Regulació de l'expressió gènica a eucariotes (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología + Ciencias Ambientales - 2º curso
Asignatura Genètica
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 16/04/2016
Descargas 11
Subido por

Vista previa del texto

Umukie Bosch Altimiras Genètica Regulació de l’expressió gènica en eucariotes REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA EN EUCARIOTES Més complexa que en procariotes.
Hi ha d’haver senyals entre cèl·lules en els organismes multicel·lulars, com també veiem grups de cèl·lules especialitzades. Per tant l’expressió gènica, determina la diversitat de funcions, de fisiologies, d’estructures,.. d’una cèl·lula.
No només trobem una diferent expressió en l’espai, sinó també en el temps.
És importantíssima i bàsica durant el procés de desenvolupament de l’organisme. En llocs diferents s’expressen gens diferents. Estan controlats per agents diferents en el procés embrionari.
No s’organitzen en operons. Les proteïnes i seqüències de DNA són molt més nombroses. Les seqüències reguladores es poden trobar molt lluny dels promotors.
Els processos de regulació es duen a terme a la transcripció, a la traducció o post-traduccional.
La majoria es dóna a nivell de transcripció (inici o durant).
Tenim tres RNA polimerasa, la II és la que controla la transcripció de gens codificants. És més complexa perquè aquesta transcriu i modifica.
El DNA es troba empaquetat en cromatina. L’accés als promotors està restringit. L’estat basal d’un gen a procariotes es troba actiu. En eucariotes, l’estat basal d’un gen és reprimit/silenciat.
Necessitarem proteïnes i DNA per accedir al promotor amb la RNA polimerasa.
Hi ha una sèrie de reaccions en cascada que permetin que les proteïnes reguladores donin accés a la RNA polimerasa al DNA. Moltes d’aquestes es trobem lluny del promotor.
Un gen pot ser que només es transcrigui durant la fase inicial de desenvolupament i posteriorment mai! Els reguladors s’han d’assegurar que això sigui així.
Venen regulats per proteïnes i per gens: -Complexa RNA polimerasa II, reconeix el promotor pels factors generals de transcripció (GTF). El promotor i els elements proximals al promotor són els reguladors.
-Factors específics de transcripció, són proteïnes reguladores. També per seqüències activadores abstream 5’ UAS (enhancers), es poden trobar molt lluny del regulador, és DNA.
...??? Gran part de l’estratègia està en què els factors específics de transcripció, units al UAS permeten que la RNA polimerasa II s’uneixi al promotor.
Els elements proximals del promotor es troben a 5’ del promotor però més a prop que els enhancers. Tenen seqüències consens com una caixa rica en GGCC i una seqüència CCAAT.
Hi ha més d’un domini funcional per poder modular la transcripció.
Les proteïnes reguladores poden tenir un domini que reconegui el DNA. Un domini per interaccionar amb altres proteïnes reguladores o proteïnes de la maquinaria de transcripció.
un domini que influeixi en la condensació de la cromatina. Un domini que permeti reconèixer el medi extern de la cèl·lula.
Totes les proteïnes reguladores tindran un o més dominis.
Llevats: Saccharomices cerevisiae.
S’estudia la transformació de glucosa en lactosa. Els gens GAL. Són necessaris per transformar la Galactosa en Glucosa. Tenim 4 gens estructurals GAL 7, GAL 10, GAL 1 i GAL2 (en un altre cromosoma). També requereix gens GAL 3, GAL 4, GAL 80 que són reguladors de l’expressió dels quatre gens estructurals.
S’observa que les cèl·lules que creixen en un medi sense galactosa, tenen els medis silenciats.
Amb presència de galactosa (sense glucosa) els gens són induïts per expressar-se.
S’ha vist que GAL 4: és una proteïna clau per l’expressió dels gens estructurals. Té un domini d’unió a una seqüència específica del DNA UAS enhancer.
Permet veure la importància de les proteïnes i com actuen. Es veu que els mutants de la proteïna GAL 4, els gens estructurals estan silenciats. Si són mutacions a la seqüència UAS enhancer, també silencia els gens estructurals.
Entre GAL 10 i GAL 1 trobem els enhancers d’aquests dos. Aquests dos es transcriuen en direccions diferents. GAL 7 i GAL 2 tenen els seus enhancers.
Els enhancers s’uneixen a GAL 4 mitjançant el dímer d’aquest GAL 4. La seqüència dels UAS que reconeix GAL 4 és petita. Si els enhacners estan mutats, tampoc es transcriuen.
Com GAL 4 unida als enhancers regula: -La GAL 80, en condicions d’absència de galactosa, aquesta GAL 80 es troba unida a GAL 4 (que es troba unida a UAS) i no deixa que el centre d’activació actuï, bloqueja la transcripció.
-GAL 3 en presència de galactosa, canvia la seva conformació i atrau GAL 80 i el domini d’activació de GAL 4 queda lliure i pot activar la transcripció.
S’observa amb mutacions de GAL 80 que l’activació és constitutiva. Quan GAL 3 està mutada els gens estan sempre silenciats.
GAL 4 domini d’unió amb el DNA i un domini activador. Aquest tipus d’estructura és molt característica de proteïnes reguladores. Són dissociables i funcionen independentment. S’ha demostrat separant els dominis, intercanviant-los i utilitzant gens informadors (gen que és fàcil detectar la seva expressió, per exemple lac Z, que esdevé fluorescent). S’agafa aquest gen informador i se li posa un promotor GAL a 5’ i més a enllà un UAS de GAL. El resultat és que la proteïna activadora GAL reconeix el UAS i activa el promotor GAL i per tant transcriu el lac Z.
S’han fet proteïnes que s’anomenen proteïnes de fusió que poden tenir l’activador d’una proteïna i el domini d’unió d’una altra.
-Provoquen l’activació independentment de la proteïna d’activació que porten.
-Provoquen l’activació independentment del domini d’unió de DNA que s’uneixin.
GAL4 no activa directament la transcripció sinó que pel mig hi ha mediadors. Funció estricta d’activació i de remodelar la cromatina.
FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ En el procés embrionari es donen processos de diferenciació cel·lular, sense guany ni pèrdua de informació genètica (de totipotènica a pluripotència i posteriorment multipontents per acabar essent totalment diferenciades). No hi ha canvi en el material sinó canvi en l’expressió dels gens.
La potència d’una cèl·lula és la capacitat d’una cèl·lula per diferenciar-se en diferents tipus cel·lulars.
-Totipotència: es poden diferenciar en qualsevol teixit cel·lular. (la primera que tenim és el zigot i les espores). Pot originar tots els tipus de cèl·lules de l’embrió (blastòcit i inner mass cells) i també les extraembrionàries (trofoblast, deriva en placenta).
Mòrula (864 cèl·lules), doncs la totipotència es perd a partir de les 16 cèl·lules.
-Pluripotència: Comencen a actuar els factors de transmissió i hi ha una regulació en l’expressió dels gens. Amb aquest control de a transcripció, les pluripotents es diferenciaran en multipotents amb les tres capes (ectoderm, mesoderm i endoderm).
-Multipotència: Les multipotents, hematopoiètiques encara es poden regular en eritròcits, leucòcits i plaquetes.
Epigenètica: bàsica durant el desenvolupament i regula l’expressió de gens. Els mecanismes epigenètics provoquen un canvi heretable en l’expressió dels gens, però no modifica el DNA. El sentit heretable és perquè passa d’una cèl·lula a una altra. Provocarà l’activació d’uns gens i el silenciament d’altres.
Per què es comencen a diferenciar? Per factors epigenètics que marquen el futur d’aquella cèl·lula.
Els mecanismes són entre d’altres, la metilació del DNA i la desacetilació d’histones, que són els més coneguts. Passen al llarg dels processos de divisió cel·lular.
Les cèl·lules perden la pluripotència per l’expressió de gens. Hi ha una sèrie de gens, i per tant, si es poden manipular aquests gens, es pot produir una pluripotència induïda.
*Una cèl·lula mare embrionària és una cèl·lula de la massa embrionària (blastòcit).* Es pot induir per tant la pluripotència en cèl·lules mare. Es fa per exemple en les cèl·lules del fibroblast, i per tant que es desdiferenciïn i recuperin la pluripotència, i esdevenir cèl·lules mare hematopoiètiques. (Tindran els telòmers curts perquè ja s’hauran dividit, però les cèl·lules mare autèntiques els tindran llargs).
Es detecten tres gens implicats en el manteniment de la pluripotència: OCT4, NANOG, SOX2.
Són gens que codifiquen per proteïnes reguladores de factors de transcripció que regulen l’expressió de centenars de gens. Aquests tres gens actuen: -Promouen la transcripció d’ells mateixos. (OCT4, NANOG, SOX2, C-MYC,...) -Silencien els gens de desenvolupament, gens implicats en la diferenciació cel·lular.
(NEUROG1, PAX6, GATA4, CDX2,...) Quan se silencien aquests gens, comença la diferenciació.
En els experiments in-vitro, s’observa que la pèrdua de funció dels gens es veu una diferenciació, i la sobre-expressió d’aquests també implica la diferenciació. Hi ha doncs, altres factors. En qualsevol cas, es pot dir, que hi ha molts gens que tenen seqüències diana pels factors de transcripció codificats per aquests gens).
Les proteïnes polycomb group (PcG) fan d’intermediari entre l’expressió dels tres gens i el manteniment de la pluripotència. S’ha demostrat que aquestes proteïnes actuen com a repressores dels gens implicats en la diferenciació cel·lular, per tant, mantenen la pluripotència.
*Les cèl·lules mare també tenen problemes de esdevenir línies cancerígenes. La sobre-expressió de les PcG pot generar càncers.* CONTROL DE L’EXPRESSIÓ DE RNA’s petits MicroRNA: Es formen a partir dels stein loops (tija i loop), es transcriuen a partir d’un RNA (pri-miRMA). El 40% es transcriu per DNA d’introns d’agents codificants. La resta per DNA independent.
Aquests pri-mi-RNA pot tenir centenars de nucleòtids, un mi-RNA té 22 nucleòtids. Per tant han de madurar per convertir-se en un mi-RNA madur. els mi-RNA actuen de reguladors de la transcripció, ja acaben formant estructures que degraden el mRNA, o actuen a nivell de traducció. (per complementarietat de bases).
La transcripció dels pri-mi-RNA és per la RNA polimerasa II per unitat independent del DNA o un intró d’un gen codificant.
1.- Transforma el pri-mi-RNA en pre-mi-RNA. Per la proteïna Drosha. L’escurça. Deixa un grup P a 5’ i dos nucleòtids desaparellats a 3’. Això passa al nucli. Treballa amb DGCR8 reconeix la doble cadena.
2.- El pre-mi-RNA és transportat al nucli.
3.- Dicer talla el loop del pre-mi-RNA, a uns 22 nucleòtids més enllà d’on ha tallat Drosha. Així s’obté la longitud que es vol. També deixa un grup P al 5’ i dos bases desaparellades a 3’. Treballa amb la TRBP que reconeix la doble cadena.
4.- La proteïna de la família argonauta (Ago2) fa de pont pel pre-mi-RNA amb el RISC (Complex de Silenciament Induït per RNA). Quan es troba al RISC només s’incorpora una cadena.
Els snRNA actuen semblant.
Complexa RISC: Complexa nucleoproteic entre elles les de la família argonauta. Degrada per escissió o inhibeix la traducció. Està basat en la complementarietat de bases entre el microRNA amb la seqüència diana del mRNA. Si és complet es trenca el mRNA, si és parcial es bloqueja la traducció. Té una tercera actuació, provoca la d-adenilació del mRNA i desestabilitza.
Aquest micro-RNA té la seqüència de reconeixement a 3’UTR. Reconeixen parcialment aquesta zona. Un mateix micro-RNA pot reconèixer diferents seqüències dina de diversos mRNA.
Un 60% dels gens estan regulats per aquests micro-RNA.
Els small-interferance-RNA (siRNA) també formen un complex RISC.
Trobem micro-RNA excepcionals: provenen de seqüències d’introns curtes, anomenats mirtrons. Tenen un processament diferent, no necessiten Drosha, són directament pre-microRNA. Surt del nucli i es processa per Dicer i regularà de la mateixa forma que els altre microRNA.
Aprenentatge i memòria Aprenem per experiència degut a una xarxa de connexions neuronals. Hi ha molts tipus de memòria: -Passat: Llarg termini, porta associada la síntesi de proteïnes. Està relacionada amb la sinapsis que són dinàmiques. Aquestes sinapsis estan mediades per proteïnes.
Els P-body (processin body), són sistemes que engloben ribonucleoproteïnes. També tenen proteïnes motores, que permeten el moviment del p-body per tota la neurona. El moviment es pot donar com a resposta a un neurotransmissor. Inclou proteïnes i mRNA amb una alta quantitat de micro-RNA. Aquests miRNA reprimeixen la traducció dels mRNA, així es poden transportar els mRNA per tota la neurona. La repressió és a nivell de complexa RISC.
Els micro-RNA actuen silenciant la traducció de mRNA al llarg de la neurona. Els p-body emmagatzemen mRNA i tenen altres sistemes que també reprimeixen la traducció.
Els complexes RISC poden ser reversibles, quan reprimeix la traducció, les proteïnes argonauta alliberen el miRNA de la diana del mRNA i així es pot traduir. Permet tenir una resposta ràpida de síntesi de proteïnes alliberan gran quantitat de mRNA.
Exemple: miRNA 134 reprimeix per mitjà del complex RISC el gen Limk, aquest codifica per la polimerització d’actina.
Small-interferance-RNA: Reprimeixen els la traducció dels gens per mitjà de complexos RISC. Majoritàriament per escissió del mRNA. Són RNA petits, es comporten semblant al miRNA però tenen un origen molt diferent. Parlarem dels endo-si-mRNA. Depenen del Dicer. S’originen pel DNA de doble cadena. Algunes espècies tenen RdRPs (polimerases RNA dependents) que aquesta proteïna es situa sobre el RNA i fa una complementaria. En mamífers no hi ha aquestes proteïnes, per tant es forma per proteïnes endògenes.
En mamífers: Per duplicació gènica o inversió. Es transcriu un RNA amb inversió de manera que es pot plegar i formar el siRNA. O es transcriu una cadena del gen original i una altre del pseudogèn que es complementen els transcrits i formen el siRNA.
Permet sintetitzar tRNA in vitro, té una gran aplicació biomèdica i biotecnològica de teràpia.
Exemple: gen de la miostatin (inhibeix el creixement, provoca que les cèl·lules del múscul no es diferenciïn). Es transporta per la sang i actua a totes les cèl·lules musculars. Per actuar necessita unir-se a un receptor, anomenat activina. Quan la miostatina reconeix l’activina, s’inhibeix el creixement muscular. Si podem modificar el gen de la miostatina, podem promoure el creixement.
Podem sintetitzar oligonucleòtids que poden reconèixer els exons que codifiquen la miostatina i inhibir la síntesi d’aquesta, esdevé una espècie molt musculosa. Gran interès econòmic.
lncRNA: Long non coding RNA No codifiquen per cap proteïna, es pensava que eren residus. S’ha descobert que es transcriuen voluntàriament i tenen una funció important. Les regions que transcriuen incRNA que estan molt conservades.
Poden actuar sobre promotors, interferint a la transcripció silenciant-la, també poder promoure remodelen la cromatina. Poden generar antisens d’una regió de pre-RNA i produir una maduració splicing alternatiu, ja que l’antisens no deixa que talli per algun lloc que hauria de tallar i es talla en el següent. Això forma RNA de doble cadena que poden ser precursors de siRNA.
Poden actuar amb proteïnes reguladores, o estan associats a proteïnes reguladores. Modelen l’activitat de la proteïna. Pot fer estructures més grans. Poden alterar la localització de la proteïna.
Es creu que poden ser precursors de molècules de RNA com els siRNA i els piwiRNA.
*Es pot trobar pel nom de NATs (transcrit antisens natural)* Poden actuar en mecanismes d’impronta genòmica i inactivació del cromosoma X, es transcriuen de regions intergèniques, no codificant.
Promotor major: Regula la transcripció del gen.
Promotor menor: Regula la transcripció d’un lncRNA que quan interacciona amb el factor de transcripció general 2, dissocia el complex de pre-iniciació i silencia la transcripció.
-GEN SER3 codifica per la ruta de síntesi de serines. Amb presència de serina, el gen té una alta transcripció del gen. A la regió promotora trobem seqüències de UA, es transcriu un lnRNA SRG1 que interfereix a l’activitat de la RNA polimerasa a l’inici de la transcripció. Silencia.
-Els enhancers no es troben a 5’. Des del enhancer (ei) es transcriu un lncRNA que forma un complex amb el gen DLx-2 que promou la transcripció reguladora d’activació. DLx-5 i DLx-6 són importants en la regulació d’altres gens.
-HOXD: Des d’una regió intergènica de HOXC es transcriu el lncRNA HOTAIR que unit a la PRC2 (proteïna policomb), activa una metil transferasa que metila les histones de HOXD. lncRNA pot alterar les marques epigenètiques i procovar metilacions.
-P15 antitumoral amb AS com a anticens. Reprimerix l’espressió de de P15 amb estructures complementaries, metilant la cromatina, no es transcriurà el gen.
-POST TRANSCRIPCIONAL: Gen FAS, codifica per una proteïna que controla l’apoptosi.
L’anticens SAF lncRNA reconeix una regió del gen FAS provocant un mecanisme de splicing alternatiu. Aquest spllicing alternatiu dóna lloc a una proteïna incapaç d’ancorar-se a la membrana, per tant provoca l’apoptosi.
S’han trobat moltes regions intròniques que codifiquen per aquests anticens.
-Quan trobem mRNA amb AU’s a la regió 3’UTR provoca una inestabilitat. Hi ha lncRNA que són anticens d’aquestes regions, s’hi uneixen i actuen de protecció, estabilitzen. Promouen la transcripció.
La regulació de la transcripció dels gens està relacionada amb la posició dels nucleosomes. La disposició dels nucleosomes és dinàmica. L’activació dels gens requereix doncs que els nucleosomes s’han de desplaçar o eliminar per fer accessibles les seqüències. El procés invers, silencia la transcripció.
La cromatina s’altera per remodelacions: -A través de factors de transcripció que canvien la conformació de la cromatina.
-Mecanismes de “HOTAIR” En estudis fets en llevats s’ha descobert un complex proteic que permet remodelar la proteïna.
Activa un complex proteic que mou els nucleosomes fent que la seqüència TATA sigui accessible per la TATA box. Aquests complexos proteics s’anomenen coactivadors (SWIF-SNIF) actua també en GAL4.
La regulació de la proteïna vindrà donada per l’epigenètica (canvis importants en la funció del genoma però no en la seqüència, canvis d’expressió) és heretable. Poden afectar a patrons del propi DNA i també en patrons de les histones. Les marques epigenètiques sobre el DNA o sobre les histones són importants.
-Marques epigenètiques sobre les histones. Els gens de les histones són els més ben preservats. Les histones tenen cues amb residus de Lys que poden estar acetilats. Les cues es troben a l’extrem aminotermial. Les diferents patrons d’acetilació estan implicats en la regulació de la cromatina. L’acetilació d’histones fa accessibles les regions promotores, i per tant la transcripció. Quan estant des-acetilades, se silencien els gens. En el cas de la metilació, se silencien els gens. Les cues de les histones i els residus de Lys, es poden acetilar pel codi d’histones. Cada patró d’acetilació determina un patró d’expressió.
-L’adició de grups metil està relacionada amb l’expressió de gens. La metilació provoca mutacions a les bases. Metilació del C5 de les pirimidines (C i T) i en el N6 de les bases púriques (A i G). Es dóna per uns enzims metil-transferases a nivell del DNA i més sovint en citosines. S’ha definit en el genoma una regió illes CpG (citosinafosfatguanina), regions molt riques en CG i per tant susceptibles a ser metilades. Són mecanisme de regulació d’expressió.
Útil a nivell de diferenciació cel·lular. La majoria de marques epigenètiques desapareixen en el moment del zigot, com un reset. Van apareixent a mesura que es desenvolupa.
Un gen metilat és un gen silenciat. La metilació del genoma es troba també en llocs amb repeticions o erronis i així s’evita la transcripció. la hipometilació general del genoma en cèl·lules cancerígenes provoca que una zona que no s’hauria de transcriure, es transcrigui.
Es mantenen al llarg de les divisions cel·lulars gràcies a uns enzims anomenats DNA-metiltransferases.
-DNA-metil-transferasa I: Metila el DNA d’un DNA hemimetilat. S’associa a l’antígen de ... (beta-clamp de les eucariotes). Només una cadena. Fora de les illes CpG.
-DNA-metil-transferasa III: Síntesi de novo. Les dues cadenes. Dins les illes CpG.
Intervenen altres factors proteics també.
El que és important és el patró de l’entorn de metilació. A l’epigenoma veiem patrons iferents entre races humanes. Al llarg de les generacions, de l’edat dels individus, varia.
Els patrons també poden canviar per factors ambientals. Determinen que una abella, per exemple, es desenvolupi com a obrera o com a reina. Provenen d’una larva genèticament idèntiques, l’alimentació és el que les diferenciarà. A les obreres trobem gens silenciats per metilacions que les converteixen en infèrtils. S’han desenvolupat siRNA que silencien gens de la DNA-metil-transferasa III i per tant, esdevenen reines. A la gelea real hi ha compostos que inactiven les hipoacetilases (silenciació dels gens).
Aïlladors pers bloqueig d’enhancer Afecten a gens propers o molts llunyans. Eviten que un enhancer activi un gen que no li toca.
Quan l’aïllador es situa entre un enhancer i un gen, provoca que no es pugui activar el gen.
Sembla ser que el que faria és un loop amb tots els promotors que s’hi que ha d’activar l’enhancer estiguessin a dins aquest loop, juntament amb l’enhancer. Els promotors de fora del loop no podran veure’s afectats per l’enhancer.
Impromta materna: L’al·lel d’un dels progenitors no s’expressa, només se n’expressa un.
Només s’expressa el del pare i el de la mare no.
Impromta paterna: L’al·lel d’un dels progenitors no s’expressa, només se n’expressa un.
Només s’expressa el de la mare i el del pare no.
Hi ha els dos al·lels però només se n’expressa un. A les regions reguladores d’aquests gens es formen uns patrons que fan que s’expressi en un sexe i no en l’altre.
Exemple: Gen Igf2 i H19 Entre aquests dos gens, trobem una regió anomenada imprinting control regions (ICR) que regula aquests gens amb un patró diferent en funció del sexe. També reconeix una proteïna reguladora anomenada CTCF.
-A l’al·lel matern, aquesta CTCF no està metilada, d’aquesta manera el enhancer pot activar el gen H19 però no el IgF2. Està impromtat per Igf2.
-A l’al·lel patern, aquesta CTCF està metilada, d’aquesta manera el enhancer podria activar els dos gens, però la metilació del CTCF avarca part del promotor del H19 i per tant no es podrà expressar aquest gen H19 però sí el Igf2. Impromtat per H19.
Els fenomen imprinting s’esborren a les cèl·lules gamètiques primordials, però s’estableixen durant la formació dels gàmetes i per tant de zigot.
Aquestes marques epigenètiques són necessàries pel desenvolupament del individu i per això quan es clona, la majoria d’experiments no tenen èxit perquè no tenen aquestes marques.
Inactivació del cromosoma X S’ha de compensar que hi hagi dos gens X, les dosis genètiques. Corpuscle de barr, és el cromosoma de X inactivat i la cromatina està altament condensat. Tenim una hipermetilació dels gens, hipoacetilació general d’histones i residus de lisina que silencia els gens.
El imprinting desapareix a nivell de zigot i no torna a aparèixer fins unes divisions més enllà de l’estat embrionari.
S’inactiva una cromosoma o l’altre de manera aleatòria. (Color del pèl de les gates). Es dóna per marques epigenètiques.
En el moment de produir-se l’activació també es veu un non-long-coding-RNA. El centre d’inactivació de X (Xic) inclou una sèrie de regions que es transcriuen però no es tradueixen. És veuen dues regions (TsiX i Xist). El Xist és complementari a Tsix i reconeix aquesta regió, la recobreix i inactiva la regió de X. És necessària per iniciar el procés d’inactivació. El cromosoma X silenciat es manté per les metil-transferases, les responsables de la hipoacetilació,...
...