TEMA 2 - TÈCNIQUES DE CULTIU (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Ampliació biologia cel·lular
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 22/11/2014
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

Èlia Riubugent Camps [ABC] TEMA 2 TÈCNIQUES DE CULTIUS 1. Condicions físiques 1.1 Temperatura d'incubació És la mateixa que hi hauria al cos de l'organisme original. Es necessita constància més que exactitud. ↑T⟶cells mortes.
↓T⟶Conservació Mamífers: 36.5-37º Aus: 38.5º Poiquiloterms: Temperatura ambient- -2º Excepcions: Cèl·lula del testicle: 32º Cèl·lules epidèrmiques de ratolí: 33º 1.2. pH El pH fisiològic es troba de 7,0-7,7 (mitjana de 7,4). Per saber el pH del cultiu fem un control amb indicador de pH amb roig de fenol.
1.3. Constitució fase gasosa CO2: té un paper important en el manteniment del pH. Es dissol en H2O en funció de la T. A 37º es dissol i es produeix ↑protons de manera que ↑acidificació del medi (↓pH) -Incubadores a 37,5º, fem entrar-hi CO2 per mantenir les cells en una atm del 5-10% de CO2 (depenent de la línia cell). Es sol fer servir el 5% perquè la majoria de cells del nostre cos no estan en contacte amb aquest aire i ens ajuda a mantenir el pH a 7.4. Per mantenir la concentració adequada tenim sensors i s'injecta CO2 constantment.
-Embrions preimplantacionals tenen fòbia a l'O2. ↓%O2 en lloc seu hi fiquem N2 per mantenir el 5% d'O2 [Hem de tenir en compte de les cells respiren, per tant ↑[CO2] si tenim el cultiu tancat. ↑[CO2] es dissol en H2O⟶↑acidesa(↓pH)⟶Mort cel·lular]. La bomba Na+/H+ afavoreix l'acidesa. Si tenim un cultiu obert⟶↓[CO2]⟶cultiu bàsic⟶(↑pH), tampoc ens interessa. Si fem servir un incubador, tenim un tap amb una membrana que permet l'intercanvi de gasos, permet regular el pH.
També es fiquen tampons perquè absorbeixin protons.↑↑↑proliferació⟶tampó 4saturat⟶↑acidesa ex: bicarbonat (NaHCO3-CO2),fosfats (HPO3 -H2PO4) i HEPES (tòxic ↑[ ] però + eficient)] 1.4. Pressió osmòtica 1.5. Tipus de substrat⟶ Sempre es troba en una solució isotònica (hipertònica⟶encongiment; hipotònica⟶explota) _Cells en suspensió, derivades de la línia hematopoiètica, alguns tumors, gàmetes...
_Cells adherides al substrat que pot ser: • Semi-sòlid (amb matriu de col·lagen, agar, gelatina) • Sòlid (sense matriu ex. vidre, plàstic) _Cells en cocultiu, necessiten créixer sobre una capa de cèlls nodridores, inactivades (no divisió). ex.
cells mare embrionàries. Subministren GF i nutrients.⟶↑↑car 1.6 Tipus de flascons -Plaques de petri -Flascons, (producció) -Multiplaques(=multipou) (rèpliques) -Sang -↑producció ⟶↑superfície amb microcarriers...
rollerbottles, fons arrugats, Èlia Riubugent Camps [ABC] 2. Condicions biològiques 2.1 Solucions salines equilibrades Solució que conté sals en les [ ] que ens interessen. Són isotòniques i ens permet que les cell estiguin durant un temps màxim de 4h sense créixer, però els hi permet viure. ⟶medi de transport. També es fan servir per rentar les cells [tema 1] -Algunes contenen roig de fenol.
i 2.2 Medis de cultiu • funció: substituir l'ambient que tenien les cells dins l'organisme. (són nutritius) depenent de quin tipus de cell sigui es trobarà en un lloc o altre de l'org ⟶ diferent ambient⟶medis de cultiu especialitzats segons tipus cell. Tenen capacitat tamponadora i són estèrils.
Els classifiquem segons la seva composició: Amb sèrum (líquid amb hormones, GF,etc): A)Medis definits.
- AA que la cell no te per sintetitzar proteïnes. Cisteïna, tirosina i glutamina no es poden sintetitzar in vitro.
- Addicionem enzims, contingut de sals⟶mantenir el potencial de mb (Na, K, Ca per adhesió cell unions, Cl) - Bicarbonat ⟶ tampons - fosfat ⟶ síntesi ATP -glucosa, galactosa, fructosa ⟶font energètica -Antibiòtics -Suplements orgànics • Sèrum: part ↑↑cara. Ve de fetus de vedella (FCS), boví, cavall... ↑petit animal ⟶↑↑GF⟶sèrum de fetus i no sèrum de cavall.
No hi ha 2 sèrums igual⟶barregen molts L de sèrum de fetus diferents⟶LOT, on tot és igual.
Tenen inhibidors de proteases. D'un lot a un altre hi poden haver petites variacions. Conté lípids.
És una font de contaminació. S'inactiva a 56º, 30'.
• Composició desconeguda.
Sense sèrum 2.3 Medis químicament definits -Factors d'adhesió -Hormones⟶diferenciació cell -Nutrients -Inhibidors de proteases -GF -Proteïnes i poliamides • Composició coneguda i concreta⟶reproduïble, no tots els tipus cell poden fer servir aquests medis.
2.4. Matrius 3D Amb les matrius tridimensionals, les cell creixen en volum i no formant una monocapa. Es pot fer amb materials sintètics o naturals(fibronectina, col·lagen).
3. Contaminació, el material ha de ser estèril.
- Fongs. Contaminació visible. Mala manipulació de l'investigador.
-Llevats provinents de pa, cervesa...
-Bacteris medi es torna àcid en poc temps. Mala esterilització material. Medi turbulent.
-micoplasmes, poc visible. El cultiu es torna "boig", canvia de forma o te comportament estrany.
-virus, poc visible. Recorden als micoplasmes.
• Mètodes d'esterilització _Tèrmics⟶material termoresistent Calor sec⟶forn Pasteur⟶170-180º ~2h Calor humit⟶autoclau⟶1atm, 120º, 30' _No tèrmics⟶material termolàbil Radiació ⟶ UV, Filtració ⟶0,2 m Èlia Riubugent Camps [ABC] [Campanes o cabines de flux laminar, podem posa-hi les mans amb guants. Un motor fa circular l'aire per un filtre⟶esteril] 4. Criopreservació • És la preservació de les cells a -196º • Motius: -Evitar _Deriva genotípica per inestabilitat gènica _Senescència _Transformació _Inestabilitat fenotípica _Contaminació o contaminació creuada.
-Estalvi de temps i material -Necessitat de transport -Mal funcionament aparells • Congelació ràpida -Es formen cristalls dins i fora de la cell • Congelació lenta (-1ºC/min) -Es formen cristalls fora -Equilibri osmòtic⟶sortida H2O -↓cristalls interns Representa un estalvi de temps. Mètode de transport.
• Crioprotector DMSO o Glicerol -Entra a la cell a favor de gradient⟶supervivència del 80% cells -↓punt de congelació (interacció entre molècules d'H2O i el glicerol) -↓formació cristall de gel interior cell !Són un producte tòxic, no s'ha de fer servir dés d'un 10% • Nalgene "Mr. Frosty" -Isopropil alcohol - -80ºC -Congelació lenta • Criotubs: resistents a la congelació amb nitrogen líquid.
• Descongelació -Ràpida a 37º amb agitació constant⟶↑vel. descongelació 5. Quantificació • Número de cells _càmera Neubauer⟶contar cells. La part lila és un petit pou, color blau cel el cubre. Es deixen entrar les cells per capil·laritat. El volum que ocupin les cells serà de 10^-4mL, fem servir la formula per calcular-ho.
Es delimita una zona i si saps que amb 10^-4 tens 50 cells, en 5mL tindràs xmilions.
-Blau de tripa, colorant que entra a les cells amb mb en mal estat.
_comptador electrònic, conta cells vives i mortes _citometria de flux, aparell capaç de comptar cells tenyides.
-marcatge fluorescent DNA, es fan passar les cells per un capil·lar prim perquè només passi una cell i es compten quantes n'han passat. Es fa servir un producte que si les cells son actives, els seus propis enzims tallaran la molècula i emetran de color verd.
Iodur de propidi⟶tenyeix de color vermell.
-Ac per detecció de Ag • Activitat cell -síntesi DNA -Síntesi proteïna ...