PROBLEMA 4 (2016)

Ejercicio Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2016
Páginas 2
Fecha de subida 07/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

PROBLEMA 4 La importació dels factors de transcripció dins el nucli sol estar regulada per diferents mecanismes (fosforilació, associació a una proteïna inhibidora, etc.). La teva recerca està centrada en esbrinar com es regula la importació del factor de transcripció NF B dins el nucli. La proteïna NF B es troba present en els extractes nuclears de les cèl·lules B, que sintetitzen immunoglobulines. Aquesta proteïna s'uneix a una seqüència de DNA (un enhancer) en el gen que codifica per la cadena lleugera de les immunoglobulines, activant la seva expressió. La proteïna NF B no es troba present en els extractes nuclears dels precursors de les cèl·lules B (cèl·lules pre-B), que no sintetitzen immunoglobulines.
Observes, però, que els extractes citoplasmàtics de les cèl·lules pre-B contenen una forma inactiva de la proteïna NF B, que no es capaç d'unir-se al DNA. Quan aquestes cèl·lules es tracten amb éster de forbol (un activador de la quinasa C), als pocs minuts la proteïna NF B entra dins el nucli i s'uneix al DNA, activant la transcripció del gen de la cadena lleugera . Aquesta activació de la proteïna NF B no es veu bloquejada per la cicloheximida, un inhibidor de la síntesi proteica. La proteïna NF B també pot ser activada i unir-se al DNA si es tracta amb un agent desnaturalitzant suau (els agents desnaturalitzants destrueixen els enllaços no covalents però no poden destruir els enllaços covalents).
Per tal d'entendre com es produeix l'activació de la proteïna NF B i com es regula la seva importació dins el nucli, aïlles la fracció nuclear (N) i la fracció citoplasmàtica (C) de les cèl·lules pre-B abans i després de l'estimulació d'aquestes cèl·lules amb l'éster de forbol. Llavors mesures l'activitat de la proteïna NF B en aquests extractes, abans i després del tractament dels extractes amb agents desnaturalitzants suaus. Per mesurar l'activitat de NF B tens en compte la seva habilitat per formar un complex amb fragments marcats de DNA que contenen l'enhancer (aquests complexes migren més lentament en els gels). Els resultats obtinguts es mostren a la següent figura.
a) Explica com canvia la localització dins la cèl·lula de la proteïna NF B en les cèl·lules pre-B tractades i no tractades amb l'éster de forbol.
Quan les cèl·lules pre-B no están tractades amb l’éster de forbol, la proteïna NFkB no s’expressa, i es troba al citosol fosforilada o regulada per algun mecanisme d’hinibició. Per tant, no es capaç de realitzar la seva funció, que en aquest cas es tracta de la transcripció del gen que codifica la cadena lleugera k de les immunoglobulines, i en conseqüència l’activació de la seva expressió.
En canvi, quan aquestes cèl·lules pre-B són tractades amb l’érter de forbol, podem veure com la proteïna NFkB s’activa, entrant dins del nucli i unint-se al DNA, gràcies a la fosforilació de l’inhibidor per part de la quinasa C activada per l’éster de forbol. Per això, en la figura resultant podem veure que quan hi ha la presencia de l’éster de forbol, trobem la proteïna unida amb DNA formant un complex en la fracció nuclear (dins del nucli).
b) Explica l'efecte del tractament amb agents desnaturalitzants suaus en l'activació de la proteïna NF B en els extractes de les cèl·lules pre-B tractades i no tractades amb l'éster de forbol.
Les cèl·lules pre-B no tractades amb l’éster de forbol presenten la proteïna NFkB unida amb el DNA formant un complex a la fracció citoplasmàtica quan se li afegeix aquest desnaturalitzant suau. En canvi, no trobem aquest complex NFkB més DNA a la fracció nuclear que presenta les mateixes condicions que l’anterior.
Per tant, quan se li afegeix el desnaturalitzant suau, la proteïna NFkB es modifica estructuralment (es trenquen els seus enllaços no covalents) i s’allibera de l’inhibidor que l’estava retenint. Produint així la seva unió amb una importina i conseqüentment la importació d’aquest factor de transcripció dins del nucli per unir-se amb el DNA de la cèl·lula i transcriure’n algun gen. Però al estar modificada estructuralment, te més facilitat per tornar a sortir de la cèl·lula perquè ha guanyat afinitat amb la exportina que l’ajuda a travessar el porus, per tant enlloc de trobar aquest complex NFkB més DNA al nucli, quan enlloc de éster de forbol li afegim un desnaturalitzant suau, aquest complex el trobem al citoplasma perquè fa aquest procés de transcripció i exportació més ràpidment.
En canvi, en les cèl·lules pre-B tractades amb l’éster de forbol presenten la proteïna NfkB unida amb el DNA formant un complex a la fracció nuclear quan se li afegeixen agents desnaturalitzants suaus. I contrastant amb el cas anterior, en aquest trobem que la fracció nuclear no presenta aquest complex quan se li afegeix el éster de forbol i els desnaturalitzants suaus.
En aquest cas, quan es desnaturalitza suaument la proteïna NFkB aquesta canvia de conformació i es separa de l’inhibidor o de la fosforilació que el retenia, però en aquesta situació, també influeix l’éster de forbol en l’activació d’aquesta proteïna, per tant es realitza el mateix procés anomenat anteriorment i la proteïna NFkB s’uneix a una importina que l’ajuda a entrar al nucli per activar l’expressió del gen que codifica la cadena lleugera k de les immunoglobulines. Tot i això, en aquest cas, la proteïna unida al DNA la trobem en la fracció nuclear perquè al entrar i al realitzar la transcripció es veu bloquejada per la cicloheximida, un inhibidor de síntesi proteica que no reconeix la proteïna unida a la l’éster de forbol i enredereix tot el procés.
c) Creus que l'activació de NF B en resposta al tractament amb l'éster de forbol té lloc perquè la proteïna NF B és fosforilada? Quan la proteïna NFkB és s’activa en resposta al tractament amb l’éster de forbol, aquest procés no té lloc perquè aquesta proteïna està fosforilada, ja que l’éster de forbol el que fa és activar la quinasa C, una proteïna que està involucrada en el control d’altres proteïnes mitjançant la fosforilació dels grups hidroxil, fet que és contrari al que nosaltres voldríem per alliberar la proteïna NFkB regulada per fosforilació. En aquest cas el que nosaltres volem és l’activació d’una fosfatasa que elimini un grup fosfat de substrat de la proteïna per hidròlisi de l’àcid fosfòric monoèster cap a l’ió fosfat i una molècula amb un grup hidroxil lliure, procés anomenat desfosforilació. Procés, com ja hem dit, totalment contrari al de les quinases, les quals uneixen grups fosfat als seus substrats utilitzant l’energia de l’ATP.
Per tant, podem assegurar que l’activació de NFkB en resposta al tractament amb l’éster de forbol no té lloc perquè la proteïna NFkB és fosforilada; contràriament podem assegurar que l’activació d’aquesta proteïna en resposta al tractament amb l’éster de forbol te lloc perquè la proteïna NFkB està unida a un inhibidor, ja que quan la proteïna es troba unida a un inhibidor i es vol alliberar, cal fosforilar aquest inhibidor per separar la proteïna, aspecte que només pot realitzar una proteïna fosforiladora com la quinasa C que s’activa en resposta a la presencia de l’éster de forbol, i deixar-la lliure perquè s’uneixi a les importines que les duran a l’interior del nucli.
d) Com creus que els agents desnaturalitzants suaus provoquen l'activació de NF B? Els agents desnaturalitzants suaus provoques l’activació de la proteïna NFkB perquè tenen la capacitat de modificar la seva conformació estructural, i per tant, l’inhibidor utilitzar per amagar aquesta proteïna ja no serveix, ja que tot i no modificar-la totalment, la proteïna canvia i l’inhibidor ja no es pot acoblar a la zona on es trobava instal·lat. Tot i això, com que la proteïna només ha modificat els seus enllaços més simples, que són els no covalents, l’importina encara la pot reconèixer, i per tant és capaç d’entrar al nucli i realitzar la seva funció de transcripció.
e) Proposa un model per explicar de manera senzilla el mecanisme molecular que dona lloc a la importació dins el nucli i l'activació de la proteïna NF B amb el tractament amb l'éster de forbol.
Importació de la proteína NFkB dins del nucli i la seva activació: 1. La proteína NFkB està unida a un inhibidor que no deixa que aquesta s’expressi.
2. Quan a la mostra se li afegeix l’éster de forbol aquest activa la quinsa C, que es tracta d’una proteína fosforilativa que fosforila l’inhibidor que s’unia a la proteína NFkB deixant-la lliure.
3. Un cop lliure la proteína NFkB forma un complex amb una importina, que li permet entrar pel porus nuclear fins al nucleoplasma. Això s’ucceeix gràcies a que aquesta importina modifica els filaments FG que hi ha dins del porus per poder travesar-lo.
...

Comprar Previsualizar