Tema 12 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 2
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T12 Tema 12. Establiment de línies cel·lulars IMMORTALITZACIÓ Hi ha línies cel·lulars que s’immortalitzen de manera espontània però també podem buscar maneres per fer-ho. Imaginem que tenim cèl·lules d’una persona que té una immunodeficiència important i que aquestes cèl·lules les volem fer servir per estudiar les característiques moleculars de la seva malaltia, si immortalitzem aquestes cèl·lules podrem avançar més ràpidament. Sabem que la immortalització no és innòcua per les cèl·lules.
Així doncs, a part del procés espontani que es pot donar per immortalitzar cèl·lules també es pot fer mitjançant virus o gens vírics, per fusió amb altres cèl·lules immortalitzades o bé transfectant el gen de la telomerasa.
Aquest últim mètode és el que més s’utilitza en l’actualitat i el que menys inestabilitza les cèl·lules. Sembla que al cap d’un nombre important de divisions, aquelles que han estat immortalitzades amb el gen de la telomerasa pateixen menys inestabilitzacions.
Immortalització amb gens vírics Per immortalitzar cèl·lules s’han utilitzat diversos gens vírics, entre els quals cal destacar:  Epstein Barr per cèl·lules limfoblastoids  SV40LT per cèl·lules adherents com fibroblasts, keratinòcits i cèl·lules endotelials.
Bloquegen la inhibició de la progressió pel cicle cel·lular, inhibint gens com CIP-1/WAF/p21, Rb, p53 i p16, el que incrementa la vida mitjana de les cèl·lules i també la possibilitat de patir mutacions.
Habitualment, les cèl·lules són transfectades o infectades retrovíricament abans d’entrar en fase senescent. Això permet que tinguin la capacitat de patir unes 20 a 30 generacions més abans d’entrar en crisi, període que pot durar mesos, i el -5 -9 qual poden superar per convertir-se en immortals de l’ordre de 1x10 a 1x10 cèl·lules.
Immortalització de fibroblasts humans La via més utilitzada per immortalitzar fibroblasts és a través de l’expressió de l’antigen T del SV40, que comença una cascada d’esdeveniments que duen a la immortalització en una proporció de una per cada 107 cèl·lules.
La majoria de les línies de fibroblasts immortalitzades amb l’SV40 ho han estat usant o bé el virus sencer o construccions com pSV3neo que expressa l’antigen T a partir d’un promotor endogen. Aquesta darrera és la via recomanada per l’expressió constitutiva de l’antigen T.
Freshney (2000) diu que la selecció pel gen gpt és efectiva per fibroblasts humans, però que G418 (neo) i higromicina (hygB) són més fàcils d’utilitzar i més efectius.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T12 Immortalització per fusió cel·lular Les cèl·lules somàtiques es poden fusionar en presència del virus Sendai inactivat o de polietilenglicol (PEG). Una porció de les cèl·lules fusionades repliquen sincrònicament, i els seus cromosomes s’ajunten en un únic nucli donant lloc a una cèl·lula híbrida. En alguns híbrids interespecífics, un dels sets cromosòmics es va perdent gradualment. Com que la proporció d’híbrids viables és baixa, cal un medi de cultiu selectiu (HAT: Hipoxantina, aminopterina i timidina) per permetre una major supervivència dels híbrids en front de les cèl·lules parentals (TK-, i HGPRT-).
Sols les cèl·lules híbrides sobreviuen en aquest medi ja que les cèl·lules no fusionades o les fusionades amb el mateix deficient (p. ex. TK-/TK- o HGPRT-/HGPRT-) no ho poden fer ja que són deficients en la timidina kinasa o en la hipoxantina guanina fosforibosil transferasa. Les cèl·lules parentals per tant no poden utilitzar la timidina o hipoxantina del medi i com que l’aminopterina bloqueja la síntesi endògena de purines i pirimidines no poden replicar el DNA.
La fusió cel·lular també ens pot servir per generar hibridomes.
Immortalització per transfecció amb el gen de la telomerasa Igual que en el cas del gen de l'Antigen T, cal utilitzar sobrenedants retrovírics que expressin hTERT. Un exemple és clonar el gen hTERT en un vector pBabepuro, i utilitzar una línia cel·lular empaquetadora com PA317. Si la línia expressa l’hTERT clonat en el vector de forma estable, es poden utilitzar les partícules víriques generades per les cèl·lules empaquetadores per infectar les cèl·lules d'interès. Un cop fet això, es poden seleccionar les cèl·lules que han estat infectades (I per tant contenen el gen hTERT introduït durant 2 setmanes amb puromycin (750 ng/ml). En alguns casos la completa immortalització requereix la combinació de transfecció amb hTERT i HPV E6/E7 o SV40.
La major línies cel·lulars immortalitzades amb aquest gen solen mantenir l’estabilitat genòmica. No sempre la transfecció amb telomerasa és suficient.
2 ...