina de la posició 174 canviï a una Alanina) El gen SLCO1B1 codifica per OATP (organic anionic transporter) -> és un transportador de les estatines al fetge Van veure que quan hi havia mutació en aquest transportador estava afectant a la transportació de ls estatines Gràfica “Time-course...
Estudi de dependència de temps quan es dona dosi de estatina sobre l’efecte de la acumulació depenent del genotip - CC: s’acumula molt més i triga molt més en baixar.
ATG: inici de la traducció (metionina) TAA: Codó de parada (tenim 3 codons de parada: TAA, TGA i TAG) Via síntesi colesterol Statins inhibeixen HMG-CoA reducatasa FarnesiPP sintasa-> pot donat Coenzim Q10 -> està involucrat en la cadena de transport d’electrons Si no es produeix Co Q10 ->n no transp electrons-> no ATP -> afecta al múscul Estatines entren a la cèl·lula hepàtica a traves del transportador OATPb1 -> amb el polimorfisme, les estatines no entren -> s’acumula al plasma-> entra al múscul i allà inhibeix la síntesi de mevalonat a partir del HMGCaA reducatasa -> baixa nivells de colesterol, de coQ10, i de ATP -> augmenten els radicals lliures Si entra al fetge després es metabolitzada per CYP3a4 i CYP2c9 i si quests estiguessin modificades per algun altre fàrmac, també afecta Si hi ha coadministració amb una altre droga pot alterar el metabolisme de les esattines 1r fer genotipat i veure si te TT, TC o CC Després tenir en compte la comedicació-< no donar altres drogues que estiguin inhibint els CYP3A4 o CYP2c9 o inhibidors del SLCO1B1 Resum: - Simvastatina es donen per rebaixar nivells de colesterol S’ha de mirar la proporció de HDL, LDL i triglicèrids .
- No tothom reacciona igual a les estatines - ....
5 CTRIGUERO 27/09 GENOTIPAT p53(gen supressor de tumors), CYP450 (metabolització F) CLIPS Fent perfils genòmics dels pacients podem perfilar millor el tractament i es pot classificar el tipus de tumor  Teràpia especifica Ampli-Chips T A G C --------------N --------------C A G C T A T C G --------------T-------------A T C G --------------A-------------A T C G --------------C-------------A T C G --------------G-------------- GTCGA GTCGA GTCGA GTCGA Chips amb la seqüencia complementària A una Tª només s’hibrida 1, el PM = Perfect Matching al complert p53 MDM2 prot que pot apantallar p53. S’expressa en càcerts No cal q observem tota la seqüencia, observem posicions HOT SPOT= aa susceptibles a mutar i baixar la seva activitat Gen chip Seq. Persona 5’ TGGG ------- CGG---------C3’ Completaries s’hibriden als chips -----------------A ---------------------------C---------------------------G+ ---------------------------T ----------- Es mira la fluorescència CGG (wild type) C G mutat: C A/G G G 3r posició * = G  per tant la persona te una C Heterozicota per aquesta mutació Té una còpia bona i una dolenta CYP450 CONCLUSIONS POWER 6 CTRIGUERO 30/09 TEMA : IDENTIFCACIO DE TERGETS TERAPEUTICS AMB ...
Analitzar per microarrays mirar el nivell que hi ha en el control i el que hi ha en el problema-> la expressió d’alguns gens haurà pujat,...
Es determinen els gens diferencialment expressats Dels que han ujat pots dir-< alguns seran la causa de la malaltia i altres seran com a conseqüència de la malaltia.
Vas disminuint el nombre de gens que poden ser i al final et queden amb una dotzena.
Genòmica funcional –>microarrays Gràfic volcano: Fold change= numero de vegades que s’expressa un gen en el problema, respecte el control Pot ser positiu o negatiu Pathway; via que esta definida, conegudes, fixes Networks: representació de relacions conegudes de tots els gens del llistat entre ells 4/10/16 SNP- ORGANIZATION HAPMAP ...
Hi ha diferents tipus de SNPs - Non-coding SNP: estan as introns i promotors -> Si afecta al promotor pot afectar a les proteïnes, en els introns afecta si afecta al splicing (zones importants) - ..
HapMap Mapa de haplotips SNPs, com son tants, els utilitzen com marcadors Podem agafar una població per exemple amb pressió alta i població de pressió normal-> anàlisi-> els de pressió alta poden tenir uns haplotips iguals Diapo Haplotypes: Mateix cromosoma-> 4 persones diferents: Haplotim es la col·lecció de posicions polimorfeades . No es la seqüencia real de gens, es posa nomes el seguit nucleòtids de polimorfismes.
Cada grup de polimorfismes defineix un haplotip.
Això serveix per catalogar la gent Tag SNPs: Etiquetes-> amb 3 posicions pots saber de quin hapoltip ets.
Genetic linkage Meiosi-> es va recombinant -> els gens que estan junts es trasmeten junts (van junts en la recombinació) fins que arriba un moment que la recombinació els separa (quan hi ha moltes recombinacions) Tindràs un SNP molt a prop del gen de la malaltia, i s’anirà trasmetent junt, però hi haurà un moment que es separaran després de moltes generacions Això es útil per fer servir els SNPs com a marcadors 7 CTRIGUERO 7/10/16 TEMA 5 – UTILITZACIÓ D’ANIMALS MODIFICATS GENÈTICAMENT Com a models de malalties humanes: - Per estudiar els mecanismes in vivo de la malaltia - Ens permet avaluar estratègies terapèutiques Obtenció de productes comercials dels animals A partir d’animals podem obtenir per exemple: insulina - Es creen biofactories animals per produir productes bioactius: factors de creixement, antitripsina, etc.
- Per fer xenotransplantaments MÈTODES D’OBTENCIÓ: · Per recombinació NO HOMLOGLA - Microoinjecció pronuclear de DNA —addicionem nou material genètic: s’injecta DNA en el pronucli masculí abans de que es fusioni amb el pronucli femení) - Transducció retroviral o lentiviral: addicionem nou material genètic: obtenim virus i dintre del seu genoma porten el gen que volem introduir i aprofitem la capacitat infectiva dels virus perquè entrin a les cels - Transferència de l’esperma-> permet que li afegim material genètic o Avantatges: s molt ràpid i molt més senzill o Problemes: pot haver-hi mutagènesi incersional (que vagi a un lloc que no convé i produeixi efectes secundaris de posició  s’ha d’analitzar 3 línies d’animals diferents) · Recombinació HOMOLOGA Va molt dirigit a un gen concret - KO: si eliminem un gen - knock-in: quan nomes substitueixes unes bases s’utilitza el mètode del Crispr/cas9 Avantatges: molt precís. Es pot fer amb moltes espècies.
·Transferència nuclear Obtenir animals clònics MODELS D’ANIMALS - Genètics: mico, ovella, ratolí, rata, peix zebra, mosca, nematode ->Corea de Huntington - Malalties humanes de tipus metabòliques o de comportament -> Obesitat - Malalties relacionades amb el Desenvolupament: granota, ratolí, peix, pollastre, mosca i nematode.
He de pensar: - Quina infrastructura tinc - Cost d’animal per any - Soques ibred: 20 generacions creuant-se entre elles - Outbred-> barreja de varies fonts genètiques - Anatomia similar - Situació patològica - Que realment poguem fer transgènics - Que puguem fer canvis al·lèlics en gran massa - Screening a gran escala - Capacitat de fer-los - Que a partir d’aquest animals tinguem línies cel·lulars de teixits específics 8 CTRIGUERO COREA DE HUNTINGTON Malaltia autosòmica (està als gens no sexuals) dominants (si tens una copia ja es produeix la malaltia) Malaltia: te una repetició trinucleotids CAG: quan el numero de repeticions passa de 35 es te la malaltia.
Com més repeticions hi ha, més greu es la malaltia i apareix abans Símptomes: - Anormalitats motores: corea, moviments involuntaris i rigidesa - Defectes cognitius: demència o depressió Apareix als 30-50 anys (com més tard apareix, mes tarda a aparèixer els efectes més greus) Sol tenir un recorregut de 20 anys la malaltia Bases moleculars de la malaltia Afecta al Estriat, al còrtex i al Hipotalem A nivell de neurona: Codifica per mes de 35 glutamines -> la proteïna resultant no es plega bé, hi ha defectes en la Ubiquitinació i afavoreix que es formin agregats  No s’aconsegueixen degradar be i queden a dins de la neurona -> resultat: Degeneració de la neurona.
Els agregats de la proteïna = Huntigntina Els agregats: - segresten factors de transcripció -> la transcripció s’altera i hi ha molts gens que no es transcriuen.
- A més s’uneixen a les proteïnes transportadores a traves dels axons -> no es transporten mitocondris, ni vesícules amb factors de flexibilitat sinàptica .. -> mal funcionament neurològica - S’uneixen a les membranes dels mitocondris -> alteren la membrana interna i interna-> alteren la cadena de transp d’electrons-> el citocrom C salta i surt cap a fora -> això es un senyal d’apoptosi -> aquestes neurones en moriran.
Models d’animals per aquesta malaltia: - ...
- ...
Hem de saber si volem posar tot el gen, el cDNA del gen, un tros, etc.
El triplet CAG esta sempre al exó 1 -> - s’ha d’utilitzar la forma Truncada - També hi ha la versió amb tot el gen - També s’ha fet Knock-in: al propi del ratolí se’ls hi posa CAG CAG CAG - La regió promotora també pot ser important Model de ratolí per l’estudi de la malaltia de Huntington 1r només van posar l’exó 1 Després van fer un knock-in -> es van obtenir animals que tenint 80 o 150 copies de glutamines al principi de tot (regió N-terminal) Estudis: - Mida Tests: - Test de desplaçament: es pinten les potes del ratolí cada una d’un color i es fa caminar per un paper-> els que tenen alterada la funció motora no tenen un desplaçament regular - Clasping: si agafes un ratolí per la cua es posa amb les potes esteses. La malaltia esta molt mes avançada en els mes vells, fan mes clasping 9 CTRIGUERO - Motilitat:(Rotarod test) Posem el ratolí en un tub i anem augmentant la velocitat de la roda fins que cau PRIMATS: - 1r s’ha fet una superovulació i tenir òvuls de femelles de 6 a 15 anys - Obtenir esperma - Transduir l’esperma (posar el gen q volem) - Injecció del esperma als òvuls - Selecció dels embrions (es seleccionen els viables i que es veu que funcionen bé) - Implantar-los en femelles estimulades hormonalment perquè s’implantin be els embrions Al final: - 30 embrions - 8 femelles Resultat: 2 monos Avantatges sobre els models de ratolí -Similars característiques als humans - Fisiològiques - Neurològics - Genètiques Canvis cel·lulars: - ...
MODELS D’ANIMALS PER ANÀLISI D’ESTRATÈGIES TERAPÈUTIQUES Es va utilitzar un ratolí transgènic que les neurones expressaven la proteïna mutada Quan ja s’havien fet els agregats (malaltia), aquest DNA que s’havia posat a dins, mitjançant doxiciclina es parava la expressió d’aquest gen Aquesta agregats que s’havien format desapareixien i la ubiquitinació també desapareixien, recuperant-se la motilitat Estratègies amb 2 tipus de fàrmacs: Tenim un animal control i un transgènic El transgènic expressa la huntigntina mutada Es fa un tractament amb 2 fàrmacs: Coenzim Q10 i Remacemida - El Coenzim Q10: es part de la cadena de transport electrònic-> capta els electrons impedint que es formin peròxids -> funció antioxidant i també facilita la funció mitocondrial - La Remacemida: es una gent anestesiant . A més ajuda a la flexibilitat de les sinapsis Tractaments: - Ela animals tractats amb 1, l’altre o els 2 alhora, tenen moltes millores Si mirem a nivell de cervell, -> la neurodegeneració no sigui tan rapida Un cop fet això es va passar a ASSAIG CLÍNIC En humans no es veien millores Altres tipus de tractaments: Ara hi ha Assaig clínic amb Liti ( )i Àcid Valproic (antiepilèptic) Els 2 actuen a nivell de moltes dianes, moltes proteïnes a nivell de cervell S’ha vist que disminueixen la Acetilació de Histones 10 CTRIGUERO També disminueixen l’acció d’una Quinasa (GSK-3)-> La quinasa inhibeix la fosforilació d’una sèrie de factors de transcripció -< quan aquest gens no estan fosforilats, la transcripció millora A nivell molecular fan desaparèixer els agregats de Hungtingtina -> ho fan a traves de 2 processos cel·lulars: - Autofàgia: procés de reciclatge de material de dins la cèl·lula - S’activa una proteïna xaperona (prot. que pleguen altres proteïnes) Tot això dona lloc a neuroprotecció - Disminueix la apoptosi Això porta a que l’activitat locomotora es torni a reactivar La ansietat, depressió... disminueix.
Encara no s’han publicats els resultats En total s’han fet 15 assajos clínics PROBLEMES: - La simulació de la malaltia en els ratolins no es igual que en humans -> en ratolins posem la construcció que posem, al cap de poques setmanes apareix la malaltia i de forma greu. En humans tarda molts anys en aparèixer i és progressivament.
- El nombre de pacients és baix -> 3-5 persones cada 100mil .
Quan es fa un assaig clínic es vol persones que no hagin estat prèviament tractades -> hi ha pocs pacients i a sobre no han de ser tractats -> dificulta que es puguin fer mes assajos.
OBESITAT Pot venir per diferents coses: - Mala alimentació - Sedentarisme - Causes genètiques - Etc.
Es un malaltia molt multifactorial Es va fer un estudi per veure els gens implicats en la obesitat.
ENU = N etil nitrosourea -> produeix mutacions puntuals -> es muten un 3-5% dels gens No va ser factible MODELS D’ANIMALS PER L’ESTUDI DE LA OBESITAT: · Mutants naturals (leptina): ratolins ob/ob i db/db -> creuant animals els hi va sortir una soca gordita -> els hi faltava la Leptina o el Receptor de la Leptina · Producció de transgènics, KO o knock-in: Ex Knock-in: es va canviar una tirosina per una serina en la posició 1138 -> conseqüència: ratolí obès que menja tota l’estona.
Les quinases que fosforilen Tyr NO fosforilen Ser i al reves Quan hi ha el canvi el receptor no pot interaccionar amb STAT3 Els animals no tenen sensació de sacietat Obesitat pot donar: - Resistència a la insulina -> Diabetis - Malalties cardiovasculars, hipertensió...
11 CTRIGUERO - Esteatosis hepàtica = acumulació de grassa al fetge -> això porta a Este hepatitis (desinflamació del fetge) -> això porta a Fibrosis -> Cirrosis o Carcinoma ANIMALS AMB OBESITAT I RESISTENCIA A INSULINA ·Utilització del sistema Cre/locP per canvis específics de teixit del receptor de ala insulina MIRKO Ratolí amb promotor del múscul unit al gen que codifica per la proteïna Cre recombinassa El creuem amb un altra ratolí que té dins del seu gen, te substituït el receptor de la Insulina -> es un LoxP D’aquest creuament tindre ratolins que si tenen els 2 al·lels -> ratolí sense receptors de a insulina al múscul  hiperglicemia, obesitat, ....
BIRKO: no te receptor de insulina al pàncrees -> continua secretant insulina tota l’estona LIRKO: ratolí que no te receptor de la insulina al fetge -> hiperglucemics, hiperinsulinemocs, obesos..
FIRKO: No receptor al teixit adipós Quan no hi ha insulina, el teixit adipós no capta glucosa i no pot emmagatzemar triglicèrids -> Aquest animal és un animal prim i viu més temps BATIRKO: Teixit adipós marró -> aquest també hiperinsulinemic, obesitat...
NIRCO: Neurones-> aquests animals tenen gana tota l’estona.
Una proteïna concreta depenen del teixit on està tindrà diferents funcions.
MODELS D’ANIMALS AMB OBESITAT + ESTEATOSIS HEPÀTICA (pot haver-hi animals que tinguin esteatosi i No siguin obesos) Pot tenir esteatosi però no inflamatori-> no anirà cap a un càncer Altres: no son obesos però si presenten esteatosi i alguns dells poden acabar amb càncer Dietes: - Grassa: pot acabar donat càncer - Molt elevada en fructosa: dona resistència ala insulina, no obesitat, estatosi però No càncer Mapa genètic de l’obesitat: S’han descobert 248 gens TERAPIA OBESITAT: Basades en: - Reducció de la ingesta - Augment de la despesa energètica Dianes sobre les que s’actua (moltes de cervell) - Receptor acoblats a proteïna G: serotonina, ....
Si es muten aquests receptors -> hi ha augment de pes i augment de ingesta -> es busquen fàrmacs agonistes, que s’uneixin al receptor i donin una resposta Lorcaserina: Agonista del receptor de la serotonina -> 5% de reducció del pes Receptor del cannabinoide -> es busquen Antagonistes-> Rimonaban (25% reducció del pes) -> Es va veure que hi va haver 2 suïcidis -> es va deixar de vendre.
Es molt difícil trobar fàrmacs que actuïn a nivell de neurona i que nomes actuïn sobre la gana - Receptors hormones nuclears 12 CTRIGUERO Estrògens -> actuen disminuint la acumulació de greixos Es busquen agonistes - Enzims: inhibició de tots els enzims de la diapo -> permeten mantindré els animals prims - Proteïnes que se secreten-> buscarem agonistes leptina Els animals transgènics s’utilitzen en els 100 fàrmacs mes venuts (Knockouts) LIMITACIONS D’OBTENIR ANIMALS TRANGENICS - Problemes alhora de mimetitzar o Que es facin aberracions cormosomals - Producció d’un KO impossible d’analitzar: o Defectes en el desenvolupament o mort embrionària - Diferencies entre el model animal i l’home.
o Ex: el ratolí KO de p53 fa uns tumors diferents que en humans - Diferent complexitat biològica o Influencia del entorn, estil de vida o Ex: malalties cardiovasculars costa molt que els ratolins les agafin - Complexitat genètica o Susceptibilitat al·lèlica 18/10/16 OBTENCIÓ DE PRODUCTES COMERCIALS A PARTIR D’ANIMALS: - - BIOFACTORIES: o Per fer productes terapèutics o Productes amb major valor nutricional Són per animals de granja Millora de races per: o Per que siguin donants d’òrgans -> fer xenotrasplantaments (òrgans entre sp diferents Animals que siguin respectuosos amb el medi ambient Ex: porcs que no facin purins BIOFACTORIES Es van iniciar cap al 1985 S’han obtingut molts animals sobretot amb hormona de creixement Piscifactories de salmons amb hormona de creixement -> els fan créixer més i mes ràpid per posar-los a la venda.
1988 fins avui: primers productes farmacèutics = gene Pharmig: - Factors de coagulació - Additius nutricionals - Altres enzims metabolisme 2002 fins ara: moltes més especies Actualment knock-out de ....
APLICACIONS ·BOVINS TRANSGÈNICS Modificació llet per tenir més valor nutricional Van clonar unes vaques amb + copies de beta-caseina i ...  produïen més proteïna menys lactosa i menys colesterol (això no s’ha comercialitzat) 13 CTRIGUERO ·PORCS amb més Omega-3 a la seva carn Debat si hi aquesta carn ha de ser per consum o no PRODUCTES TERAPEUTICS Primer animal: Producció de alfa 1-antitripsina La Ovella Tracy produïa la proteïna recombinant (fàrmac) a la llet pel tractament de l’emfisema i la fibrosi quística Aquesta proteïna encara no està admesa al mercat La primera que ha sigut comercialitzada: Antitrombina III Esta produïda per llet de cabra transgènica  produeixen uns 2 grams per litre de llet.
Aquesta sí que ha estat acceptada per la EMEA i esta comercialitzada des del 2006 Antitrombina III: glicoproteïna amb 4 glicosilacions i 3 ponts disulfur Una de les coses que s’ha de controlar és que tingui els 3 ponts disulfur perquè sinó estarà mal plegada ( i el mateix amb les glicosilacions) Es va indicar per 2 indicacions terapèutiques: - Bypassos coronaris amb resistència a la Heparina - Casos de Trombosis quan hi ha una deficiència hereditària de trombina (per evitar trombosis a les venes) Des de que va començar les biofactories, la llet normalment és el sistema és fàcil de produir el producte S’ha produït: - Antitrombina III - Antitripsina - Factor IX - ....
Quan fem animal transgènic hem de pensar d’on l’obtindrem -> la llet s’utilitza perquè pots fer una gran quantitat de producte i que es pot Purificar bé Necessitem: - Seguretat del producte: que sigui un producte eficaç - Que el producte NO alteri la fisiologia del animal Ex: per produir eritorpoietina, a les vaques els hi produïa inflamació a les glàndules mamaries... -> el producte estava ple de productes d’infecció.
Ara es fa en conills i porcs - Que tinguem un mètode per purificar el producte (Si és més fàcil purificar-lo de la llet, de la orina, de la sang...) (En 1 any: 5400 vaques produeixen 100.000kg Alb humana 4500 ovelles -> 5 kg α-AT 100 ovelles -> 100 kg Ac monoclonal 75 cabres -> 74 kg Antritombina III 2 porcs -> 2kg factor de coagulació IX (el rendiment és molt elevat) Producció d’anticossos policlonals: En aquest cas es parla de Animals transcromosomals S’inserta un cromosoma artificial humà -> animals tindran seq.de les cadenes pesades i lleugeres S’obtenen anticossos contra proteïnes humanes Problema: el cromosoma que s’afegeix no es manté al llarg de les generacions (al cap de 3 generacions desapareix) 14 CTRIGUERO AVANTATGES BIOFACTORIES: - Necessitem menys tecnologia que per cultiu cel·lular Per fer cultiu necessitem moltes cèl·lules en cultiu i necessitem: incubador, oxigen, CO2, temperatura, humitat adequades.. confusions molt cares de mantenir. I a mes els nutrients perquè les cels creixin.
Tenir una animal en una granja és més fàcil - - Menys costos de producció i manteniment o Línia cel·lular costa 600-900 milions€ o ....
- ...
PROBLEMES: - Identificar l’espècie mes adient per la producció del producte: o Costos: conills mes barat mantenir-lo i es reprodueixen mes ràpid o Gallines –Z Ous o Depenent com siguin les modificacions post-traduccionals ho haurem de fer d’una manera o de l’altre - Els transfons es modifiquen per mecanismes de splicing del RNA de forma diferent depenent de les especies -> no funcionarà - Inestabilitat del transgen al llarg de les generacions -> a vegades no es transmet Risc que afecten al producte: - Productes associats a patògens: microorganismes, bacteris, virus, prions. (si l’animal no està en condicions saludables) - Contaminació de proteïnes i de DNA del animal -> serà important com ens desfem d’aquestes proteïnes (sobretot per via intravenosa) - Producte poc bioequivalent o eficaç: o Diferent patró de glicosilació de proteïna o Reaccions immunològiques (el nostre cos no la reconeix) Directrius de la FDA: - Monitoritzar molt be la salut del animal - Validar la constricció del gen introduït (veure que el gen introduït era el que volíem) - Caracteritzar la proteïna recombinant - Manteniment del animal durant generacions - Utilització d’animals de països lliures de prions (Nova Zelanda) - Mantenir els animals en condicions higièniques XENOTRANSPLANTAMENTS Els trasplantament son molt importants Hi ha mes pacients que esperen òrgan que òrgans Estratègies per obtenir òrgans: - Cèl·lules mare - Òrgans artificials (silicona->es fan créixer sobre la matriu cèl·lules del pacient) - Xenotrasplantament Problema mes important xenotraspalnt: rebuig Quan es fa un xenotrasplantament apareixen diferents tipus de rebuig: 15 CTRIGUERO - - 1r rebuig hiperagut -> Ag-Ac Molt ràpid.
2n: Rebuig vascular (al cap d’unes hores) -> com quan es fa transfusió de sang: intervé la resposta del Complement C Si els primers s’han mantingut amb immunosupressors, apareix el Rebuig Cel·lular -> es desencadenen les cèl·lules T que ataquen el nou òrgan A més pot haver-hi Atac del òrgan sobre l’hoste Des del punt de vista de animals transgènics s’ha fet: Animals transgènics amb modificació de proteïnes relacionades amb el Complement Es fan trasplantacions en monos per mirar els dies que dura Avui en dia sobre els monos ja no funciona gaire bé Com tenir mes èxit: Superant problemes immunològics: - S’han creat porcs i ovelles transgèniques sense l’enzim alfa 1,3 gaacto.... -> evitem rebuig hiperagut No s’ha aconseguit massa Prevenció de patògens Porcs tenen infeccions de virus que a ells no els hi afecten però quan aquests òrgans passen a una altre espècie, aquests retrovirus es tornen actiu i provoquen malalties Compatibilitat del òrgan donador: s’utilitzen els porcs com a donador perquè són animals que es reprodueixen bastant ràpid, la seva fisiologia es semblant a la nostra i els seus òrgans son d’una mida mes o menys igual.
ASPECTES ÈTICS - Preservació de la biodiversitat i bioseguretat.-> Aquest nou mètode de fer animals transgèniques no ens preserven la biodiversitat - Patiment: els animals es consideren que no son subjectes morals (no tenen drets ni deures) però si que son objectes morals (els hem de tractar bé) - Eutanàsia: Tots els experiments que es fan al lab han d’estar aprovats per una normativa.
Quan fem experiment s’ha de fer un procediment que es farà als animals, que els hi donarem, quina serà la forma de matar-los, etc.
Està molt controlat - Extrapolació de resultats o Provocar una malaltia que no pateixen de forma natural -> potser no podem extreure les conclusions que volíem (no tots els animals presenten les mateixes respostes, etc.) o Confinament als laboratoris: engabiats, estrès, no exercici...
o Efectes secundaris dels tractament 16 CTRIGUERO 21/10/16 TEMA 6 – TERÀPIA GÈNICA Teràpia gènica: introducció de material genètic exogen a les cels del individu per corregir malalties hereditàries o adquirides (infecció vírica, càncer..) Tenim un gen que esta mutat o que no funciona bé -> li introduïm un gen normal perquè ens doni la proteïna que volem.
Metodologia: Es podria fer tant a les germinals com a les somàtiques A les cels germinals està prohibit -> No estem fent teràpia sobre un individu concret. Sinó que també per les futures generacions.
Ruta de transferència 2 tipus: - Ex-vivo: tenim un teixit que no funciona bé, treiem el teixit, disgreguem les cels i les posem a créixer en una placa -> les amplifiquem i les tractem: li posem el gen perquè funcioni bé -> les tornem a introduir al individu - In vivo: quan no es pot fer el ex-vivo 2 maneres: o Amb un vector que ens distribueixi el gen per tot l’organisme o Utilitzant un vector que ens faci anar el gent nomes on el necessitem (al teixit concret) Això dependrà del tipus de malaltia.
Sistemes de transferència: - Vectors vírics - Mètodes físics o Injecció de DNA nu o Electoporació o GEnne gun - Mètodes químics o Liposomes o Polimers...
· VECTORS VÍRICS Vectors: - Adenovirus - Retrovirus - ....
Els virus son un dels vectors de transferència d’elecció per molts dels assajos que s’estan fent ara VECTOR VÍRIC: te capacitat de transferir el gen terapèutic dins de la cel, però no te capacitat replicat iva = es capaç de fer entrar el DNA dins de la cèl·lula però després és incapaç de formar nous virus.
AVANTATGES: - Tenen elevada transferència - Gran expressió gènica INCONVENIENTS: - Immunogenicitat - Risc patogènic o Integració del gen: si el gen que posem amb el virus, s’incerta dins del genoma de la cèl·lula, aquesta integració és al atzar (no la podem controlar) -> si s’incerta en un lloc que està en llocs de silenciament, no s’expressa; si s’incerta al mig d’un altre gen, esta treient un gen que podia ser útil, o pot ser que faci que s’activi un oncogen - A vegades no es pot assolir una cura permanent 17 CTRIGUERO El DNA se’n va al nucli però no s’integra. Mentres esta allà dona lloc a la proteïna, però quan es divideix moltes vegades la cèl·lula, el degrada.
Tipus de vectors vírics: - Retrovirus: - ...
· RETROVIRUS: Es caracteritzen per tenir genoma de RNA Cicle vital: infecta cel-> el RNA fa copia en forma de DNA-> DNA fa complementaria -> S’integra dins del genoma de la cèl·lula -> fa que la cel produeixi les proteïnes i Se li treuen els gens de la encapsidació i es posa el gen terapèutic NOMÉS infecten cèl·lules que s’estiguin dividint Virus recombinants: S’incerta el gen però després ja no fan virus Necessitem que es faci un virus amb el genoma que volem Sempre es conserva els LTR perquè es pugui integrar al genoma del hoste Utilitzem cels especials: li hem introduït els gens gap, pol i env -> les cels com tenen genoma de virus i proteïnes de la càpsida-> es fan virus Aquest virus, son reconeguts per la cel, infecten la cel, alliberen el genoma del virus (RNA que conte el gen terapèutic) > es fa copia de DNA-> complementaria -> s’incerta al genoma de la cèl·lula  es comença a transcriure la funció del gen.
NO es fan més virus.
AVANTATGES: - Son molt eficient transferint DNA Ex-vivo - Persistència el gen terapèutic (perquè s’integra) - Poca immunogenicitat LIMITACIONS: - Mida del gen: nomes hi caben 7 o 8 kb -> si es mes gran no hi cabrà dins de la càpsida i no s’encapsida.
- No es poden produir moltes quantitats - Esta limitat a cèl·lules en divisió (si no hi ha divisió no es pot integrar) -> No el podríem fer servir en neurones - Perill de mutagènesis insercional (com s’integra al atzar pot passar qualsevol cosa) Primer Cas: Nena amb immunodeficiència severa combinada Adenosina desaminasa Es van agafar Limfòcits, es van trasnduir ex-vivo Després de 10-12 vegades -> millora clínica Multiplicació del cultiu i reintroducció en sang · ADENOVIRUS DNA de doble cadena de 35kb (pot encabir gens més grans) On el cDNA puc posar el gen Adenovirus recombinants Tenim cèl·lules empaquetadores que tenen part dels gens del virus -> li introduïm un plasmidi amb el gen terapèutic i un altre plasmidi amb un tros del gen del virus -> amb tot es fan els adenovirus recombinants.
Gen terapèutic entre els ITR 18 CTRIGUERO Un cop tenim les partícules recombinats, el DNA NO s’integra, es queda al nucli en forma de episoma -> s’anirà formant la proteïna AVANTATGES: - Molt eficients in-vivo - Els produïm en gran quantitats - NO s’inserten a les cèl·lules - Infecten tant cèl·lules en divisió com cèl·lules que no es divideixen Les cels que costa més d’infectar són els adipòcits LIMITACIONS: - Son molt immunogènics - L’expressió dura poc perquè ni s’incerta al DNA de la cels Cas: Deficiència en ornitina trascarbamilasa La deficiència provoca un augment d’amoni conduint a la mort Primer assaig -> va morir · VIRUS ADENOASSOCIATS (AAV) Son virus molt petits Problema: si no estan associats a una infecció vírica amb adenovirus o herpes virus, son incapaços de completar el seu cicle vital.
DNA de cadena simple -> poden infectar cèl·lula i el genoma es queda integrat a la cèl·lula i ja està. No te la maquinaria necessària per fer nous virus.
Necessita proteïnes helper que li donen adenovirus o virus del herpes Quan fem el virus recombinant posem e nostre gen entre ILR Els AAV es poden fabricar amb molts tipus cel·lulars Tranfectar amb ITR i gen terapèutic i li hem de posar tots els gens que tenia el virus dins del genoma per encapsidarlo.
El HELPER la porta la cèl·lula empaquetadora i ja obtenim els AAV sense haver de infectar amb adenovirus Nomes es poden fer in vivo AVANTATGES: - Son molt segurs, virus no patògens i vectors sens cap gen viral (no ens produeixen malalties) - Infecten cèl·lules en divisió i no divisió - Baixa immunogenicitat - La expressió in vivo es molt a llarg termini.
LIMITACIONS: - Només es pot traduir gens petits (de 4,5 kb) - Alguns baixa expressió Teràpia gènica contra l’obesitat Volem cremar greixos a nivell de fetge per disminuir la obesitat  Utilitzem la CPT1A (entra AG a la mitocòndria per oxidar-los) Si mantenim el gen tota l’estona funcionant, anirà cremant tots els greixos Si hi posem el gen salvatge, la proteïna que es produeix es inhibible pel malonil-CoA 19 CTRIGUERO Van fer un mutant que no és sensible al malonil-CoA (sempre funciona) 20 CTRIGUERO Ratolins: - Proteïna control (verda fluorescent) -> gordos - CPT1A Mes prims - PCT1A mutada -> MOLT més prims Ara es fan experiments amb el gen humà per veure si funciona igual.
Tractament de la deficiència de LPL 1r tractament aprovat per la comissió Europea per malaltia genètica -> Amb AAVs La LPL distribueix els AG perquè entrin al fetge i siguin oxidats, ... (permet la entrada dels AG dins de les cels) Els malats deficients amb aquesta proteïna-> tenen Lípids a la sang Punxades a les cames amb aquests virus -> al cap de un més els malalts tenien el sèrum completament clarificat (sense lípids) Gràcies a això ara es treballa molt més amb teràpia gènica El tractament costa 1 milió € ALTRES VECTORS VÍRICS - Herpes símplex (HSV): molt gran -> pot causar mes alteracions - Lentivirus: Derivats del virus del SIDA El genoma s’integra (perillós) Van bé per cels nervioses 2 proteïnes especialment interessant: tat i rev -> per intentar disminuir les infeccions per al virus del sida.
28/10/16 TEMA 1.7. TERAPIA CEL·LULAR: CÈL·LULES MARE I CÈL·LULES iPS. ÈTICA DE LA TERÀPIA CEL·LULAR TERAPIA CEL·LULAR Quan el tractament és a base de cèl·lules - Transfusions sanguínies - Transplantament de moll d’os - Trasplantaments d’òrgans - Etc.
Ús de les cèl·lules mare (consideracions ètiques) O cèl·lules mare induïdes (iPS) CÈL·LULES MARE: Són pluripotents: es capaç de diferenciar-se a qualsevol cèl·lula -> es pot arribar a obtindré una representació de tots els tipus cel·lulars del organisme Font de cèl·lules mare -> quan es comença a desenvolupar l’embrió A mesura que avança la embriogènesi, es van adquirint diferenciacions i apareixen els diferents tipus cel·lulars.
21 CTRIGUERO Hi ha cèl·lules mare de teixits esquelètic (ex: múscul esquelètic-> fibra muscular), però quan s’han de reparar aquestes fibre, els músculs tenen cels satèl·lit -> es diferencien i fan nou teixit.
Una altre característica de les cels mare es que son immortals.
Les cels normal, somàtiques, estan programades per viure un determinat temps Les cèl·lules de línia germinal són immortals-> son les que passen a les següents generacions.
Font de cèl·lules mare: primeres etapes del embrió -> genera consideracions ètiques Utilitzant les cèl·lules mare tenim diferents teràpies: - Transpalntamnet de cèl·lules mare i que allà es diferenciïn - Transplantament de cèl·lules madures (re-emplaçament - Trasplantament de cèl·lules que han estat modificades per produït una determinada substància (combinació de teràpia gènica (modificació del genoma) i teràpia cel·lular) Cels mare: en el moment del Blastocist També pot haver-hi problemes de rebuig.
Yamanaka Va poder obtenir cèl·lules mare a partir de cels somàtiques Arreglem tema ètic i rebuig.
REPROGRAMACIÓ NUCLEAR: Experiments de Gurdon-> amb cels de granota Va agafar nucli cel somàtica d’intestí -> el va posar a un oòcit que li havia tret el nucli Al passar el nucli en un entorn embrionari, l’entorn citoplasmàtic li aportava una sèrie de factors que podia fer que el nucli pogués tornar a ser pluripotent -> te un altre cop tota la informació genètica (les cels somàtiques tenen tota la info però només tenen com una part activada) Amb això es va veure que hi ha una sèrie de factors per induir el canvi Ovella Dolly-> primer mamífer clotat per aquest mètode (nucli de cèl·lula epitelial) FUSIÓ CEL·LULAR Van aconseguir veure que no nomes els embrions poden re programar cels somàtiques Cels mare-> nucli gran i cromatina poc compactada Cel somàtica: nucli petit i la cromatina esta altament condensada en unes zones determinades (hi ha gens que no estan actius i no els necessitarà-> els empaqueta i els guarda) Quan es fusionen -> a les 48 veiem que hi ha canvis en la morfologia dels nuclis: el nucli procedent de la cel somàtica ha augmentat de mida i la compactació de la cromatina és menor Es una altre manera de veure la reprogramació que esta tenint lloc.
Uns altres van veure que per la diferenciació es necessita uns “Master regulators” -> son uns gens que estan com per sobre dels altres i que desencadenen una casacada de diferenciació.
22 CTRIGUERO Hi ha uns gens que son necessaris i suficients per desenvolupar una sèrie de cels.
Una altre branca d’investigació: Generació i manteniment de la pluripotència Es va identificar un factor: LIF que és el que fa que es mantingui la pluripotència, que no es diferenciïn.
FALTA 4/11 8/11/16 UTILITZACIÓ DE LES iPSCs - Teràpia cel·lular en pacients per malalties amb deficiències clares d’alguns tipus cel·lulars. (sobretot malalties monogèniques Exemples: o Deficiència de ADA (Nens burbuja) o Duchene o Síndrome de Down o Etc.
- Screening per drogues - Com a models de malalties humanes (estudis preclinics) Exemples: Tractament de infart de miocardi El cor es dels pocs músculs que te garantit el reg sanguini sempre. Cor te metabolisme Oxidatiu Les cels dels cardiomiòcits son molt sensibles a la variació d’oxigen, en el moment que falta les cels ho noten i es moren -> necrosis en el cor Fa que el cor no bategui bé-> problemes en la contracció ...
Si l’infart es petit-> anticoagulants Infart important -> trasplantament del cor Reparació del teixit cardíac amb iPSCs En cultiu de cels mares la primera diferenciació que es veia era a cardiomiocits Cels pacient-> fer-les créixer-> reprogramar les cels iPSCs Son cultius complexos Per diferenciar-les a cardiomiocits: - Formació dels cossos embrionics incubant amb Sèrum bovina fetal i amb citocines - Cultivant les cels amb cels d’estroma que produeixen endotelina 2 - Créixer les cels amb cultius de 2 dimensions. També s’han d’afegir les citocines.
Gran part dels cossos embrionics es diferenciaran a cardiomiocits -> s’han de purificar abans d’implantar-los en el cor Esquema diapo “Etapes en la regeneració...” · Utilització de les iPSCs en Drug discobery Per millorar la diana 23 CTRIGUERO Quines son les rutes que estan malament Screening d’alta densitat -> per torbar caps de sèrie També podem utilitzar el sistema iPS per malalties de caire epigenètic i factors mediambientals Malalties genètiques: - Cels del malalt-> reprogramar-les iPS -> Malalties degudes a agent mediambiental o causa epigenètica: - Partim de persona sana-> agafem cels que no estiguin afectades-> les passem a cels iPS - Exposant les cels abans de la transformació a cels iPS No garaneitx que la cel final que obtinguem tingui la malaltia El que hem de fer es canviar quan s’exposa la cel a agents que li causen la malaltia: - Donant sa -> obtenir les iPS-> exposar-lo al agent ambiental -> aquí si que tenim les cels reprogramaes i diferenciades amb la malaltia Depenen del que es vulgui fer, es fan els canvis d’una manera o altre.
Què és un bon control? Hi ha diferents possibilitats: - Malaltia deguda a un gen determinat-> agafem cels mare i introduïm canvi genètic Problema: majoria de malalties no són monogèniques - Podem fer iPS de pacients que n tinguin la malaltia i que si i introduir les canvis. Tindríem cels iPS d’un pacient que te la malaltia i la arreglem per tenir la sana i tenir el control (al reves que la d’abans) - Quan tenim mutacions (Knock in) -> canviem un aa d’una proteïna per exemple Això portar-ho a clínica es difícil per costos - Fer mosaic amb cels que tinguin la malaltia i cels sanes del mateix pacient - Buscar lo mes semblant respecte la genètica del pacient: iPS d’un familiar proper.
Medicina personalitzada: Podem agafar cels somàtiques d’un pacient -> diferencialres a tots els tipus cel·lulars que es poden -> Dispositius d’ata densitat per buscar fàrmacs que reparin les cels anòmales del pacient ->Analitzar no nomes els efectes terapèutics sinó també els efectes secundaris Seria tenir el “Celloma” de cada persona Podríem arribar a personalitzar el tractament per cada pacient 24 CTRIGUERO 15/11/16 INFORMÀTICA I DISSENY DE FÀRMACS Quimio informàtica-> tecnologia de la info i descobriment de fàrmacs Biologia estructural Docking QUIMIOINFORMÀTICA Tractament mitjançant informàtica de dades químiques S’ha de fer perquè l’univers químic es immens Compostos químics aïllats: uns 10 milions Possibles: infinites El mes basic: donarlis un nom a les molec, poder-les identificar 2 classificacions.
- Nomenclatura lineal-> quins àtoms hi ha i comes conecten entre ells o Nom->Ex: Aspirina o IUPAC o SMILES o InChI: o InChI Key - 2D i 3D: tenim una línia per àtom -> dona les coordenades X, Y, Z o SDF o PDB SMILES: Cada element és una sola lletra, els H no cal que els diguin C  CH4 C – C = CC  CH3 – CH3 C=C  CH2=CH2 C#C  CH= CH CCCC(O)CC C1CC(O)CC1 Majúscules: Alifàtic Minúscules: Aromàtic c1cnc(O)cc1 25 CTRIGUERO COMMON TASKS Crear BASE DE DADES Cada Base de Dades s’especialitza en algo diferent - Base de Dades de fàrmacs - Compostos que es poden comprar - Compostos que no tenim però que es poden fer - Etc.
El que tenen en comú es que els compostos estaran 1 sola vegada i els hi donen propietats a aquests compostos (fisicoquímiques, si son o no reactius, etc.) Base de dades: Tenim programa informàtic =intèrpret químic (podem treballar amb les dades químiques) A partir d’això podem fer: - Cerques per semblança - Predir propietats - Similaritats - Docking - Anotacions - ....
Cada base de dades te un objectiu diferent Per qualsevol base de dades química lo important es que poguem buscar per estructura química Tenim: - Recerca subestructural -> buscam una molècula que contingui la estructura X que tu dibuixes - Recerca de semblança Un cop ho has dibuixat es converteix en SMARTS-> interroga C  Tinc un C alifàtic ? SMARTS te mes coses que Smiles i es pot fer cerca de coses mes sofisticades Per exemple: Jo vull que tingui N o O alifàtics  [N, O] N o O i que estigui en un anell de 5 i que estigui a la vegada en 2 anells  [N, O; r5; R2] Serveix per buscar coses especifiques Altres cerques: - Per SEMBLANÇA Es fa amb FINGER PRINTS Ha de ser Molt ràpid Hi ha diferents tipus de Fingerprints Un tipus: Qüestionari de preguntes que li fa a la molècula: - Contens àtoms de 4 anells - Tens nitrògens connectats a 1 O i 2C - Tens carboni unit a 2 N i 2 O - Etc.
26 CTRIGUERO La molècula passa a ser de 0 i 1: ..010010011000....
Llavors es mira el Coeficient de semblança: A: 0 1 0 1 0 0 1 1 B: 0 0 1 0 1 0 1 1 AND: 0 0 0 0 0 0 1 1 -> Nab=2 (tenen el mateix) OR: 0 1 1 1 1 0 1 1 -> tens un 1 en A o B? 6  S= 2/6= 33% Tenen semblança 33% Aquest mateix mètode també ens permet fer altres coses: Clustering Per maximitzar la info-> es selecciona un subconjunt de molècules que sigui divers, que no s’assemblin entre elles.
Agafem 5 milions de molècules que podíem comprar i s’ajunten les que s’assemblen entre si Llavors compres 100 mil molècules que abarquin molècules diverses.
Propietats basades en Normes: Normes de Lipinski - Calcular el es molecular, el LogP i el nombre de ponts d’H Mètodes QSAR SAR=relacions estructura-activitat QSAR-> quantitatiu Fas formula matemàtica que relaciona activitat biològica o propietats fisicoquímica en una sèrie de descriptors de la molècula.
Ex: el LogP=0,3 + 0,2(carbonis aromàtics) + 0,3 (C alifàtics) – 0,2(nombre de N) Per fer això: S’ha de tenir dades experimentals Pensar la formula Ajustar els paràmetres per tal de que ens dongui la millor correlació entre les dades experimentals i les calculades.
Molt de moda perquè: - Hi ha moltes dades publiques gratuïtes (PubChem) - Aquestes relacions matemàtiques cada vegada es poden fer mes complicades i mes ben fetes.
RECURSOS INFORMATICS - PubChem - ChEMBL: dades publicades en articles - SureChEMBLE: conte dades de patents - UniChem - DrugBanck - ZINC-Focus: Catàlegs de coses que es poden comprar 27 CTRIGUERO 18/11/16 P + L  PL Keq Un complex es forma o no es forma depenent de la energia lliure Amb molt poc canvi d’energia lliure ens canvia molt la constant de dissociació.
Si una interacció es bona, ens donarà energia lliure La energia lliure es la combinació d’un seguit de processos: · Canvi entalpic: Quan tens el complex Lligand-Proteïna -> fa interaccions -> això serà favorable Abans de que es formes això tindríem la proteïna en aigua i el lligand en aigua -> per poder fer la interacció hem de treure l’aigua que tmb estava fent interaccions favorables : seran desfavorables · Conformacionals: La proteïna i el lligand no tenen perquè tenir la mateixa forma quan estan lliures i quan estan amb el lligand-> el canvi de conformació te un cost energètic I al lligand li passa el mateix Cada canvi conformacional tindrà un cost energètic.
· Entropia ^G= ^H – T^S Quan tenim lligand -> el lligand fixa la proteïna i la prot te menys graus de llibertat -> cost entropic Al lligand li passa el mateix, en agua diverses conformacions i mes graus de llibertat i en proteïna menys.
Entropia desfavorable El que ens ho compensa es l’aigua -> Passa d’estar confinada a estar a fora i estarà mes desordenada.
Entropia positiva Energia lliure com es resultat d’aquests termes, calcular-la de manera exacte es molt difícil.
Podem predir si una molècula s’unirà o no, però no podem dir si s’unirà amb X valor.
Tindre la estructura de la proteïna és extremadament útil - Veiem com encaixa el lligand: quines interaccions fa...
El que no podem dir son les kcal que ens dona per exemple un pont d’H, però si que podem veure que es fa un pont d’H.
Quantitativament no es tant útil però per Prediccions QUIALITATIVES si que va molt bé.
ESTRUCTURES 3D DE LES PROTEÏNES Cristal·lografia de raig X -> hem de tenir un cristall (problema: les proteïnes no volen formar cristalls) Es pot arribar a trobar condicions adequades perquè quan concentres la proteïna, formi cristalls, però és molt difícil.
Proteïnes mes fàcils de cristal·litzar: - Mes rígides - Termostables - Acostumades a estar a altes concentracions Les mes difícils: - Les que no volen estar en altes concentracions soles (proteïnes de membrana) 28 CTRIGUERO Quan tenim el cristall, li fem passar pel mig un feix de Raig X-> els Raig X difracten -> tenim patró de difracció.
Perquè això funcioni necessitem raig X de alta intensitat.
El patró de difracció es degut a la interacció del raig X amb el electrons -> es veu densitat electrònica.  moltes limitacions: - No hi ha H: perquè tenen 1 electró i no donen casi senyal - Si tens un NH2 i un =O -> no saben a quin costat esta cada un - Es veuen les H2O però podia ser un Na+ o un NH4+ (tenen els mateixos electrons) Pet tenir senyal hem d’aconseguir formar un cristall Si no hi ha ordre, no ho veuen i potser hi ha zones que no et donen senyal.
 LA posició dels nuclis No es la observada experimental, el que s’observa és la densitat electrònica Les interaccions que es veuen en el cristall poden ser diferents un cop esta en aigua.
Cryo-elecctron microscopy Microscopi electrònic-> sobre una placa deposites varies copies de la teva proteïna -> les proteïnes es queden en diferents posicions Amb el microscopi electrònic fem foto de 2D -> tenim moltes imatges en 2D -> rotació -> tenim imatge 3D Es te resolució dels àtoms -> permet veure orientació de lligands i com s’orienten Quan tens estructura experimental-> aprofitar-ho al màxim possible Si no tens estructura: MODELAT PER HOMOLOGIA: Es conserva millor similitud per seqüencia que per estructura.
Tenim proteïna que ens interessa i no tenim seqüencia Sabem que hi ha una prot semblant de seqüencia que si que sabem la estructura -> fem un model de la nostre proteïna Per sota d’un 30% d’homologia ja no es compleix.
Per fer això: 1r hem de trobar estructura que serveixi de motlle -> farem alineaments de la nostre seqüencia amb totes les seqüencies de les prot que tenen estructura Trobarem el motllo Després substituirem la cadena principal de la motllo per la nostre.
Després hi ha modelat específic dels Loops (son mes diferents) Es posen les cadenes laterals Finalment: fase de modelat de mesurar la qualitat -> mirar energia i torbar conformacions de mes bona energia.
Es fa diverses vegades i ens quedem amb el model que sigui millor.
Per sota de 30% hi ha problemes i per sota del 20% NO es pot utilitzar.
Altres que no s’utilitzen tant: Models teòrics basats en el coneixement Joc de plegar prot Ab initio La deixes evolucionar amb un mètode de dinàmica molecular -> nomes s’ha fet amb prot petites 29 CTRIGUERO Un cop tenim estructura: - Identificar llocs d’unió - Predir com s’uneix el lligand - Si tenim estructures de diversos lligands podem identificar els punts mes importants -> Farmacòfor.
- Tamissat virtual -> tens milió de compostos i estructura proteïna -> et busca quins compostos encaixen amb la proteïna.
Coses a tenir en compte: - PBD: no para de créixer, hi ha moltes estructures o Tipus de plegaments -> ja no se n’ha trobat cap nou des de 2008-> ja es coneixen tots -> potser no tens la teva proteïna, però per homologia es fàcil trobar un bon model.
Recursos: - PDB 22/11/16 DOCKING Ensamblatge molecular Hi ha diferents tipus de docking - Disseny de fàrmacs: lligand-oproteïna - Docking proteïna-proteïna Tenim una molècula i volem saber si s’uneix a una proteïna i com s’uneix.
Parlem de Puntuacions -> resposta qualitativa L’altre component d’un programa de docking: Si ja se com son les interaccions i si es molt bo i molt dolent Ha de ser capaç d’agafar el lligand i provar com interacciona amb la proteïna Maneres de puntuar: FUNCIONS DE PUNTUACIÓ EMPIRIQUES Volem predir la Energia lliure d’unió Ho calculem fent hipòtesi raonable-> energia lliure d’unió es una suma de diferents coses: - Quan formes un lligand-proteïna -> perds entropia -> Hi haurà un terme que serà constant i serà desfavorable - L’energia lliure ha de correlacionar de manera lineal amb el nº de ponts d’H (mes ponts d’H més bon complex) o Tendència lineal (3A) o Tendència angular (zona que acceptem) - El mateix amb el ponts salins - Com mes superfície en contacte, més interacció, mes energia.
- Nº d’enllaços rotables -> cada un tindrà un cost.
-> Donarà una energia d’interacció aproximada.
30 CTRIGUERO Volem ser capaços de treballar amb molts lligands, ens interessa que sigui ràpid no acurat.
Després el programa ha de explorar de quina manera el lligand encaixa i puntuar-la Espai en el que busquem: - Cavitats Ens quedem amb la cavitat més gran (més superfície) En Espai 3D-> posició X, Y, Z El lligand pot tenir diferents orientacions: θx, Oy, Oz Això nomes es vàlid quan tenim cos rígid El lligand i la proteïna es poden moure Llavors l’algoritme al espai de busqueda, a mes del espai 3D, tenim la conformació de lligand Si el lligand te 4 enllaços rotables tindrà: α1, α2, α3, α4 Proteïna tmb es mou: proteïnes poden moure cadenes laterals i cadena principal-> pot afectar la unió del lligand La majoria dels complexes lligand-proteïna -> hi ha aigües que es queden al mig Hi ha lligands que desplacen aquestes aigües i altres que no.
Solució: o be ignorar-ho i treballar amb una sola conformació O be seleccionar varies conformacions conegudes (1,2 o com a màxim 3) que representin diferents estats vàlids.
Conformació proteïna  Conf1, Conf2 A cada una de les possibles solucions tindran un valor d’energia Es fan servir Algoritmes Stochastic Comences des d’un punt i exploren al espai per torbar el mínim d’energia.
Si tornes a començar des de la mateixa posició anirà trobant mínims d’energia Això es fa per torbar el mínim absolut d’energia - Monte-Carlo: Anem explorant al espai Si canvi d’energia es menor (de -3 a -5) -> ho acceptem Si el canvi d’energia es molt alt: de -5 a +10-> no ho acceptarem - Algoritmes Genètics En contes d’explorar un a un, es fa per poblacions Per torbar el de mínima energia.
Limitacions: - Puntuació es aproximada, tindrà errors - Espai conformacional de la proteïna mal representat Encara que es aproximat, es útil en cerca de nous fàrmacs Exemple: Hsp90-HTS 31 CTRIGUERO En resum: - Es estratègia viable-> manera de trobar compostos actius - Cost-> MOLT mes barat. Sobretot en lla part dels experiments, hem de comprar molt menys compostos, ...
o Estalvi de molt temps o Organitzacions que no podrien fer identificacions d’una altre manera, ho poden fer.
- És INPERFECTE! -> s’ha d’anar amb compte.
25/11/16 TEMA 8 – ENZIMS COM A AGENTS TERAPÈUTICS PROTEÏNES RECOMBINANTS D’INTERES TERAPEUTIC Tecnologia del DNA recombinant-> ofereix obtenir fàrmacs nous que podem dissenyar de manera fàcil, econòmica i fàcil o be millorar fàrmacs que ja teníem.
Fàrmacs de tipus proteïna Les proteïnes recombinants: La primera que es va utilitzar va se la Insulina recombinant humana Ara hi ha múltiples: - Anticossos monoclonals - Factors de creixement i hormones - Citocines - Proteïnes de fusió - Vacunes - Factors de coagulació - ...
ENZIMS TERAPÈUTICS: Importància relativament modesta Els enzim estan en posició baixa, amb aportació del 2% en la economia Dins dels enzims terapèutics hi ha 3 enzims que son els mes importants: - Cerezyme - Pulmozyme - Fabrazyme C i F: per malalties que afectes els lisosomes EL C: s’utilitza per la malaltia de Gaucher F: per la malaltia de Fabry Pulmozyme: DNAsa pel tractament de la Fibrosi Quística.
Any 2012 es va aprovar per primer cop l’us d’un fàrmac per fer teràpia gènica i és un enzim modificat.
Es un derivat de la lipoproteïna lipasa humana (LPL) S’utilitza pel tractament de la deficiència de LPL que te conseqüències greus: hipercolesterolèmia familiar, tendència a infarts de miocardi, morts prematures...
32 CTRIGUERO ENZIMS: FINS TERAPÈUTICS S’apliquen en certs tipus de malalties: - Malalties genètiques on hi ha dèficit d’un enzim concret o Gaucher o Fabry o Pompe o ...
- Problemes a nivell de coagulació - Càncer o Enzims que tenen activitat anticancerosa o Enzims activadors de les pro-drogues= Compost químic que per si no presenta toxicitat i en un lloc concret per una activitat enzimàtica es transformat en la droga.
- Antibiòtics, antifúngics.. en situacions d’infeccions - Cremades a nivell de la pell : per eliminar el teixit que s’ha de retirar.
TIPUS DE TERÀPIES AMB ENZIMS Els enzims es caracteritzen per presentar elevada especificitat de substrat.
També son específics per reacció: activitat catalítica 5 Estratègies: 1. Enzims activadors de zimògens -> en teràpia trombolitica Zimogen= precursors inactius del enzims -> perquè passin a ser actius se’ls ha de tallar (hidrolitzar) almenys un enllaç peptídic.
2. Teràpia de reemplaçament d’enzims a. Malalties lisosomals b. Insuficiència pancreàtica, problemes digestiu 3. Eliminació de metabòlits no desitjats a. Asparaginasa: enzims que presenta activitat antitumoral b. DNAsa: per fibrosi quística 4. Inhibició d’enzims que destrueixen la matriu extracel·lular a. Tractament de càncer: Metal·loproteases de la matriu.
5. Activadors de prodrogues.
Alguns enzims: DIAPO A partir anys 90-> primers aprovats a USA Aquests enzims són Fàrmacs orfes: s’han desenvolupat per curar patologia que o be tenen prevalença molt baixa (malalties rares) o bé malalties en població sense recursos.
VIES D’ADMINISTRACIÓ Dependrà de la patologia i del que vulguem aconseguir · Problemes gàstrics-> via oral Teràpia trombolitica-> intravenosa perquè tingui efecte sistèmic Etc.
TIPUS: - Enzim mes o menys natiu purificat (d’origen humà o no). Natives= tal qual - Enzims recombinants: clonar les prot d’interès, expressar-les en bacteris per obtenir-les en gran quantitats...
- Introducció de material genètic en les cèl·lules que expressi la proteïna d’interès.
També per interferència de RNA (siRNA...) per deixar d’expressar cera prot.
33 CTRIGUERO 1. ENZIMS ACTIVADORS DE ZIMÒGENS: TERÀPIA TROMBOLÍTICA Trombos: formats per proteïnes fibroses -> sobretot fibrina Tractament es basa en activar un sistema activador del plasminogen que s’encarrega de degradar la fibrina dels coàguls Plasminògen es el precursor inactiu d’una proteasa= ZIMOGEN Quan aquest plasminogen s’hidrolitza un enllaç peptídic, passa a ser Plasmina =forma activa A nivell terapèutic es fan servir activadors d’aquest sistema: - D’origen eucariota: o tPA: Activador del plasminogen tissular (existeix a nivell fisiològic) o uPA: Urocinasa o activador de plasminogen de tipus uroginasa (tmb fisiològic) - D’origen bacterià: o Estreptocinasa o Esrafilocinasa Utilitzar un o l’altre depenent de: - Pacient - Cost: els bacterians son mes econòmics - Efectes adversos i severitat - Especificitat dels fàrmacs per atacar fibrina del coàgul i no altres proteïnes.
- Reactivitat immunològica : bacterians més immunogenicitat - Estabilitat in vivo Regulació de l’activació del plasminogen DIAPO Tant si hi ha dèficit d’activació, com si hi ha excés d’activitat de plasmina tindrem problemes greus.
Activadors fisiològics: tPA i uPA Inhibidors: - A nivell de plasminogen: PAI-1 - A nivell de plasmina: alfa2-Antiplasmina tPA -> mes dirigit a activar la plasmina quan hi ha problemes relacionats amb coàguls uPA-> funció mes amplia i esta relacionada amb processos que es necessita proliferació cel·lular, eliminació de les cels, remodelació vascular, tissular...
PAI-1: inhibeix els activadors. La seva concentració en sang es baixa Alfa 2-antiplasmina: fre per un excés de plasmina-> Si hi ha molècules que queden lliures, poden atacar fibrinogen lliure o altres coses.
Plasminògen: Proteïna monocatenaria de 791 aa Ponts disulfur 5 dominis kringle -> implicats en la unió d’altres prot com activadors, inhibidors, fibrina, cèl·lules.
Activadors tPA i UPA-> trenquen enllaços peptídics - > trenquen enllaç entre Arg561 i Val 562 Centre catalític del enzim te 3 aa importants: serinproteases - Ser 741 - Asp 646 Triada catalítica que permet que als erina sigui especial- catalítica - His 603 34 CTRIGUERO Serinproteases: Es catàlisi mixta: catàlisi àcid –base i catàlisi covalent (mecanisme ping-pong) tPA: Cadena polipeptídica de 530 aa amb la seva triada catalítica Pots di sulfur Presencia de residus que es poden Glicosilar i Fucosilar -> importants per treure tPA de la circulació Se sintetitza a les cels de l’endoteli vasculars en resposta a la presència de factors de coagulació.
Estructura: 5 dominis: des de amino terminal a carboni - Finger: - EGF - Kringel K1 - Kringel K2 Ajuden a eliminat el tPA de la circualció - Domini C- terminal amb activitat serinproteasa Perquè el tPA pugui actuar sobre plasminogen, es necessari que els 2 estiguin units a fibrina La Plasmina degrada enllaços peptídic, en el cas del tPA degrada entre Asp 275 i .. ->i passa a ser tPA de 2 cadenes 29/11/16 Producció i comercialització de tPA Es coneix des dels anys 40 El 1980 es va descobrir que cèl·lules de melanoma el secreten en gran quantitat 1982 es va clonar i Excreció en cels CHO, derivades de ovari de hàmster 1987-> llicencia -> nom comercial: Alterplase Vida mitjana limitada: 4-6 min -> problema Es van fer formes mutants variants: - Reteplace: variant expressat en E.coli -> NO està glicosilat el producte resultant Te una deleció gran que afecta l’extrem amino-terminal -> vida mitja més gran: fins a 15 min Problema d’aquesta proteïna: entre els dominis que hem deleccionat esta el dominifinguer-> que esta implicat en la unió a fibrina - Tenecteplase: En Eucariotes, línia CHO Presenta 3 mutacions: o Eliminar la glicosilació en un residu: Substitució de Asp per Gln o Glicosilació en Asp103 o Presencia d’aa Aminoàcids en posicions 296 a 299 -> implicats en l’inhibidor PAI-1 No presenten grans avantatges, si que facilita el tractament del pacient (menys aplicacions) 35 CTRIGUERO UROCINASA Te funció molt més amplia Es també una serinproteasa Sintetitzada en monòcits, macròfags, fibroblasts..
També es secretada en grans quantitats per algunes línies tumorals Funcions: Implicada en processos on hi ha moviment cel·lular i que es necessita destruir la matriu: - Proliferació, angiogènesi - Coagulació - Cicatrització - Etc.
Es troba en plasma, orina Forma clàssica purificada: a partir de orina humana -> prourocinasa (forma inactiva) = zimògen -> s’activa un cop al plasma Trobem més d’una forma: - 54 kDa - 33KDa Es proteïna estable Amb vida mitja més gran que el tPA: 10-20 min També mitjançant tecnologia del DNA recombinant -> cels de ronyó PROUROCINASA: 3 dominis: - GFD-> implicat en la unió a un receptor específic uPAR - KRINGLE - Centre catalític-> serinproteasa-> te triada catalítica Quan és processada, mitjançant proteases, com la plasmina , passa a Urocinasa El tall és per K189 – I159 Es pot tallar per altres llocs i donar la forma de 32 kDa o la de 40kDa -> tenen la capacitat catalítica però tenen baixa vida mitja xq no tenen el domini GFD El domini GFD sona la estabilitat.
Un dels processos en els que participa: · Migració cel·lular Actua per 2 vies: - Via proteolítica: uPA activa plasmina i la plasmina degrada altres prot de la matriu extracel·lular.
També actuen les metaloproteases de la matriu = MMPs -> paper important degradant matriu extracel·lular. També son activades per aquesta via - Via NO proteolítica: interacció de uPA amb el seu receptor que hi ha a la superfície de les cels. -> activa el receptor i desencadena casacada, senyalització intracel·lular: MAPK, JAK 36 CTRIGUERO 37 CTRIGUERO ESTREPTOCINASA Activadors d’origen exogen Es proteïna d’origen bacterià de diverses soques de Streptococcus Es molt econòmic i senzill sI hi ha Ac vida mitja de 20-30 min Prot monocatenaria, 3 dominis diferencials: alfa, beta, gamma -> necessaris! La Estreptoquinasa tal qual no te la activitat catalítica, la adquireix quan forma complex amb el plasminogen.
Extrem amino terminal és essencial!! Utilitzar cDNA que codifica per la Estreptocinasa -> control d’un promotor en un plasmidi-> E.coli La prot se secreta al medi.
També s’ha produït en llevat Problemàtiques: - Immunogenicitat-> utilització terapèutica limitada a pocs dies - Reaccions al·lèrgiques S’han fet derivats químics i mutacions puntuals per reduir aquests efectes - Complex estreptocinasa-.. pot actuar sobre altres proteïnes com fibrinogen lliure ESTRAFILOCINASA Produïda per S. auerus Elevada selectivitat a plasmina o plasminogen Es mes petita que estreptocinasa També s’expressa de forma recombinant en E.coli Vida mitjana més petita que estreptoquinasa Reduir immunogenicitat acoblant Polietilenglicol.
Mecanisme d’acció molt similar a estreptoquinasa No es activa si no esta unida a plasminogen Hi ha d’haver una mica de plasmina activada al medi perquè es pugui activar el complex.
TEMA – TERÀPIA DE REEMPLAÇAMENT D’ENZIM (ERT) MALALTIA DE GAUCHER Malaltia hereditària, de caràcter autosòmic recessiu Es molt poc freqüent Es genera pel dèficit del enzim glucocerebrosidasa Es homodimer Quan hi ha deficiència-> s’acumulen els glucolípids en se’ls fagòcits mononuclears S’acumula: glucosilceramina, glucosilesfingosina Cèl·lules de Gaucher= fagocids mononuclears - Melsa - Ganglis limfàtics - Fetge - Medul·la òssia 38 CTRIGUERO Manifestacions: anèmia, trombocitopènia, hepatoesplenomegalia i problemes ossis (osteoporosi) La malaltia es pot classificar en 3 tipus - Tipus I: la mes freqüent i menys severa-> el SNC no es veu pràcticament afectat = No neuropàtica Tipus II i III-> si SNC - Tipus II: Neuropàtica aguda - Tipus III: Neuropàtica crònica (menys greu u menys severa que la II) S’han descrit mes de 300 mutacions que provoquen la malaltia en cers graus: - Mutacions sense sentit - Delecions - Insercions - Splicing - Etc Tot això deriva en que tenim poca o nul·la activitat del enzim glucocerebrosidasa Dèficit pot ser que afecti seqüencia codificant de proteïna o be que siguin mutacions de la estabilitat de la proteïna Diagnòstic: en base a la simptomatologia -> activitat del enzim, seqüenciar el genoma.
Fins els anys 90 no hi havia teràpia especifica per combatre aquesta malaltia Als 90 va aparèixer teràpia de reemplaçament d’enzims que es fa servir per la de Tipus I Al any 64 es va suggerir la possible teràpia 74 es veu que son molt importants els llocs de glicosilació 91: aïllat de placenta però es necessitaven massa placentes pel tractament d’un any 94: en cel de CHO-> en grans quantitats Presenta mutació en posició--- millor estabilitat Elevada afinitat pels macròfags...
Després apareixen altres productes amb modificacions Substrats alternatius contra la malaltia de Gaucher Que no es formin glicolípids Inhibeixen de la glocosil ceramida sintasa A nivell pràctic no representen millora Una altre via en experimentació: GBA s’introdueix en vector víric ...? · MALALTIA DE FABRY Prevalença baixa Afecta cromosoma X Absència d’activitat suficient de Alfa. Galactosidasa A -> Acumulació de glucoesfingolipids ...........
39 CTRIGUERO FALTA DIA 2/12 13/12/16 ELS ENZIMS COM AGENTS TERAPEUTICS (III) METAL·LOPROTEASES 24 descrits en humans Tmb s’anomenen metaloproteases de a matriu Son proteases, degraden proteïnes de la matriu extracel·lular Tenen un àtom de Zn que es essencial per la seva activitat Hi ha residus importants Es família amplia de membres Degraden enllaços peptídics Cadascú ataca a les proteïnes que toca Tenen acció molt potent-> degraden matriu proteica del espai extracel·lular.
Participen en els processos on aquesta degradació sigui important: migració, proliferació, angiogènesis...
ex: desenvolupament ossi involució uterina després embaràs, cicatrització ferides.
ESTRUCTURA Es poden classificar en diferents grups: - Arquetipiques: clàssiques Extrem amino termina: domini que es pèptid senyal que dirigeix cap a la proteïna Després domini: pro-pèptid. -> després passa a ser actiu En el centre catalític hi ha io de Zn Domini centre catalític-> després linker ->Domini HEMPEXINA= domini implicat en el reconeixement de substrats -> Tmb implicat en la inhibició dels enzims per factors tissulars Aquest grup es divideix en subgrups: o Colagenasa o ....
Reconeixen proteïnes diferents.
- Gelatinases: Tenen un domini extra: Fibronectina-> confereix una variació en el substrat que reconeixen les gelatinases Estan especialitzades en degradar estructures de col·lagen ja pre-degradades, gelatina, i altres estructures.
- Matrelisines: No tenen Hemopexina-> no son inhibibles pel factor tissular - Activables per furina Furina: transforma el zimogen a proteïna activa.
La furina es la que talla el pro-pèptid Subdividides en grups depenent dels dominis i..: o Secretada (com les altres) o Hi ha 3 grups que no es secreten, que queden encarades cap la exterior:  Transmemranade tipus 1  Transmembrana de tipus 2  GPI anclades a la membrana.
40 CTRIGUERO Hi ha moltes patologies associades a metal·loproteïnes Son diana important pel tractament futur.
Els tumors es caracteritzen per que els cels van proliferant i tenen capacitat invasiva, tmb provoquen angiogènesi i desplaçar-se, fer metàstasi En aquest processo les metaloproteases estan sobre expressades en els tumors-> van degradant matriu extracel·lular.
Tmb estan associades a altres patologies: - Vasculars - Inflamació, - Etc Les cels tumorals que estan al límit del tumor, si tenen les metaloproteases, ho tenen mes fàcil.
METALOPROTEASES: Majoria se secreten , algunes estan retingudes a la membrana i algunes estan a nivell citosòlic ACTIVACIÓ DE MMPs La seva activitat ha d’estar molt regulada.
Quan , com i on han d’estar actives Es regula a diversos nivells: - Transcripcional, expressió gènica - Un cop s’ha transcrit, estabilitat del missatger i expressió de microRNA - Compartimentalització un cop sintetitzada la proteïna - Activació del proenzims (son zimògens) - Inhibició enzimàtica: inhibidors tissulars específics de MMT (TIMP-1..) El pas de Proenzim a Enzim actiu Mitjançant proteases (tripsina, plasmina o altres MMT) Hi ha altres processo que poden permetre un cert grau ‘activació del enzim: - Agents químics: reactius del S, oxidants o detergents -> bloquegen cisteïna i s’activa l’enzim La activació de les proteases es pot fer a 3 nivells: - Pèrdua del domini pro pèptid - Modificació de la cisteïna del pro-pèptid (si esta present) - Modificació al·lostèrica · Control transcripcional: Factors de transcripció: quan s’estimulen certes vies de transcripció de senyals Fonamentalment vies lligades a factors proinflamtoris com: IL-8, TNFalfa, etc.
A nivell patològic es perd la regulació En un tumor podem trobar que les cels estan sobreexpressant MMT -> passem de expressió basal (no patològic ) a una expressió constitutiva, independent d’aquestes vies d’activació.
->Regulació epigenètica: modificacions de histones, canvis en el patró de metilació del DNA...
41 CTRIGUERO · Activació del proenzims ProteaseS: plasmina, altres MMT Especies reactives del oxigen (ROS) ...
La seva actiació activa el feed-back negatiu - Evitant que el plasminogen passi a plasmina - A nivell de plasmina un cop activada Regulació complexa · ANGIOGÈNESIS: Les MMT molt elevades que ajuden que proliferi el tumor i la angiogènesis, també son generades per cels no tumorals i que estan obligatòriament al voltant del tumor Son línies cel·lulars que participen en els processos de inflamació: monòcits, macròfags, cels endotelials....
Una MMT important: MMT-9 Es molt potent Produït per leucòcits durant processos inflamatoris Actua a nivell del espai extracel·lular, degrada certes proteïnes i afavoreix que altres factors proteics quedin lliures Entre aquests factors trobem: FGF-2(factor de creixement de fibroblast) i VEGF (factor de creixement endotelial vascular) Son 2 factors molt angiogènics.
Les generades pels NEUTROFILS son mes actives, sent la mateixa proteïna Perquè els neutròfils expressen nivells baixos del inhibidor TIM-1 -> potencia molt l’efecte de ala mMT-9 En les altres línies cel·lulars, si sesta sobreexpressant MMT-9, tmb es sobreexpressa mes TIM-1 -> es contraresta.
uPA (uroquinasa) -> implicada en angiogènesi, proliferació, etc Actua a traves de 2 vies ESQUEMA DIAPO MMP son promogudes per la uroquinasa TERÀPIES Utilitzar MMP com a dianes pel càncer Bloquejar el receptor de uroquinasa - Post traduccional: un cop ja esta sintetitzada la proteïna-> amb Ac...
- Evitar que se sintetitzi la proteïna del receptor de la uroquinasa (post-traduccional) o Oligos antisentit o Mecanismes de siRNA, shRNA MM-9 com a diana i receptor de uroquinasa com a 2a diana Per silenciar la expressió es va utilitzar un constructe bicistrònic que expressa simultàniament shRNAs per reduir la expressió de la MMP-9 i un segon que inhibeix la uPAR Es va aconseguir certa regressió dels tumors 42 CTRIGUERO ENZIMS ACTIVADORS DE PRODROGUES EN LA QUIMIOTERÀPIA CONTRA EL CÀNCER Si volem eliminar cels tumorals i volem utilitzar prodroga que serà droga tòxica mitjançant els enzims - L’enzim s’ha d’expressar nomes a nivell tumoral - Injectar la prodroga i on esta l’enzim es transformarà a droga Requeriments enzims: - Enzim no sigui d’origen humà-> nomes en ces tumorals i la droga nomes estarà en els tumors (hi ha certa immunogenicitat9 Si son humans ha d’estar molt clarament demostrat que no s’expressa en les cels no tumorals, o a nivells mínims.
- L’enzim ha de tenir poder elevat catalític i que a mes no sigui inhibit ni per la droga ni per la pro-droga.
S’ha d’expressar suficientment on vulguem que estigui l’efecte.
Requeriments de la prodroga.
- Ser un bon substrat> que nomes es reconegui per enzim que ens interessa - La diferencia de citotoxicitat entre la prodroga i la droga: prodroga no tòxica, droga molt tòxica.
- La droga ha d’actuar a nivell intracel·lular - Es desitja que la droga activa pugui difondre i eliminar les cels adjacent-> vida suficientment llarga com per que actuï tmb a les del voltant Però no tant llarga com per que arribi a altres part, s’ha de trobar l’equilibri Estratègies d’administració: ADEPT: enzim covalentment lligat al Ac -< Ac reconeix Ag específic de cels tumorals La droga un cop activada ha de passar al espai GDEPT: s’administra el cDNA que codifica per aquell enzims, sota el control dun promotor, amb el vector que sigui Expressaran aquest gen i en presencia de la prodroga (ha de travessar la cel) Es una teràpia suïcida gènica Requeriments per ADEPT - El complex enzim-Ac selectiu a cels canceroses - Prodroga ha de se soluble en el medi aquos on l’enzim treballarà - La droga ha de ser ràpidament i eficientment transportada al interior de les cels canceroses.
Teràpia GDEPT - El gen que codifica per l’enzim esta encapsulat per vectors virals (se l’anomena VDEPT) o amb vectors no virals (liposomes, quitosan, etc.) - GPAT: cDNA i promotor -> es vol potenciar l’expressió d’aquest gen en les cels tumorals-> en les seqüencies promotores s’afegeixen promotors de gens que se sap que estan sobrexpressats en aquelles cels tumorals.
- La prodroga ha de travessar membrana cel·lular i es intracel·lular ment convertida a droga - Tenen efecte espectador molt important.-> efecte local inflamatori que Promou efecte sistèmic contra e tumor.
43 ...

Comprar Previsualizar