Tema 5 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Tècniques Instrumentals Avançades
Año del apunte 2013
Páginas 9
Fecha de subida 17/10/2014
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Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 UNIDAD 5: FLUORESCENCIA INTRODUCCIÓN Algunas moléculas, una vez absorbida la radiación electromagnética, son capaces de emitir luz. La fluorescencia es uno de estos fenómenos. En la mayoría de casos no hay recuperación radioactiva, ceden la energía en forma de calor haciendo que la disolución se caliente de forma inapreciable.
La fluorescencia es un fenómeno que tiene muchas aplicaciones en bioquímica y permite el estudio de moléculas mediante la marcación con fluorocromos o fluoróforos. Es muy usual encontrar fluorescencia en sistemas de anillos como por ejemplo el triptófano. Esto lo podemos utilizar para determinar la concentración de las muestras.
FUNDAMENTOS Para poder entender la espectroscopía de fluorescencia tenemos que tener en cuenta que una molécula en su estado fundamental (S0) puede absorber energía hν y pasar a un estado excitado (S 1), realizando una transición electrónica entre dos estados singletes (ΔS=0).
Los electrones se distribuyen de forma apareada en los orbitales moleculares en su estado fundamental que es denominado como singlete, S0.
Cuando una molécula absorbe un fotón y tiene lugar una transición electrónica, el electrón puede conservar su espín o variarlo. En el primer caso, la molécula se queda en un estado excitado singlete (S1) y en el segundo, en un estado triplete (T1).
En singlete los electrones tienen espines opuestos, en cambio en triplete tienen el mismo sentido.
En condiciones normales, un electrón ocupa el nivel vibracional de menor energía dentro de su estado fundamental, y la transición electrónica puede tener lugar a cualquier nivel vibracional del estado excitado. La transición desde el estado excitado hasta el fundamental se denomina como desexcitación.
1 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 El electrón en su regreso al estado fundamental, puede seguir varios caminos que vemos representados en el diagrama siguiente (diagrama de Jablonski). Podemos agrupar los caminos en: 1) Formas de desexcitación no radiativa a) Relajación vibracional o transiciones verticales. El electrón se mueve entre estados vibracionales de distinta energía dentro del estado excitado.
b) Transición entre estados vibracionales isoenergéticos o transiciones horizontales entre dos singletes.
2) Formas de desexcitación radiativa a) El electrón en el nivel vibracional de mínima energía del estado excitado realiza una transición entre dos estados singletes con emisión de radiación luminosa y pasa a un nivel vibracional del estado fundamental. Fundamento del fenómeno de la fluorescencia.
b) El electrón en el nivel vibracional de mínima energía de un estado excitado triplete pasa al estado fundamental realizando una transición entre los estados triplete – singlete con emisión de radiación luminosa. En este caso, se trata del fenómeno de la fosforescencia.
A temperatura ambiente, la relajación vibracional dentro del estado excitado se produce muy rápidamente, del orden de -12 10 s.
Los cromóforos que son capaces de emitir radiación luminosa fluorescente se denominan fluoróforos. Es importante destacar que en el fenómeno de la fluorescencia se emiten fotones de menor energía (menor longitud de onda) que los absorbidos en la transición electrónica. Esto es debido a que parte de esta energía se ha disipado en calor en los procesos de relajación vibracional no radiativos. En general, aquellas sustancias que emiten radiación electromagnética se designan con el nombre de luminiscentes.
El espectro de excitación de un fluoróforo es el mismo que el de absorción.
Por otra parte, el espectro de emisión está desplazado hacia el rojo con respecto al de absorción, es decir, hacia longitudes de onda más grandes.
Encontramos que los dos espectros se solapan, esto es debido a los electrones (las flechas) que mantienen la energía.
2 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 RENDIMIENTO CUÁNTICO DE LA FLUORESCENCIA El rendimiento cuántico de la fluorescencia, Φ f, da una medida de la relación entre el número de fotones emitidos por fluorescencia, IF, y el número total de fotones absorbidos por el sistema, I ab. Tiene un valor comprendido entre 0 y 1 que depende de las características cinéticas de los tres procesos que compiten. Que el valor sea 1 es muy difícil ya que los fenómenos de competencia imposibilitan que IF = Iab.
No hablamos de intensidades sino de número de fotones porque la energía de la radiación es diferente.
Hay que tener presente que es muy difícil calcular esto experimentalmente. Sabiendo que el rendimiento cuántico de sulfato de quinina en H2SO4 1 M es de 0,7 y que el del ANS en NaOH 1M es de 0,93 podemos calcular el rendimiento cuántico de una molécula desconocida. El procedimiento consiste en mirar la fluorescencia de disoluciones con una concentración molar de quinina o ANS igual al de la molécula desconocida. A partir de la integral del pico de fluorescencia de una i otra podemos obtener cual es el rendimiento cuántico de la molécula que desconocemos.
Procesos que desactivan la fluorescencia Cuando tenemos un fluoróforo, parte de él se desactivará por procesos que no tienen que ver con la fluorescencia. Estos procesos de desactivación coexisten y compiten con la fluorescencia de manera que incitan su desactivación. Encontramos tres procesos que desactivan la fluorescencia: el cruzamiento entre sistemas, la conversión interna y el quenching.
En el esquema global anterior podemos ver las opciones de un electrón cuando este se excita. En la parte superior se produciría fenómenos de fluorescencia, en el siguiente (K CL) hace referencia a la conversión interna y en el último a la fosforescencia y el cruce entre sistemas. Estos dos últimos, recordamos, que son procesos que desactivan la fluorescencia.
Cruzamiento entre sistemas El cruzamiento entre sistemas es propio de algunas moléculas. Los singletes del estado excitado tienen una vida media muy larga, del -5 -3 orden de 10 s – 10 s. El electrón pasa de estar en singete del estado excitado a estar en triplete en un sistema menos energético. En el cruce de sistemas no hay emisión de radiación.
Seguidamente a este cruce se produce la relajación vibracional.
3 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 Espectro de excitación y emisión Cuando iluminamos una muestra fluorescente con luz monocromática se emiten fotones luminosos con distintas energías y que están asociados a las transiciones electrónicas desde el estado excitado a los distintos niveles vibracionales del estado fundamental. El registro de la intensidad de la fluorescencia en función de la longitud de onda de emisión constituye el espectro de emisión de fluorescencia a la longitud de onda de excitación determinada. El perfil del espectro de emisión no cambia cuando variamos la longitud de onda de excitación, solo aumenta o disminuye su intensidad.
El espectro de excitación es un registro de la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de emisión frente a un barrido de longitudes de onda de excitación. Recordamos que el espectro de excitación de un fluoróforo coincide con su espectro de absorción.
Conversión interna La conversión interna es muy común entre las moléculas y explica porque la gran mayoría no son fluorescentes. Se sitúan en niveles vibracionales fundamentales con una energía muy alta que se solapa con la de los niveles energéticos excitados. Si no hay conversión interna la molécula se trata de un fluoróforo perfecto.
La formación de un complejo estable entre la molécula portadora del fluoróforo y el desactivador frecuentemente hace que el espectro de absorción varíe.
Se ha hecho experimentación con el DNA y fluoróforos como la antraciclina daunomicina (DNM) para ver una característica del fenómeno de desactivación estática (conversión interna), que no tiene lugar en la desactivación dinámica. Se ha visto que la fluorescencia de DNM se desactiva en presencia de DNA ya que interaccionan y forman un complejo macromolecular. Si se añade un detergente como SDS este complejo se disocia y por lo tanto la fluorescencia aumenta por encima a la fluorescencia que ya emitía DNM por separado.
La conversión interna se produce en la propia molécula de manera que el solvente no tiene ningún papel.
Las moléculas rígidas y planas tienen niveles vibracionales fundamentales bajos de manera que la gran mayoría pueden emitir fluorescencia.
4 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 Extinción (Quenching) Este tipo de desactivación se produce por la colisión de las moléculas del solvente. De manera que el fluoróforo en el estado excitado colisiona con el desactivador y como resultado de esta interacción, el fluoróforo pasa al estado fundamental sin emitir radiación y la energía es disipada por el desactivador en forma de energía cinética.
Un desactivador o quencher es la molécula ajena al fluoróforo que provoca la desexcitación no radiativa. Entre los desactivadores encontramos el agua aunque no siempre provoca colisiones, el oxigeno también es otro ejemplo pero el ioduro es el quencher por excelencia, tiene una eficacia extrema.
Un triptófano en una posición interna emite fluorescencia pero incluso en presencia de ioduro, continúa emitiéndola. Por otra parte, un triptófano externo de por sí solo emite fluorescencia pero si encontramos ioduro, deja de ser fluorescente.
De manera que el ioduro no nos permite saber si hay triptófano en contacto o no con el solvente.
Ecuación de Stern – Volmer La intensidad de fluorescencia que disminuye al aumentar la concentración de desactivador, está cuantificada por la ecuación de Stern – Volmer.
Donde:  IF(sin quencher) es la intensidad de la fluorescencia en ausencia del desactivador.
 IF(con quencher) es la intensidad de la fluorescencia en presencia del desactivador.
 KSV es la constante cinética de la reacción (de Stern – Volmer).
Cada soluto tiene una capacidad intrínseca de desactivación y su eficacia depende de la probabilidad de colisión con el fluoróforo y de la concentración de ambas especies.
El hecho que hayan moléculas que colisionan con otras se debe a la dinámica molecular ya que las moléculas tienen energía térmica. En estos gráficos vemos una demostración indirecta de la dinámica molécula ya que observamos que la difusión molecular depende tanto de la temperatura como de la viscosidad.
5 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 Los estudios de desactivación de la fluorescencia permiten obtener información sobre la accesibilidad de un fluoróforo intrínseco o extrínseco, en un sistema biológico. Un ejemplo es la fluorescencia del triptófano en una proteína que puede verse afectada por cambios conformacionales o estructurales inducidos por una variación de pH, interacción con un liando… Este cambio molecular inducido puede verse reflejado en la variación del valor de la constante de Stern – Volmer.
La pendiente, m, de la recta de los gráficos anteriores nos da el valor de la constante de Stern – Volmer y constituye una medida de la capacidad del “”quencher” para desactivar la fluorescencia. Por otra parte, 1/m representa la concentración de desactivador capaz de producir el 50% de extinción de la fluorescencia del sistema.
Recordamos que, el DNA cuando interacciona con un fluoróforo como el triptófano, se disminuye la fluorescencia. Esto ha sido útil para realizar estudios sobre binding, constantes de disociación, etc.
INFLUENCIA DEL ENTORNO EN LA EMISIÓN DE FLUORESCENCIA DEL TRIPTÓFANO. ESTUDIOS DE CAMBIOS CONFORMACIONALES El fundamento de los métodos espectroscópicos de fluorescencia para la caracterización estructural de proteínas se basa en la contribución del Trp en el espectro de emisión de fluorescencia y en el hecho que su máximo de emisión depende de la polaridad del medio que rodea al fluoróforo.
En la imagen vemos el espectro de emisión de fluorescencia de la seroalbúmina bovina (BSA) en estado nativo y desnaturalizado con cloruro de guanidinio 6 M.
En la proteína nativa, el Trp está situado en un entorno apolar y muestra un máximo de emisión a 335nm. Cuando la BSA es desnaturalizada, la macromolécula sufre un cambio de conformación que ocasiona una alteración en el grado de exposición del triptófano al medio. Concretamente, pasa de un entorno apolar en la estructura nativa a uno polar en la molécula desnaturalizada. Como consecuencia, las propiedades de emisión de fluorescencia del aminoácido se ven afectadas y se observa un desplazamiento de la longitud de onda de emisión hacía el rojo, con un máximo a 345 nm.
Por otra parte vemos a 305 nm una banda que hace referencia a las tirosinas que tiene la proteína y que únicamente se aprecia en el estado desnaturalizado. Este hecho suele pasar en una gran cantidad de moléculas.
El punto de inflexión de la curva representa la medida experimental de la temperatura de desnaturalización de la molécula y es un parámetro que caracteriza la estabilidad de la proteína.
Estas propiedades tienen un gran interés en el campo de la química de proteínas para analizar la estabilidad de las proteínas mutantes y en estudios estructurales de desnaturalización y plegamiento de macromoléculas.
6 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA DE PROTEÍNAS Los estudios de fluorescencia de proteínas se abordan utilizando los fluoróforos intrínsecos de la macromolécula y en algunos casos, se recurre a fluoróforos extrínsecos capaces de interaccionar con ella.
En la siguiente tabla podemos ver las propiedades espectroscópicas de algunos fluoróforos extrínsecos que se añaden a los sistemas biológicos para su estudio.
Fluoróforo 8 – anilino – 1 – naftaleno Isotiocianato de sulfonato (ANS) fluoresceína (FITC) No covalente Covalente λmax (nm) 374 495 εmax 680 4200 λmax(nm) 454 516 εmax 0,98 0,30 εmax · ΦF 6670 12600 Modo de unión Absorción Emisión Sensibilidad El ANS no se une a la proteína de forma covalente sino que se produce una interacción hidrofóbica y π – stacking (apilamiento). Por otra parte, la FITC sí que se une covalentemente a las proteínas a través de su grupo carboxilo con los grupos ε amino de las proteínas, de manera que forma un enlace peptídico. Podemos ver la estructura de estos fluoróforos en la imagen inferior: Por lo que respecta a las propiedades espectroscópicas de los aminoácidos aromáticos (fluoróforos intrínsecos) en medio acuoso a pH=7: Fluoróforo Absorción Emisión Sensibilidad Fenilalanina Tirosina Triptófano λmax (nm) 257 274 280 εmax 200 1400 5600 λmax(nm) 282 303 348 εmax 0,04 0,14 0,20 εmax · ΦF 8 196 1120 7 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 En general, el triptófano sufre un desplazamiento de su máximo hacia longitudes de ondas mayores al aumentar la polaridad del medio. Este hecho tiene que ver con el aumento del valor del momento dipolar de un grupo aromático en el estado excitado.
En el espectro de emisión de fluorescencia de una proteína nativa, la contribución individual de la tirosina prácticamente no es observable cuando hay triptófanos en su composición. Este hecho lo podemos ver reflejado en la reducida sensibilidad de este aminoácido como fluoróforo. En las proteínas que carecen de triptófano, la tirosina es un buen marcador sensible a los cambios del entorno proteico.
Un ejemplo de este hecho lo constituye un conjunto de proteínas que interaccionan con el DNA y presentan la propiedad de carecer de triptófanos en su secuencia. Cuando se forma el complejo proteína – DNA la fluorescencia desaparece y esto nos permite calcular la constante de afinidad del complejo proteína – DNA y realizar estudios comparativos con proteínas mutantes.
TRANSFERENCIA DE ENERGÍA ENTRE FLUORÓFOROS Otra forma de desactivación de la fluorescencia es la transferencia de energía desde el fluoróforo en el estado excitado, a un cromóforo que actúa de aceptor y pasará a un estado excitado.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia también conocida como FRET (Förster resonance energy transfer) y es una interacción que únicamente ocurre a muy corta distancia entre dos estados de excitación electrónica de dos moléculas fluorescentes en que la longitud de onda de emisión de una de ellas coincide con la de excitación de la otra.
Hay que tener presente que durante el proceso no hay emisión de fotones luminosos, únicamente se produce un intercambio de orbital en los electrones.
Cuanto mayor sea el grado de solapamiento, mayor será la probabilidad de transferencia de la excitación. Además, el tanto por ciento de energía transmitida depende de la distancia entre las moléculas. Este fenómeno de transmisión de energía también lo encontramos en RMN.
En resumen, excitamos la primera molécula y observaremos la radiación proveniente de la segunda.
En algunos casos, la misma molécula de fluoróforo puede actuar de aceptor siempre y cuando sus espectros de absorción y emisión se solapan. Cuando esto ocurre es fácil identificar que se está produciendo ya que el espectro de absorción del aceptor está desplazado hacia el rojo con respecto el de absorción del donador y por lo tanto también estará desplazado el de emisión. Como consecuencia, la longitud de onda será mayor que la correspondiente al donador, concretamente será la combinación de los espectros de absorción de donador y aceptor.
8 Judith González Gallego María Monteserín Cuesta Técnicas Instrumentales Avanzadas T5 Podemos encontrar que el aceptor no es fluorescente de manera que se desexcita por mecanismos no radiativos y por lo tanto actúa como un desactivador de la fluorescencia. En este caso obtendríamos una única emisión de fluorescencia referente al donador. Cuando ocurre esto no es fácil identificar al cromóforo pero una cosa está clara y es que será uno de los cromóforos cuyos espectros de absorción solapen con el espectro de emisión fluorescente del donador.
El espectro de los aminoácidos tirosina y triptófano se solapan de manera que hay una transferencia de energía entre ellos.
Es por este motivo que en una proteína no podemos trabajar observando tirosinas en muchos casos ya que recordamos que la sensibilidad del triptófano es mucho mayor que la de la tirosina.
Para demostrar que el % de fluorescencia depende de la distancia de los dos fluoróforos se elaboró un experimento con dansilo y α – naftil. Crearon una estructura en la cual los fluoróforos se situaban en los extremos y estaban unidos por una barra rígida de diferentes longitudes. En la imagen podemos ver cuál era la base: Podemos observar gráficamente como la eficiencia de la transferencia disminuye a medida que la distancia entre los dos fluoróforos aumenta.
Hoy en día, podemos estudiar el proceso de plegamiento y desplegamiento de una proteína fácilmente a partir de la variación en la fluorescencia.
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