TEMA 2 – EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES (I) (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Profesor S.C.
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 11/09/2015
Descargas 3

Vista previa del texto

TEMA 2 – EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES (I) En procariotes, la transcripció i traducció estan acoblades, és a dir, es duen a terme al mateix lloc (no en eucariotes). El polisoma és el punt on es fan els dos processos alhora. Primer es fa una cosa i després l’altra, però en un espai de temps tan petit que es diu que es fan alhora.
Estructura dels gens El mRNA té zones anteriors i posteriors a la zona codificant. Hi ha 3 codons STOP (no codificants) diferents que signifiquen el mateix però se’ls anomena diferent: sèpia (UGA), ocre (UAA) i àmbar (UAG); com aquests colors, que són pràcticament iguals però es s’anomenen diferent.
Davant de l’inici de replicació trobem la regió líder i darrere del mRNA la tràiler. A la líder trobem la RBS (Ribosome Binding Side), la regió on s’uneix el ribosoma. Açò ho van descobrir Shine i Dalgarno, i per tant, a la RBS també se l’anomena regió SD.
El primer ribonucleòtid serà a l’inici de la transcripció (+1), A ó G normalment. A més, per cada gen tenim dues cadenes, la codificant, la que de normal llegeix la RNA polimerasa, i la motlle, com el RNA.
Un ORF és un Open Reading Frame. Són gens, però no tots els gens són ORFs. En un fragment de DNA hi ha 6 formes de lectura: començant pels tres primers i pels tres últims nucleòtids. Al llegir del revés, la RNA polimerasa llegiria la cadena motlle, ja que sempre ho fa en sentit 5’  3’. Un ORF és aquell marc de lectura suficientment llarg sense STOPs.
Si la lectura fos a l’atzar, el ribosoma es trobaria amb nucleòtids d’STOP de manera reiterada; però al no ser a l’atzar, espot trobar amb 400 aminoàcids sense cap senyal d’STOP pel mig. El marc de lectura està en el RNAm, però al DNA es troben els 6 possibles. El RNAm sols en té tres de possibles, ja que s’ha transcrit d’un sentit o un altre.
En virus, d’un sol fragment de DNA, es poden utilitzar tots els marcs de lectura possibles. D’aquesta manera es poden arribar a tindre 3 o 4 proteïnes d’un mateix transcrit.
La regió promotora serà reconeguda per la RNA polimerasa però no estarà inclosa en el RNAm. El promotor està compost per dues regions (-35 i -10). Per exemple, la regió TATA comença 10pb abans que l’inici de transcripció. La primera posició de RNA és +1 (no hi ha posició 0), a 10pb de la regió TATA i a 35 de la -35.
- Regió -35  reconeixement de la RNA polimerasa Regió -10  unió de la RNA polimerasa La regió terminadora es troba en el DNA i un tros es transcriu a RNA. Aquesta regió serveix per aturar la RNA polimerasa, ja que aconseguirà alentir-la fins aturar-la. La RNA polimerasa, a l’igual que la DNA polimerasa III pot transcriure llargs trossos de DNA i per això necessita que l’aturin.
Unitats transcripcionals Les unitats transcripcionals poden ser mono o policistròniques (cistró = gen), segons si codifiquen per a un o més gens i tenen un o més ORFs, respectivament. En eucariotes, molts RNA mitocondrials són unitats policistròniques (ja que els mitocondris provenen d’un bacteri) però el demés genoma no.
La unitat policistrònica està formada per un conjunt de ORFs, uns al costat dels altres, que es codifiquen a partir d’un únic promotor. Solen tindre relació funcional i formen un operó, com l’operó lactosa, on tots estan relacionats amb la degradació d’aquest sucre.
Tindríem, per exemple, 3 gens i un únic promotor: promotor, TAG....STOP (para el ribosoma), TAG....STOP, TAG... terminador.
Els tres productes gènics estaran separats.
També tindrem 3 RBS (ribosome binding side  lloc d’unió del ribosoma): el frame que llegeix el ribosoma és el RBS. Per tant, al davant de cada ATG (codó inici) trobarem un RBS/SD per la unió del ribosoma.
Efecte polar sobre la traducció (el primer gen es tradueix més que els altres) La transcripció i la traducció estan acoblades en els procariotes (polisoma). La RNA polimerasa s’ancora al DNA, avança, i mentre genera un mRNA fins que es solti. Però en el moment que comença a penjar un mRNA i queda lliure un RBS, aquest és reconegut per un ribosoma i comença a traduir.
Però si tenim 3 gens com abans, importarà l’ordre d’aquests a l’hora de la traducció? Sí, ja que quan estem començant a traduir el primer gen, encara no s’ha començar a transcriure ni el segon ni el tercer. Per tant, al final, el primer gen s’haurà transcrit moltes més vegades que els altres dos ja que el seu RBS ha estat exposat als ribosomes molta més estona que els altres. A més, el mRNA comença a degradar-se per l’extrem 3’ (pel final), la qual cosa incrementa l’efecte polar sobre la traducció.
Quan un ribosoma entra i avança, un altre podrà entra i traduir a la vegada el mateix gen. A més, fins que no es desenganxa d’un STOP, cap altre ribosoma podrà veure el següent RNA i sols aquest el podrà detectar i traduir el segon gen. Tot açò és degut a que els ribosomes són molt grans respecte al mRNA.
Els ribosomes ajuden a desfer les estructures secundàries del mRNA (s’han fet ponts d’hidrogen entre regions complementaries) mentre aquests avancen sobre la cadena. La estructura secundària es forma quan la RNA polimerasa transcriu massa ràpid i el mRNA queda lliure i es plega per si sol. Doncs, el primer ribosoma que tradueix el va desplegant el mRNA i així ja es podran unir altres ribosomes a la RBS, ja que no es poden unir als mRNA de doble cadena.
La distància entre codons STOP, RBS i codons d’inici de transcripció és variable. La seqüència d’STOP i el RBS poden estar solapats. A més, si el RBS està al davant de l’STOP el gen igual serà funcional degut a: - El marc de lectura pot ser que sigui diferent i per tant, el ribosoma no llegirà el codó STOP.
- També pot ser que si el marc de lectura és el mateix, quan s’acaba d’ancorar el RNAt amb la metionina, no mira si hi ha STOP, sinó que sols busca l’ATG (codó d’inici de traducció).
També ens podem trobar l’RBS, l’ATG i després l’STOP, és a dir, gens solapats. Aquí sí que importarà el marc de lectura perquè sinó la proteïna serà molt curta i no serà funcional.
Per tant, els gens d’una mateixa unitat policistrònica pot estar en un mateix RNA amb 3 diferents marcs de lectura si els gens estan solapats.
Els RBS només són una seqüència d’unió del ribosoma per afinitat. Per tant, hi hauran RBS que seran millor o pitjors perquè tindran més o menys afinitat pel ribosoma. Si els 3 RBS tenen la mateixa afinitat, el primer dels gens es traduirà abans que els altres per l’efecte polar. Però si per exemple, el RBS del primer gen té molt poca afinitat, quasi que es traduiran per igual el 1r i el 2n gen.
Mutacions polars Les mutacions polars tenen efectes lluny d’on estan produïdes. Si tenim un mRNA amb 3 gens i es produeix una mutació sense sentit en un gen, el ribosoma no continuarà traduint aquest gen. Açò pot tindre efectes en la traducció dels següents gens. Per exemple, podria hi haure estructures secundaries que no deixen accedir al ribosoma als RBS; per tant, quasi que no es traduiran els altres gens.
Promotors bacterians L’inici de transcripció en eucariotes és més difícil que en procariotes. La RNA polimerasa s’enganxa al DNA per ella mateixa. Trobem les regions -35 (reconeixement de la RNA polimerasa) i -10 (lloc d’unió de la RNA polimerasa), les quals són regions consens, és a dir, surten de mirar tots els promotors i calcular quin nucleòtid és més probable que estigui en certa posició. Per exemple, el nucleòtid -35 és més probable que sigui una T. Pot ser que no sigui el millor, ja que açò sols indica la mitjana. Per tant, tindrem promotors forts i febles. Variant les regions d’ancoratge podem fer que la RNA polimerasa s’enganxi amb més força (i per tant, que aquell gen sigui transcrit més vegades) o menys (es transcriurà poc). És una altra manera de controlar l’expressió gènica.
No totes les espècies tenen la mateixa seqüència en les regions -10 i -35. Aquestes variaran per la RNA polimerasa, el contingut de GC... Per exemple, si el contingut en GC és alt, la regió TATA (TATCTC en Pseudomonas) es pot convertir en TAGGCT. Però, si agafem una regió promotora d’un microorganisme i la fiquem en un altre, funcionarà? Segurament sí, ja que és molt difícil que una regió promotora deixi de ser-ho. Per exemple, si és un promotor fort i el canviem de microorganisme, aquest pot ser es converteixi en un promotor feble.
A més, també afecten les posicions relatives. No sempre es troben exactament en la posició -10 i -35, sinó que la posició pot variar en uns pocs nucleòtids.
Tenim altres mecanismes relacionats per controlar l’expressió gènica. Pot existir més d’un promotor en la mateixa regió per incrementar els mecanismes de regulació i modulació de l’expressió gènica.
- - - Hi ha gens, unitats transcripcionals, que s’expressen a partir de dos promotors, però que no actuen alhora. Per exemple, es poden anar tornant i actuar en diferents casos.
Hi ha diferents promotors solapats i sols en funcionarà un (un tapa la regió -35 de l’altre). El gen serà el mateix però la unitat transcripcional sencera no.
Promotors enfrontats i oposats: sols es pot expressar un dels dos alhora.
- Promotors en unitats policistròniques que estan en mig d’una regió codificant. Per exemple, si tenim una unitat transcripcional que conté dos gens, podem tindre un promotor davant del primer geni un altre a meitat del primer gen. Quan la RNA polimerasa s’uneixi al segon promotor, sols s’expressarà el segon gen.
D’aquesta manera s’incrementaran els mecanismes de regulació i modulació de l’expressió gènica.
A part de les regions -35 i -10, en la regió promotora també trobem les regions upstream y downstream. Upstream es col·loca davant de la regió -35, 3pb abans, i normalment són regions activadores; en canvi, downstream es col·loca després de la -10, 3pb després, i sol ser repressora, ja que d’aquesta manera, la RNA polimerasa no podrà reconèixer la regió -35 o no podrà tirar endavant a partir del downstream. En aquestes zones és on s’ancoraran els reguladors transcripcionals: repressors i activadors.
Inici de la transcripció La RNA polimerasa reconeix les regions -35 i -10 i s’uneix. Quan està ancorada només es pararà si va molt poc a poc.
És una proteïna molt gran que reconeix la regió -35 i quasi només deixant-se caure ja troba la -10, sense pràcticament desplaçar-se. Si no trobés la -10 es desenganxaria degut a la baixa afinitat de la regió promotora.
Els upstreams serviran perquè si la RNA polimerasa la reconeix, serà més fàcil que vegi la regió -35 i comenci la transcripció.
A més, és necessari que la curvatura del DNA sigui idònia pel funcionament de la RNA polimerasa perquè es deixin lliures les regions -35 i -10. Però no necessitarem cap factor d’inici com en eucariotes. Si la regió és de baixa afinitat, poden hi haure proteïnes FIS que dobleguen el DNA perquè la RNA polimerasa pugui reconèixer la regió -35 i que l’expressió sigui forta.
Pot ser també que -35 i -10 estiguin més separades del que toquen. Als costats podríem tindre regions up i downstream als dos costats, que tinguin alta afinitat entre elles i mitjançant unes proteïnes, que s’apropen per fer que -10 i -35 estiguin a la distància que els toca. El promotor, que era bo, ara funcionarà correctament. Aquest mecanisme li va be a la cèl·lula per regular l’expressió gènica, i així expressar els gens quan li interessin.
RNA polimerasa La RNA polimerasa és un holoenzim que presenta diferents subunitats. Tots els gens implicats en la síntesi de la RNA polimerasa són els rpo.
- rpoB subunitat β s’encarrega de la unió dels nucleòtids.
rpoC subunitat β’ s’encarrega de la unió del DNA motlle.
Nucli de la rpoA subunitat α permet la interacció entre el DNA i RNA polimerasa l’holoenzim sencer, i de la unió al promotor.
rpoD a subunitat σ s’encarrega del reconeixement del promotor (-35) i de la unió en la -10.
La subunitat σ reconeix la regió -35. Però en procariotes tenim diferents subunitats σ i cadascuna d’elles té regions òptimes i consens diferents. Un cop el reconeixement de les regions -35 i -10 per σ i α s’han dut a terme, sols es quedarà el nucli de l’holoenzim. Segons la subunitat σ que tingui la RNA polimerasa, s’unirà a uns promotors o uns altres. Per tant, si controlem les concentracions de les diferents σ mitjançant el control de l’expressió gènica dels gens que codifiquen per aquestes subunitats, controlarem alhora l’expressió dels demés gens.
En la RNA polimerasa tenim un canal d’entrada i sortida de DNA i una altre de sortida del RNA. Quan σ està enganxada, el canal de sortida de RNA està tapat. Per tant, a l’hora de polimeritzar, σ ja no es troba formant part de l’holoenzim.
RNA i DNA polimerasa són molt diferents alhora de la seua acció: - Quan actua la DNA polimerasa, l’apertura de les dues cadenes de DNA es fa abans del seu pas.
Quan actua la RNA polimerasa, no hi ha cadenes obertes al davant i al darrere del seu pas. L’apertura del DNA es fa a l’interior del mateix enzim, com ho faria l’helicasa.
La RNA polimerasa es qui gira el DNA per evitar l’entortolligament (a l’igual que ho fa la girasa quan actua la DNA polimerasa).
Inici de la transcripció A la part externa del nucleoide del bacteri trobarem DNA, RNA i polimerases. La RNA polimerasa necessitarà reconèixer la regió -35 i -10 per poder iniciar la transcripció.
L’apoenzim s’unirà la subunitat σ per muntar l’holoenzim i reconèixer la regió -35. La subunitat σ reconeixerà la -35 i col·locarà la RNA polimerasa sobre la -10. Dintre de la RNA polimerasa es trenquen els ponts d’hidrogen en la regió -10 (rica en AT) i per tant, el complex estarà obert. Ara s’incorporaran els tres primers nucleòtids. Però σ tapa el canal de sortida de la cadena del mRNA i doncs l’holoenzim no pot avançar. Per aquest motiu, σ es desenganxarà de la RNA polimerasa i per tant el nucli de l’enzim (subunitats α, β i β’) es qui s’encarregarà de sintetitzar el mRNA.
Mentre la RNA polimerasa va obrint i tancant el DNA, no es veuen obertes davant i darrere del complex, ja que es fa tot a dintre del nucli del enzim.
El primer nucleòtid es copia del +1. Com la RNA polimerasa s’havia enganxat en el -10, fins al +1 s’ha estabilitzat ja que en el “trajecte” encara estava unida la subunitat σ, que fins que no s’han col·locat els tres primers nucleòtids no s’allibera (sols quan es necessari). A partir d’aquí, comença l’elongació del DNA. Al final, el mateix avanç de la RNA polimerasa farà que les dues cadenes de DNA s’obrin.
Estudis in-vitro han demostrat que si el DNA està en bon estat i es prou llarg, la RNA polimerasa pot estar enganxada al DNA fins a dies.
Un cop s’ha desenganxa, ja no podrà unir-se per on ho ha deixat, sinó que tindrà que tornar a una subunitat σ i començar per una regió -35. Per tant, la RNA polimerasa es poden reciclar.
Però haurem de parar la RNA polimerasa amb terminadors transcripcionals, ja que així no transcriurà el DNA sencer d’una tongada. Primer disminuirem la velocitat del complex gràcies a un bucle per que quan vagi a replicar el DNA que ja ha obert, no arribarà a fer-ho perquè va massa lent i les dues cadenes es tancaran abans de la transcripció (les quals ja no podrà tornar a obrir); per tant, la RNA polimerasa s’aturarà i saltarà.
Finalització de la transcripció Tenim dos mecanismes de terminació de la transcripció: 1. Rho dependent En aquest mecanismes està implicada la proteïna Rho, que té diferents propietats: - Pertany a la família de les RNA-DNA helicases: desfan les interaccions entre RNA i DNA.
Proteïna hexamèrica de subunitats idèntiques.
Domini d’unió a RNA i d’hidròlisis d’ATP.
Reconeix una seqüència específica en el RNA.
S’uneix al RNA i circula sobre ell fins atrapar a la RNA polimerasa.
Rho avança per RNA fins que s’estanca a la regió d’interacció, que es troba a tocar de la RNA polimerasa, que l’enganxa perquè vagi més lenta. La doble cadena s’anirà tancant i la polimerasa saltarà. Però a més, hi ha bucles en la regió terminadora que desestabilitzen la RNA polimerasa. Aquests bucles son estructures secundaries del RNA que s’originen a la sortida de la RNA polimerasa i que actuen com a tap de la sortida de la cadena de mRNA i dificulta l’avanç del complex. S’originen perquè hi ha dos regions palindròmiques (complementàries) en la regió terminadora: es codificarà en el DNA però es formarà en el RNA. No són unions massa estables, ja que conté moltes UA i per tant, hi ha ponts pont d’hidrogen.
Rho ha acabat evolucionant per arribar just a temps a la regió terminadora perquè la transcripció acabi quan toca.
Per aquest mètode de terminació pot sorgir un efecte polar sobre la transcripció: si tenim un RNA ple de ribosomes, Rho haurà d’anar a la velocitat del ribosoma. Però si tenim un tros sense ribosomes (perquè tenim una regió STOP degut a una mutació), Rho anirà molt més ràpid a la regió terminadora i no s’arribarà a traduir el gen sencer. Ací no caldrà cap loop.
Doncs, l’efecte polar sobre la transcripció és la no traducció del gen sencer: - Genotip: tenim el gen sencer.
Fenotip: sols tenim mig transcrit.
Però no sempre que hi hagi una mutació sense sentit hi haurà efecte polar, ja que açò dependrà de la zona del gen on es produeixi la mutació. Quan més a prop estigui la mutació del final (STOP verdader) del gen, menor efecte polar hi haurà.
2. Rho independent Ara no caldrà la proteïna Rho, sinó que només amb el loop es podrà parar la RNA polimerasa. Aquests loops són diferents, són molt estables degut a que presenten regions riques en GC seguides de regions riques en U en l’heterodímer de DNA-RNA (tindrà pocs ponts d’hidrogen). D’aquesta manera, serà més fàcil tirar del RNA, ja que tindrà poca afinitat pel DNA i la doble cadena tornarà a polimeritzar.
Per tant, el terminador Rho independent: - Formació del bucle Es tanca la “bombolla” Es desestabilitza la unió de la RNA polimerasa al DNA Finalització de la transcripció Els loops tant estables ajuden a que no es degradi el RNA.
Processat de RNA El processat de RNA consisteix en la síntesi de rRNA i tRNA.
La síntesi de rRNA es fa a partir dels gens rrn, els quals estan agrupats en unitats policistròniques repetides per tot el genoma (pot hi haure fins a 21 còpies d’aquests gens).
Sobretot es troben agrupades prop de l’oriC.
Les unitats transcripcionals tenen diferents gens per a les diferents subunitats del ribosoma (23S, 16S i 5S); no totes són iguals. A dintre de les unitats policistròniques també trobem gens que codifiquen pel tRNA: hi ha un o dos entre els gens de les subunitats 16S i 23S i després de la 5S hi ha fons a 2 còpies i fins i tot una de la 5S.
Per tant, des d’un únic promotor es transcriu la unitat policistrònica sencera i s’obté el transcrit primari. Després, aquest és processat per una endonucleasa per separar cada fragment i després per una exonucleasa per traure els extrems que pengen dels tRNA i rRNA.
En quant a la síntesi de tRNA, a part dels gens anteriors que es trobaven entre els del rRNA també n’hi ha que formen part d’unitats transcripcionals d’únicament tRNA. En aquest cas, també tindrem varies copies de diferents tRNA. El processat és pràcticament el mateix però, en canvi en els tRNA, el final de la seva seqüència sempre és la mateixa, la qual és reconeguda per l’enzim que enganxa l’aminoàcid que posteriorment carregarà. Aquest enzim reconeixerà la regió anticodó per saber quin aminoàcid ha de carregar i la seqüència repetida per saber on enganxar-lo.
Però podem trobar altres tRNA que no tenen aquest seqüència repetida. Doncs, una transferasa li uneix una d’aquestes seqüències per que el tRNA sigui funcional.
Control de l’operó rrnB Una altra de les coses que controla l’expressió dels gens, és la quantitat de ribosomes que hi ha a la cèl·lula. El control dels promotors es fa, per una banda, per les NAPs (FIS i H-NS), que torsionen el DNA i exposen els promotors a la RNA polimerasa. La torsió produïda per FIS és contrària a la generada per H-NS: - Interacció de FIS  Accessibilitat de la RNA polimerasa per una bona torsió del DNA.
Interacció de FIS i H-NS  Redueix l’accessibilitat de la RNA polimerasa.
Interacció de H-NS  Evita l’accessibilitat de la RNA polimerasa, ja que oculta els promotor perquè la RNA polimerasa no s’enganxi bé.
Controlant l’expressió d’aquests NAPs també controlem l’expressió de RNAr. En un medi ric, el bacteri tindrà una alta concentració de FIS i en un medi pobre una baixa concentració. També intervé el ppGpp.
...