TEMA 5 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Profesor M.C.M.G.
Año del apunte 2013
Páginas 7
Fecha de subida 09/06/2015
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TECNOLOGIA  DEL  DNA  RECOMBINANT       TEMA  5:  EXPRESIÓN  DE  PROTEÍNAS  RECOMBINANTES  EN  E.COLLI     Es  una  de  las  aplicaciones  más  importantes  del  clonaje  que  hemos  estudiado  en  los  temas  anteriores.       Hemos  de  tener  en  cuenta  que  NO  cualquier  tipo  de  vector  sirve,  sino  que  solo  podemos  utilizar  aquellos  que  tengan  las   características   imprescindibles   para   que   esto   se   pueda   hacer:   los   que   tengan   señales   necesarias   reconocibles   por   E.Colli:   Ø Promotor:   en   E.Colli   el   básico   es   lo   que   vemos   en   la   imagen,   una   caja   TATA,   a   unos   -­‐   10   del   origen   de   la   transcripción,   y   la   caja   CAGA   a   -­‐35   del   origen   de   replicación.     Ø Región  de  unión  al  ribosoma  (RBS).   Ø Señal  de  terminación.             El  vector  que  siempre  contiene  ya  estas  señales,  será  un  vector  de  expresión.         5.1  -­‐  Principales  promotores:          1  -­‐  Promotor  lac:  a  parte  de  utilizarse  para  la  selección  de  colonias,  hay  vectores  de  expresión  que  lo  utilizan  como   promotor  para  expresar  la  proteína  expresada  en  el  inserto.  Es  un  promotor   inducible  por  IPTG,  que  en  las  condiciones   in  vivo  es  el  inductor  que  se  utiliza.  Si  no  se  añade  IPTG,  no  habrá  expresión  de  la  proteína.     Esto   es   una   ventaja   porque   en   promotores   inducibles   interesa,   porque   esta   proteína   es   una   recombinante   que   puede   ser   letal   o   puede  disminuir  el  crecimiento  de  la  célula  bacteriana.              2   -­‐   Promotor   de   triptófano:   proviene   de   uno   de   los   genes   de   síntesis   de   triptófano,   y   la   región   promotora   se   utiliza   en   los   vectores.   Es   un   promotor   inducible;   cuando   no   queramos   expresión,   pondremos   triptófano,   y   cuando   queramos   expresión  quitaremos  el  triptófano.                3   –   Promotor   de   tac:   es   un   hibrido   entre   el   promotor   de   triptófano   y   de   lac;   es   más   eficiente   y   se   ha   construido   artificialmente.  Es  inducible  por  IPTG  porque  tiene  el  operador  de  lac.  Funciona  mejor  que  los  naturales.                4   –   Promotor   PL:   se   controla   por   temperatura.   Para   que   haya   transcripción,   hay   que   subir   la   temperatura   por   encima   de   30ºC,   y   por   debajo   de   30º   no   se   transcribe.   Para   E.Colli   no   sirve,   porque   su   crecimiento   a   menos   de   30ºC   el   crecimiento  es  muy  pequeño.                5  –  Promotor  T7:  es  inducible  por  IPTG,  pero  tiene  un  paso  intermedio  y  en  verdad  lo  que  esta  inducido  por  IPTG  es  la   síntesis   de   la   T7   RNA   polimerasa.   El   inserto   está   clonado   bajo   el   promotor   reconocible   para   la   T7   RNA   polimerasa.   Cuando  se  pone  IPTG  ,  se  sintetiza  T7  RNA  polimerasa  que  puede  reconocer  el  promotor  de  T7.                   5.2  –  Problemas  al  tratar  de  expresar  una  proteína  en  E.Colli:     1  -­‐    NO  podemos  clonar  un  inserto  que  tenga  intrones,  porque  E.Colli  no  es  capaz  de   hacer  splycing;  habrá  transcrito  primario  pero  no  se  podrá  traducir.  Solo  va  a   ocurrir  si  estamos  usando  genes  eucariotas.       2  -­‐  Terminación  prematura  de  la  transcripción:  puede  ser  que  en  nuestro  inserto   haya  algún  codón  que  E.Colli  lo  reconozca  como  una  parada  de  terminación  y  no   haya  traducción  de  todo  lo  del  transito  y  se  para.  No  es  muy  frecuente.                 3  –  Uso  de  codón:  el  código  genético  es  degenerado,  y  las  diferentes  especies   tienen  frecuencia  de  uso  de  codón  diferentes.  Para  aminoácidos  que  tienen  más  de   un  codón  posible,  hay  análisis  estadísticos  que  dicen  que  se  usan  mas  unos  o   otros.  Esto  se  ve  reflejado  en  la  cantidad  de  tRNAs  para  cada  codón.   Dependiendo  del  uso  de  codón,  la  abundancia  de  tRNA  para  cada  especie  varia   muchísimo.  Si  clonamos  en  gen  humano  en  E.Colli,  nos  podemos  encontrar   codones  que  son  muy  poco  frecuentes  en  E.Colli,  y  que  por  esto  haya  una   eficiencia  de  traducción  muy  pobre.     Cuando  pasa  se  puede  cambiar  el  uso  de  codón;  se  cambia  el  codón,  pero  NO  se   cambia  el  aminoácido.  Se  hace  sintetizando  una  región  del  gen  de  manera   artificial.       4  –  Formación  de  cuerpos  de  inclusión:  la  proteína  se  agrega,  bien  porque  se  expresan  en  mucha  cantidad  o  porque  el   plegamiento  en  E.Colli  no  lo  sabe  hacer  bien.  Se  forman  los  cuerpos  de  inclusión,  en  los  cuales  la  proteína  no  esta  bien   plegada,  no  tiene  actividad,  y  es  casi  imposible  solubilizarla  porque  no  se  disuelve  en  tampones  acuosos.                 5.3  –  Expresión  de  proteínas  recombinantes  en  E.Colli:     Ciclo  de  ingeniería  de  proteínas:     Cuando   expresamos   una   proteína   mediante   esta   técnica,   hemos   de   tener   en   cuenta   los   siguientes   aspectos:     Gen:   -­‐   Construcción   y   elección   del   promotor   óptimo,   que   controla   la   concentración   de   transcrito   que   se   traduce   y   las   condiciones  en  las  que  se  traduce  el  transcrito.   -­‐  Elección  del  uso  de  codón.  Genes  sintéticos.     -­‐  Optimización  del  inicio  de  la  traducción  y  estructura  secundaria  de  mRNA.   -­‐  Estabilidad  del  mRNA,  la  vida  media  del  mRNA  es  variable  en  los  mRNA  de  la  célula.   -­‐  Terminación  de  la  transcripción.     Proteína:   -­‐  Estabilidad  de  la  proteína:  puede  haber  problemas  de  plegamiento  que  necesiten  chaperonas  para  que  sea  correcto,   que  sean  proteínas  sensibles  a  proteasas..  una  de  las  cosas  que  se  suelen  probar  cuando  tenemos  estos  problemas  son   proteínas  de  fusión.   -­‐  Localización  de  la  proteína  en  diferentes  compartimentos  celulares.   -­‐  Detección  y  purificación.     Plásmido:   -­‐  Efecto  del  numero  de  copias.   -­‐  Estabilidad  del  plásmido.         Proteínas  de  fusión  o  proteínas  quiméricas:     Una  aplicación  muy  frecuente  es  hacer  proteínas  de  fusión,  en  las  cuales  el   gen   de   interés   que   queremos   expresar   (en   azul)   lo   ponemos   en   el   vector   pero   fusionado   a   una   zona   codificante   a   una   proteína.   Con   lo   cual,   la   proteína  final  va  a  ser  una  proteína  quimérica,  porque  consta  de  una  parte   que  la  naturaleza  de  esta  proteína  no  tiene  (rojo).     Es   importante   tener   en   cuenta   como   se   forma   el   punto   de   unión:   es   importante  que  NO  cambie  la  fase  de  lectura  de  lo  que  esta  detrás,  y  lo  que   no  importa  es  que  en  el  nexo  de  unión  haya  algún  aminoácido.       La   de   la  izquierda   seria   una   fusión   correcta,   porque   el   gen   en   rojo   conserva   el  marco  de  lectura,  pro  tanto  se  va  a  traducir  correctamente.  En  cambio,  a   la   derecha,   la   fase   de   lectura   cambia,   por   tanto   no   va   a   dar   la   proteína   correcta.         Un   ejemplo   de   estas   proteínas   quiméricas   son   las   proteínas   quiméricas   fluorescentes:   las   proteínas   fluorescentes,   la   primera   que   se   empezó   a   utilizar  es  la  FFP  (Green  fluorescent  protein),  que  se  clona  en  fusión  a  otra.   Esta   al   revés   del   anterior;   nuestro   gen   (gen   X)   está   delante   del   gen   que   codifica   la   proteína   GFP   (gen   reporter);   no   importa   el   orden   en   que   ponemos   los   genes,   solo   en   aquellos   casos   en   que   la   posición   influye   al   plegamiento   de   la   proteína.           Si  estamos  expresando  en  unas  células  y  lo  iluminamos  con  un  laser,  vemos  las  proteínas   que  están  unidas  a  la  GFP  porque  ésta  nos  da  fluorescencia;  por  esto  se  llama  reporter!     Si   hemos   hecho   una   fusión,   donde   veamos     la   proteína   verde   también   estará   la   nuestra,   porque  forman  una  única  proteína.       A  partir  de  la  GFP,  que  fue  la  primera,  se  han  hecho   mutagénesis  para  modificar  la  zona  de   emisión   de   fluorescencia   y   obtener   variedades   que   emiten   en   el   rojo,   azul   y   amarillo;   con   lo   cual   es   muy   útil   porque   en   la  misma  célula  podemos  codificar  distintas  proteínas,  que  se  verán  de  un  color  de  fluorescencia  diferente.                                5.3.1  –  Sistemas  de  expresión  más  utilizados  en  E.Colli:     Vectores  para  expresión:  pGEX:     Son  dos  vectores,  el  pGEX-­‐2T,  y  el  pGEX-­‐3X.  El  nombre,  viene  de  que  en  este  tipo  de  vectores,  cuando  clonamos  nuestro   gen  para  expresarlo,  el  resultado  va  a  ser  …  .     En   cualquier   de   los   dos   vectores   que   aparecen,   vemos   que   las   dianas   están   colocadas   en   el   polilinker,   y   el   gen   de   la   liciafil  transferasa  esta  justo  detrás.  Por  tanto,  a  la  hora  de  abrir  y  clonar  hemos  de  tener  mucho  en  cuenta  que  quede  en   fase.   Vemos  que  justo  antes  de  las  dianas  de  clonaje  hay  una  secuencia  de  nucleótidos,  que  es  una  zona  de  reconocimiento   del  factor  X  de  coagulación  de  la  sangre,  que  es  una  proteasa.  Por  tanto,  si  abrimos  y  colocamos  el  inserto,  la  proteína   quimérica  resultante  va  a  estar  construida  por  la  enzima,  el  factor  de  reconocimiento  del  factor  X  y  nuestra  proteína;   contendrá  estas  3  regiones:    GST  +  factor  X  +  proteína  X.     Por  tanto,  este  tipo  de  vectores  están  preparados  para  hacer  una  proteína  de  fusión.     Si  miramos  al  de  la  izquierda,  es  igual  excepto  el  linker  que  hay  delante  de  la  proteína  X,  que  en  vez  de  ser  la  zona  de   reconocimiento  para  el  factor  X  es  una  zona  de  reconocimiento  para  la  trombina.                                     Como   se   usa   ??   purificación   de   GST-­‐proteínas:   el   hecho   que   esté   como   proteína   de   fusión   es   importante   para   la   purificación  de  la  proteína  cuando  la  hayamos  expresado  en  E.Colli,  porque  la  enzima  se  puede  unir  con  una  afinidad   especifica  al  glutatión.     Esta   proteína   recombinante   que   estará   dentro   de   E.Colli,   se   puede   purificar   en   un   solo   paso   haciendo   extractos   celulares   pasando   por   una   columna   que   contiene   glutatión   (tripéptido)   con   bolas   de   Sepharosa.   Si   a   esta   columna   la   cargamos   con   el   extracto   celular   recibido   de   E.Colli   donde   esta   expresada   la   proteína   de   fusión   que   contiene   nuestra   proteína,   se   va   a   quedar   unida  al  glutatión  por  medio  de  la  GST.       Después,   para   inhibir   la   proteína   recombinante   de   la   columna,   añadimos  glutatión,  y  eluye  la  proteína  de  fusión  modificada.   En  un  único  paso,  tendremos  purificada  nuestra  proteína  de  fusión!     Además,   si   queremos   deshacernos   de   la   parte   de   la   GST,   podemos   hacerlo   en   un   paso   posterior;   una   vez   que   lo   tenemos   modificado,   añadimos   o   trombina   o   factor   X,   y   entonces   lo   va   a   clonar,   porque   tiene   un   sitio   de   corte   para   la   proteasa   que   va   a   funcionar   correctamente.     En   muchos   casos,   si   en   vez   de   una   proteína   es   una   enzima,   la   actividad  la  conserva  porque  el  plegamiento  es  correcto.           Vectores  de  expresión:  plásmidos  pET:      plasmyd  for  repression  by  T7  RNA  polymerase.       La  base  del  sistema  es  distinta  del  que  acabamos  de  ver;  son  mucho  mas  versátiles  y  hay  muchas  familias  basadas  en   este  sistema.   La  base  del  sistema  es  que  la  expresión  del  gen  que  clonamos  esta  bajo  control  de  la  T7  RNA  polimerasa.  Si  empezamos   por   la   derecha,   en   la   zona   de   clonaje,   el   target   gene   va   a   estar   siempre   bajo   el   promotor   T7.   Este   promotor   ya   esta   siempre  en  los  vectores  y  tiene  siempre  el  operón  lac;  es  un  hibrido,  que  hace  que  el  promotor  sea  inducible  por  IPTG   para  que  no  haya  una  expresión  constitutiva.   Justo   detrás   del   promotor   están   las   dianas   de   clonaje   para   insertar   el   vector,   y   para   que   sea   controlado   por   este   promotor.     La   T7   RNA   polimerasa   no   la   produce   una   E.Colli   normal,   por   tanto   estas   cepas   de   E.Colli   tienen   que   haber   sido   modificadas,  y  estas  cepas  tendrán  el  gen  que  codificara  la  T7  RNA  polimerasa.  Estas  cepas  tienen  DE3,  que  es  un  fago   lambda  que  esta  en  forma  lisógena  dentro  de  estas  cepas  y  que  tienen  esta  construcción.     Como   funciona   ??  si  nosotros  transformamos  estas  cepas,  a  continuación,  si  ponemos  IPTG,  lo  que  va  a  pasar  es  que  se   va   a   expresar   el   gen   de   la   T7   RNA   polimerasa   bajo   el   promotor   lac,   por   tanto   se   va   a   producir   enzima   T7   RNA   polimerasa,  y  va  a  reconocer  el  promotor  T7,  que  también  es  inducible  por  IPTG.   Por  tanto  el  IPTG  sirve  para  activar  el  promotor  que  produce  la  T7  RNA  polimerasa  como  para  activar  la  transcripción   de  la  T7  RNA  polimerasa.  Al  producirse  el  reconocimiento  del  promotor  y  la  activación  de  la  transcripción,  se  transcribe   el  gen  y  se  traduce  la  proteína.     La  T7  RNA  polimerasa  es  muy  especifica  en  las  regiones  promotoras,  por  tanto  se  sabe  que  solo  va  a  activar  los  genes   que  estén  bajo  el  control  de  su  promotor.       Además,   hay   algo   adicional:   el   promotor   lac,   bajo   el   cual   esta   clonado   el   gen   de   la   T7   RNA   polimerasa,   tiene   un   poco   de   transcripción  basal;  incluso  sin  IPTG  hay  un  poco  de  transcripción.  Si  hay  un  poco  de  transcripción,  querrá  decir  que   hay  un  poco  de  síntesis  de  RNA  polimerasa;  este  poco  va  a  activar  un  poco  del  gen  que  hemos  clonado,  y  se  va  a  dar   expresión  basal  de  este  gen.   Pero   en   algunos   casos,   estamos   trabajando   con   una   proteína   que   aunque   se   produzca   muy   poca   cantidad   basal,   se   expresa  mucho.  Para  evitar  esto:  utilizamos  una  cepa  huésped,  que  además  de  lo  de  antes,  contiene  un  plasmido  que   codifica  por  la  lisozima  del  fago  T7.     Esta  lisozima  tiene  la  propiedad  de  que  se  une  a  la  T7  RNA  polimerasa  y  la  inactiva,  es  como  un  inhibidor  natural.  Estas   cepas  expresan  esta  lisozima,  que  la  poca  cantidad  de  T7  RNA  basal  que  se  produce,  se  inactiva  (en  el  pie  de  figura  de  la   pagina  12  esta  explicado).                                                   Este  sistema  se  utiliza  muchísimo,  y  hay  una  gran  variedad  de  vectores  que  tienen  diferencias  en  la  zona  donde  vamos  a   clonar:   (el   hecho   que   se   muestre   de   forma   lineal   es   porque   solo   se   muestra   la   zona   relevante   para   el   clonaje,   en   verdad   es  un  plasmido)   Las  zonas  de  clonaje  están  detrás  de  un  promotor  que  es  o  bien  el  T7  lac  (hace  que  sea  inducible  por  IPTG)  o  bien  un   hibrido  que  es  el  promotor  tac;  también  tienen  el  RBS;  y  luego  hay  variaciones,  porque  permite  diferentes  usos:     1   -­‐   Región   que   codifica   por   el   péptido   señal   de   la   peptadoliasa;   no   está   toda   la   enzima,   solo   el   péptido   señal,   que   transporta   la   proteína   que   tenga  este  trozo  al  espacio  periplásmico.  Como  está  justo  delante  de  la  zona  de  clonaje,  si  lo   metemos  en  fase,  se  va  al  espacio  periplásmico,  donde  será  mas  fácil  de  purificar.     Detrás,  tenemos  un  elemento  que  es  una  cola  de  histidinas:  HisTag;  hay  el  codón  para  histidinas  repetido  varias  veces,  y   tiene  que  quedar  en  fase  con  lo  que  hemos  clonado  dentro.  Teniendo  la  PCR  es  relativamente  fácil.     Por  tanto,  si  usamos  este  vector  vamos  a  tener  una  proteína  final  que  consiste  en  el  péptido  final  de  la  peptadoliasa  +  la   proteína  X  +  las  histidinas  (repetidas  el  numero  de  veces  que  sea)  y  exportada  al  espacio  periplásmico.     La   cola   de   histidinas   se   usa   mucho   porque   es   muy   útil   para   purificar,   estas   colas   se   unen   a   columnas   de   níquel   con   agarosa.  Al  pasar  el  extracto  de  proteínas,  solo  se  quedan  fijadas  las  proteínas  que  nos  interesan.                     2  -­‐  En  el  segundo  también  hay  cola  de  histidinas  en  el  c-­‐terminal.                   3  -­‐  No  tiene  la  zona  de  histidinas;  tiene  por  delante  la  zona  que  codifica  la  maltosa  binding  protein,  que  también  permite   purificación.                                  5.3.2  –  Traducción  in  vitro  (cell-­‐free  system):       La   traducción   de   proteínas   se   puede   hacer   también   in   vitro;   que   también   se   llaman  sistemas  libres  de  células.   Nos   fijamos   en   la   parte   de   la   izquierda:   se   puede   hacer   un   acoplamiento   de   transcripción  in  vitro  y  traducción  in  vitro.  Si  tenemos  RNA  transcrito  in  vitro,  le   añadimos  los  sistemas  para  la  traducción  (extractos  celulares  que  pueden  ser  de   reticulocitos   de   conejo   y   de   germen   de   trigo).   Estos   extractos   son   capaces   de   traducir  estos  RNAs  in  vitro.       Si  además,  uno  de  los  aminoácidos  se  lo  subministramos  marcado,  por  ejemplo   la  metionina  típicamente,  podemos  ver  la  traducción  por  autoradiografía.         ...