T.7 - Microscopi òptic (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 4º curso
Asignatura Tècniques de diagnòstic
Año del apunte 2016
Páginas 23
Fecha de subida 02/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Tècniques de diagnòstic TEMA 7. MICROSCOPI ÒPTIC La llum des del punt de vista físic es propaga com una ona electromagnètica i interactua amb la matèria com una partícula.
La longitud d'ona és la distància entre dos pics consecutius.
Aquesta onan electromagnètica es propaga en forma de paquets que s'anomenen fotons que són els que quan interactuen amb la matèria ho fan com si fossin una partícula. Aquests fotons tenen una energia molt petita que està relacionada amb la longitud d'ona a través de la fòrmula E: energia del fotó, h= constant de Planck , C= velocitat de la llum al buit, lambda= longitud d'ona Com més gran és la longitud d'ona menor és la energia.
Geometric optics: image formation La focal és la propietat essencial de les lents. La majoria dels objectius tenen lents convergents en el seu interior. Les lents convergents quan hi arriba llum paral·lela convergeix en un punt focal .
Les imatges es formen per les lents. La feina de les lents es col·lectar la llum de cada punt en l'objecte i refractar-lo a un punt corresponent de la imatge.
Sempre hi ha una pèrdua d'informació en la imatge perquè no tota la llum de l'objecte pot ser col·lectada.
Els raigs que arriben paral·lels a l'eix òptic són refractades al punt focal de la lent. Els rajos que passen pel centre de la lent no són refractats.
27 Tècniques de diagnòstic Reflection and refraction laws Índex de refracció: el radi entre la velocitat de llum en el buit respecte la velocitat de la llum en un medi determiant. Serà menor al buit.
Com més alt és l'index de refradcció significa que es propaga a una velocitat menor.
Quan hi ha un canvi de refracció hi ha una part de la llum que es reflexa i una part de la llum que es transmet, van determinades per les lleis de Snells.
Des del punt de vista del microscopi optic, la seva funció es que capta la maxima quanitat de llum que ve de la mostra i així pot augmentar-la per poder veure el maxim de detalls. El fet que hi hagi una part de la llum que es reflexa es part de la llum que no arriba al nostre ull, i un altre aspecte es que si el canvi és de menor a major index de refracció es que es transmet s'apropa a la normal. Mentre que si passa de major a menor, el que passa es que s'allunya de la normal i aquet fet no ens interesasa. La llum des de que surt de la mostra fins al nostre ull tendirem a que es mantingui constant o bé que sigui major.
Els antireflexants el que fan es atenuar la reflexió.
Dispersió L'índex de refracció no es constant, depen de la longitud d'ona. Qualsevol lent desviarà llum d'un color amb un angle diferent.
La focal d'una lent no és fixa sino que depen lleugreramnt de la longitud d'ona, llums de colors didferents en una lent convergent convergiran en punts de l'espai diferents.
28 Tècniques de diagnòstic Això passa en totes les lents convergents, també en la retina i les lents del nostre ull. Però afortunadament la retina no té prou resolució espaial per captar les diferents distàncies focals i per tant veiem tots els colors a la mateixa distància.
En canvi a les càmeres dels microscopis això si que els afecta.
La llum que prove d'una part de la mostra, es forma una imatge en parts diferents però la iamtge que es forma no es clara i això es una aberració òptica. L'aberració optica es deguda al fet que l'index de refració s'anomena aberració cromàtica.
L'aberració cromàtica és una de les mes importants sobretot en fluorescencia.
Aberracions Les aberracions són múltiples punts de focus que es produeixen a causa de les lents en la imatge. Les aberracions fan que les imatges siguin de poca qualitat i estiguin borroses.
Una altra aberració important es la esferica que ens diu que l'equació de les lents funciona per rajos de llum que incideixen a la lent de manera molt propera a l'eix central de la lent però si ens allunyem del centre de la lent (eix optic) comencen a haver efectes no linials. Per això la visió realiseta es la de baix, com mes lluny incideix la llum respecte de l'eix optic, la lent convergent ho fa convergir a un punt de l'espai diferent als rajos que arriben més a prop.
Això fa que la imatge sigui una taca borrosa, una aberració esfèrica.
Es pot corregir afegint nous components optics.
29 Tècniques de diagnòstic Per corregir l'aberració cromatica afegim una segona lent (lent acromàtica) i així la llum roja i groga tindran el mateix punt focal. Cada lent servirà per corregir un color. Com més lents posem més possibilitat de tenir una aberració esferica.
Les lents acromàtiques estan fetes en dues parts i pot fer que qualsevols dos colors vagin cap al mateix focus però al mateix temps altres colors es mantinguin lleugerament fora del focus.
Overview of an optical microscopi Hi ha una part on es coloca la mostra, una font d'iluminació i un ssitema optic que optimitza la llum que srut de la font i que es diu condensador., A l'altra banda de la mostra hi ha l'objectiu que fa la feina de recollir la llum que prove de la mostra i que ha interactuat amb la msotra perquè la que no interactua amb al amostra no es diu res, no ens interessa.
Aquest objectiu controla els dos aspectes mes importants que es la magnificació i la resolució. La magnificació és l'augment de la imatge respecte l'objecte, com més magnificació més detall podem veure. També controla la resolució que es la capacitat de distingir dos punts propers de la mostra.
L'ocular ens adapta la llum de forma que podem veure bé per l'ull o per la càmara i ens ódna una mica de magnificació addicional. Per tant la magnificació tota l és el producte de l'objectiu més l'ocular.
La resolució depen només de l'objectiu.
30 Tècniques de diagnòstic Lens used in microscopy are objectives Les prestacions que ens interessen son les que hi ah a la prt superior, es a dir el nom. 60X és la magnificació i els altres noms ens diuen les aberracions que corregeixen.
Les magnificacions possibles estan estandaritzades que són 1x, 2x, 4x,10x, 20x, 40x... Les mangificacions mes baixes son les que s'utiltizen a histologia, amb biologia celualr s'utiltizen les de 10x-40x on es poden veure bé les celules i les més altes s'utilizen per mirar detalls en tincions amb immunofluorescència.
Corrections in lenses Les aberracions es poden corregir de froma limitada. Segons l'aplicació que es necessita es triara un objectiu o un alters segons les aberracions que es corregeixen. Com mes aberracions es corregeixen mes car es l'objectiu.
Com a molt es poden corregir 5 colors en l'aberració cromatica. A immunofluorescencia si tenim una mostra marcada amb tres colors diferents i volem que la matge es formi en el mateix punt ens interessara que hi hagi el maxim de correccions.
Per l'aberració esferica es pot correigr fins a 3-4 colors.
Segons si les aberracions corregides son esferiques o cromataiques rep un nom o un altre.
Com més correccions més lents tindra en el seu interior. Imatge de l'interior amb la quanitt de lents. La col·locació i muntatge no es trival, ha des ser motl alineat i estable, perquè qualsevol desplaçament de la carcasa fa que es puguin moure i per tant desenfocar.
31 Tècniques de diagnòstic Apertura numerica: index que ens dona idea de la capacitaat de captació de llum d'un objectiu, com mes gran es el numero mes capacitat de captar llum. La lletra la costat del numero ens diu quin medi es troba la maxima captacio de llum: aire, aigua o oli.
Resolution and numerical aperture L'index de d'apertura numero (NA) apareix molt frequentment, es va definir com el producte de l'index de refracció entre mostra i l'entrada de llum i el sinus de l'angle alfa que es l'angle que es forma entre l'eix optic de l'objectiu i el maxim angle des de l'eix optic fins l'entrada de l'objectiu. Aquest angle alfa defineix el con d'entrada de la llum des de la mostra fins a l'entrada de l'objectiu. Com més gran sigui aquest con, aquest angle, més llum estarem captant de la mostra.
Si hi ha una mostra amb poca proteina i la volem detectar es quan necessitarem una apertura mes bona, si anem sobrats de llum no ens cal una bona obertura numerica.
Com mes apertura numerica mes car l'objectiu. Com mes gran es l'apertura numerica, mes grans son les lents i l'aberració esferica es mes gran.
Degut a la difracció, la imatge d'un punt mai és un punt, sino que es una taca. Es una limitació fisica.
32 Tècniques de diagnòstic NA, AIRY DISC and RESOLVING POWER La imatge que forma l'objectiu a del punt de la mostra no serà un punt sino que seàr una taca amb una distribució tridimensional segons la intensitat. En el centre hi ha un pic que és una intensitat motl elevada que s'anomena disc d'airy i al voltant hi ha unes ones que constitueixen un patró d'ones constructives i destructives i que conformen el patró d'intensitat.
Aquest tamany depen de la longitud d'ona de la llum amb la qual estan il·luminant la mostra. Si tenim un punt , la imatge que ens forma l'objectiu serà una taca.
El poder de resolució d'un objectiu es aquell a partir del qual vec dos taques com una sola. Airy discs b) dos taques que poden distingir bé, però arriba un punt que si els punts de la mostra estan molt propers les taques també seran molt properes. La minima distancia on podem distingir dos punts de l'espai es quan la meitat de la taca d'un coincideix amb la meitat de la taca de l'altre, a partir d'aqui les taques es solapen i només les veiem com una sola. Això s'anomena el criteri de Rayleigh.
Aquest poder de resolució R, està relacionat amb la longitud d'ona i amb l'apertura numèrica de l'objectiu.
Aquesta expressió ens permet determinar per un determinat objectiu i una determinada iluminació, el poder de resolució de l'objectiu.
R= 0.61 x lambda/ NA Geometric optics: resolution and numerical aperture En general com més magnificació més obertura numèrica, però no es 100% així. En l'últim objectiu veiem que la magnificació és de 100x per`té una apertura numèrica inferior que l'objectiu de 63x perquè dpen de la finestra d'entrada de l'objectiu. La resolució que s'obté està en micres i la que tenim amb l'objectiu més gran és de 0.26 micres.
Amb un objectiu normal de microscopia convencional la resolució és de al voltant de 200 nm.
Hi ha tècnqiues que permeten baixar aquesta resolució com la microscopia electrònica que utilitzen electrons amb caracter ondulatori i longitud d'ona menor.
33 Tècniques de diagnòstic Instrumentation: the basic optical microscopi HI ha dues configuracions, una on l'objectiu està per sobre de la mostra que és la confiugració upright.
Aquesta seria la ideal ja que si tens la mostra abaix de l'objectiu el pots apropar tant com vulguis i fins i tot pots posar entremig un medi que tingui un índex de refracció més alt que l'aire acumulant llum que provingui de la mostra. La configuració upright hi ha només un medi de diferència entre la mostra i l'objectiu que pot ser aire, aigua o oli, depenent de l'objectiu que utilitzis.
Una altra configuració és quan l'objectiu està abaix de la mostra, s'anomena configuració invertida. S'utiltiza sobretot en cultius cel·lulars. Quan tenim una placa aquesta està tapada per la tapa, llavors per una configuració òptima és millor així. La llum que travessa la mostra travessa per dos canvis d'índex de refracció, primer el plàstic o vidre, i després serà el medi que hi hagi en mig com l'aire, aigua o oli. Tenim dos canvis d'índexs de refracció. En la configuració upright només teniem un índex de refracció. Cada cop que hi ha un canvi de medi hi ha una penalització, és a dir que estem perdent llum que és informació.
Independentment de si estem en la configuració invertida o upright sempre tenen els mateixos components.
Instrumentation: the basic optical microscope Mostra, punt d'iluminació, condensador, objectiu que recull la llum que prove de la mostra i l'ocular que agafa la llum de l'objectiu perquè el poguem mirar comodament.
Estratègies per maximitar la captació de la llum que prove de la mostra i que ha interactuat amb la mostra.
La major part de la llum de la mostra biològica que no interaccion no té informació, llavors hi ha dos 34 Tècniques de diagnòstic estrategies que aconsegueixen reduir la llum que travessa la mostra sense interactuar amb ella i maximitzar la captació de la llum que si que interactua amb la mostra i que si que conte informació.
Tenim la microscopia de contrsts de fase que ho va inventar el sernyor Zernike. Si tenim una font d'iluminació i la mostra, el que va proposar es que no deixem que arribi tota la llum de la font d'iluminació sino que la filtrem col·locant un anell que bloqueja la llum en la zona central i només deixa passar la llum pels costats.
L'objectiu el va modificar col·locant un anell invers que era opac just a la zona corresponent de la imatge de l'anell de dalt. La llum que travessa l'anell primer i que arriba a la mostra i que traessa la mostra sense interactuar impacta i no passa. La llum que arriba a la mostra i hi interactua es desvia i si que arriba a l'objectiu.
DIBUIX 1 També hi ha la microscopia per interferencia diferencial que utilitza la polarització. S'aprofita del fet que la llum té un pla de polarització.
Hi ha materials que filtren per un pla de polarització determinat que son els polaritzadors. De manera que si jo tinc la llum que prove doluminació que conte tots els plans de polarització, si poso un filtre que només deixi passar un pla de polarització, a la sortida només tindré llum que tota ella esta`ra en aquest pla de polarització.
35 Tècniques de diagnòstic DIBUIX 2 Nomarsky se li va acudir que poseesin un filtre de polartizació primer i aquesta lluj poloratizada arribara a la mostra. Hi harua una part d ela llum que arriba a la mostra que no interactua amb ella i la traveessi i mantindra el seu pla de polarització: però una fracció de la llum com a ainteracció amb la mostra canviara ala polarització i obtindra un altre pla de plarització. El que farem serà utiltizar un segon filtre que seleccioni una direcció de polarització diferent de la prikmera. De manera que bloquegi aquesta part d'aquí (rodona) i maximitzi la captació d'aquesta llum d'aqui (quadrat). El filtrat també es pot carregar una part de la llum que si que interactua amb la mostra si la llum pertany a diferents plans de polarització.
Contrasten amb els components celulars respecte el fons.
DIBUIX 3 Aquestes dues tenciques s'utilitzen per analitzar mostres histologiques i cultius celulars. Per focalitzar proteines concretes o estructures concretes aquestes tecniques no son suficients , ja que aquí el contrast depen de la llum que interactuta amb el que li doni la gana de la mostra, però si volem especificitat moelcular necessitem fer algun ftipus de marcatge. Això es pot fer amb immunohitoquimica o immunofluorescencia, es marca amb anticossos priamris que reconeix la proteïna d'interès i desprès s'utilitza un anticos secundari amb un marcatge que assigni un color a aquella molecula.
Amb histologia els marcatges es poden veure per color amb camp brillant. Fins fa opc només es podia marcar els nuclis en un tall histològic amb hematoxilina que donava un color blau i es podia marcar una proteïna amb un color marronós d emanera que només podies visualitzar due scoeses diferents en un tall histologic. Avui en dia es pot mirar 3 proteines diferents amb colors diferents en camp brillant. Si un vol fer una anàlisi mes fina de la localització ha d'nar a la immunofluorescència que també s'estaà fent amb talls histologic si en cultius cel·lulars. Amb la llum de fluorescència la proteïna d'interès es marca amb un anticos primari i aquest anticos primari es reconegut per un anticos secundari que porta conjugat algun tipus de molecula fluorescent o fluorofor i això ens porta de manera natural a la microscopia de fluorescencia o 36 Tècniques de diagnòstic hemifluorescencia.
37 Tècniques de diagnòstic Fluorescence microscopy physical principles La microscopia de fluroescencia no existiria si no existissin les molecules fluorescents que tenen la virtut de que quan són excitades hi ha electrosns que slaten a nivells energetics superiors. Això es un estat molt transitori, dura motl poc i de seguida l'electró es desexcita. Aquesta desexctiació pot ser que la doni el nivell inicial pero`el mes habitual es que vagi retornarnt fent salts intermedis fins a arribar al nivell inicial. Això passar perquè les moelucle stenen molts nivells energetics i la probabilitat de que la desexctitació torni al nivell de partida de cop es baixa. Dels nivells intermedis motls són estats rotacionals de la molecula que mouen la molecula. Poques d'aquestes transicions corresponen a alliberar un fotó que té una energia que cau dins del rang visible. I les molècules a les quals els passa això son les molecules fluorescents.
De l'energia que ha absorbit aquest electro una part es absorbida per la molecula i l'altra part es absorbida per un foto. En la practica normalment s'ilumina amb fotons que tenen una energia igual a la difernecia entre l'estat inicial i el de major excitació. En l'electró hi ha una part de l'energia que la retorna i es absrobida per la molecula i hi ha una petita part que correspon a un fotó emès. L'nergia d'excitaci´co és la energia absorbida mes la energia emesesa per un foto (linia verda).
Obtenim un altre foto que te una eneergia menor que la energia d0excitació, er tant tindra una longitud d'ona també diferent. Si la nergia d'emissió es menor que la d'excitació, com que això es la inversa de la longitud 'onal, l a longitud 'ona d'emissió serà major que la longitud d'una excitació. Això es la lleu de Stokes.
38 Tècniques de diagnòstic Com que els nivells d'energia són concrets en una molecula, això vol dir que per una molecula determianda excitar-la se li ha d fer arribar una energia que correspongui a la diferència de nivells perquè sinó el procés no serà eficient. Tenim un cert marge de maniobra perquè les molecules fluorescents son pro complexes com per tenir un nobmre elevat de nivells energètics i si bombardegem a la molecula flourescetn amb longituds d'ona veiem un espectre continu tant d'absorció com d'emissió (fluorescence microscopy dyes or fluorphores).
El pic de la corva d'absorció ens indica que per aquesta longitud d'ona, l'absorció és optima, molt eficient.
De la mateixa manera els fotons que emet aquesta molecula fluorescent al desexcitar-se també serà un espectre ocntinu que seria la corva de la dreta, coneguda per la llei de Stokes.
Si vols fer marcatges de varies proteines es possible gracies a molecules que tenen ujn espectre d'absroció i d'emissió que no es solpaen, tenim els pics separats i a la part de la base tenen un cert solapament.
Això es possible amb fonts de mercuri gas. El mercuri té un espectre d'emissió a unes longituds d'ones discretes que cauen a prop dels maxims dels diferents fluorofors. L'altra opcio es fer servir laser que estan construits a unes longituds d'ona deteminades però que son més cars.
Els lasers també tenen la pega que si volem treballar amb tres fluorofors diferents encessitem tres lasers mentre que la lampara de mercuri ens dona 4-5 longituds d'ones diferents.
39 Tècniques de diagnòstic Epifluorescence microscopy: basic components Tenim la font d'il·luminació que ha d'emetre amb molta intensitat amb longitud d'ona ben definida perquè pugui servir per excitar moelcules fluorescents.
L'objectiu s'utilitza per ilumianr la mostra i també per recollir la llum que prové de la mostra i això s'anomena epifluorescència. La part epi és el que indica que el mateix objectiu s'utilitza per aquestes dues funcions.
Tenim una molecula fluorescent que s'excita a llum blava i emet en verda. Hi ha un dispositiu optic que actua de mirall per certes longituds d'ones i de finestra en altres, aquest component és el dicroic. Es necessita un dicroic dtermiant per cada tipus. El dicroic només em filtra els fotons de llum blava i actua com un mirall , reflexa la llum blava que serà recollida per l'objectiu i aquest enfoca la llum blava cap a la mostra.
S'ilumina la mostra amb llum blava i llavors s'exciten els fluorofors i emeten llum verda que es captada per l'objectiu i aquesta llum torna a trobar-se amb el dicroic que fa com si fos una finestra i deixa passar la llum verda. Despres d ela llum verda es troba un filtre qu assegura que no es colen reflexions que no ens interessa i fins que arriba a l'ocular.
40 Tècniques de diagnòstic Els essencials son la lampara, dicroic i l'objectiu. Cada dicroic només serveix per un fluorofor concret.
És molt utilitzada en cultius de cèl·lules, però té una liimtació que es que ends dóna la localització d'una proteïna dins d'un teixit, però com que estem recollint tota la llum que ens ve de la mostra podem veure la distribució bona en x i y però mala distribució en profunditat, 3D.
L'alternativa a això es la microscopia confocal.
Microscopia confocal Et permet recollir la llum que et prove del pla focal, és a dir, del pla que estem enfocant la mostra de forma molt intesa un cert gruix de la mostra. Utilitza estrategies per maximitzar la captació de llum del pla focal i bloqueja la llum que ginvugui fora del pla focal. Es fa posant un pinhole o forat davant del detector.
La llum que prove del pla focal la seva imatge es forma en el forata i es recollida pel detector. La imatge de la ozna que està per abans o dpesres del pla focal es formara abans o despres del pla focal i per tant serà bloquejada per les partes d'aquest forat i no serà detectada.
A mes per ser mes eficient el que es fa es trebllar amb llum laser, ja que així envies molts fotons a un alongitud dterminada en un punt determiant duran tun temps curt i et permet exctiar moltes moleucles fluorescents.
Serveix per linies acelulars o per talls histologics prims.
41 Tècniques de diagnòstic Microscopia multifoto Els multifotons poden iluminar teixits guixiuts. La llum es absoribida per les capes mes superficilas del teixit i per tant ens permet excitar les capes internes.
La microscopia multifoto es treballa amb dos o mes fotons d'excitació. Si exctiem la molecula fourescent a una energia igual a la idiferncia entre els nivells energetics, s0exctiai emet foton d'una energia menor.
Si podem generar fotons que tinguin la meitat de l'energia entre dos nivells hi ha una probabilitat que la molecula absorbeixi dos fotons a la vegada perquè l'electró pugui excitar-se passant d'un nivella un altre. La probabilitat de que un electro absrobeixi l'nergia de dos fotons es molt petita.
Si utilitzes un laser de motla intensitat, la probabilitat de que passi serà més alta en el pla focal que és on estan arribant més fotons, la estrategia que funciona i que es fa servir , és utilitzar lasers molt potents a una intesnitat mol gran, enviant a polsos, per evitar cremar la mostra, a una frequencia molt rapida, al orde de femtosegons (10 a la -15s).
La estratègia es utilitzar làser de molta intensitat i per aconseguir que arribin molts fotons al pla focal i la probabiltat de que s'absorbeixen dos fotons a la vegada sigui alta, s'utilitza un làser pulsat. Es fan polsos d'una 42 Tècniques de diagnòstic durada de 10 a 100 femtosegons, són molt curts i molt intensos per evitar cremar la mostra. Això encareix les tècniques perquè els lasers de molta intensitat son mes cars.
Amb aquesta estrategia s'ha aconseguit iluminar zones profundes d'un teixit. La difernecia mb el confocal es que la llum es pulsatil.
És molt bo per detectar estructures repetitives com es el cas del colagen que te una triple helix i que tendeix a organitzar-se en filaments molt abundants i paral·lels que fa que sigui molt eficient per veure-la amb aquest tipus de microscopi, no necessita cap tipus de itnció és el mateix colagen qui ens dona el contrast.
43 Tècniques de diagnòstic Introducció a les càmeres digitals Una càmara mai et donarà més resolució que el microscopi.
La resolució espaial: el microscopi ens donàra una imatge més gran que la càmara, això depèn del sensor (xip).
A les càmeres els xips estan dividits, són una matriu de sensors que tenen una geometria quadrada o rectangular i que cada tros tindrà una àrea (àrea del pixel del sensor) i totes aquestes àrees formaran l'àrea total.
Imaginem que el microscopi ens forma una imatge d'una cèl·lula que ocupa parts de 5 trossos de xip diferents. Com que arribarà llum a les parts que estan mig desocupades en els trossos que hi ha la cèl·lula veurem la imatge una mica distorsionada, hi haurà pèrdua d'informació. En canvi, si els pixels són més petits hi haurà menys distorsió.
Dibuix 1 44 Tècniques de diagnòstic També hi ha la resolució temporal, fan fotos cada cert interval de temps. La unitat que s'utilitza és imatges per segon (frames per second → fps).
Si tenim moltes imatges per segon, s'han d'emmagatzemar i això té un cost de memòria i de gestió a l'ordinador que també s'ha de tenir en compte.
Intesity resolution: bit depth També tenim la resolució d'intensitat que té a veure amb la capacitat de distingir nivells d'intensitat de llums diferents.
El paràmetre d'intensitat són els bits que ens diuen amb la potència de dos en el qual està dividint la teva intensitat.
Si tenim x bits ens dirà els nivells intermedis entre el mínim i el màxim que el teu detector és capaç de distingir.
Si tenim un detector de 2 bits, fem 2 elevat a 2 que són 4 i per tant vol dir que el detector pot detectar 4 nivells entre el mínim i el màxim.
El màxim que es pot aconseguir és de 10 bits i no ho pot distingir sinó que es veu com una variació continua.
En 1 bit veiem una imatge binària, pixels negres o blancs. Amb 4 bits tenim més intensitat de llum i a 8 bits els canvis d'intensitat els veiem com un continu.
Tota la llum que arriba a cada pixel de la camara, electronicament segons el nombre de bits se li assignarà un nivell d'intensitat.
Com més elevat sigui el nombre de bits, més ocuparan les imatges.
Hi ha una part de software que controla la càmara amb el temps d'exposició que et diu el temps que estàs captant llum amb el sensor.
El temps d'adquisició o exposició ha de ser tal que les imatges que tinguem no estiguin saturades. EL nivell d'intensitat que està arribant en un pixel determinat no hauria de quedar per sobre del màxim de detecció del teu sensor perquè sinó tindrem una imatge cremada.
Si ens passem del màxim de detecció del sensor no sabem quant ens hem passat.
45 Tècniques de diagnòstic Introducció al processament digital de les imatges de microscopi òptic amb Image J Plugins són aplicacions que qualsevol persona ha desenvolupat i ha compartit i es poden descarregar.
Microscòpia de força atòmica També es pot dir scannig force microscopy i pertany a la família de scanning probe microscopies que són un conjunt de tènciques que és van inventar a partir dels anys 90.
Aquest conjunt de tènciques permet utiltizar un sensor que pugui detectar corrent elèctric o voltatge o deformació, que sigui sensible a lguna variable física, que tingui una geometria molt afilada tant com que tingui un radi en el seu extrem de l'ordre de nanometres de manera que es mesura la interacció entre la lpunta i la mostra a nivell local (pocs nanometres) i utilitzant un microposicionador piezoelèctric, la punta que mesura la interacció local amb la mostra es va movent i va mesurant les interaccions i així va escanejant sobre la mostra. A cada punt de la mostra la interacció ens genera un valor que es col·loca en un pixel.
Dibuix 2 És diferent de la microscopia electòrnica perquè enlloc d'il·uminar la mostra amb llum (òptic) iluminem la mostra amb electrons. Aqui no iluminem res, tenim un sensor que mesura p.e temperatura, deformació... en una regió de la mostra. Té moltes aplicacions segons com sigui el sensor. La més útil és la força atòmica que mesura la força entre la punta i la mostra. Utiltiza un sensor de força que permet tocar localment la mostra, 46 Tècniques de diagnòstic deformar-la suaument de manera que no s'arriba a danyar.
Techniques based on mechanical sensors/actuators: AFM Illustrative experiments: Trancription factor-DNA complex Veiem una molecula de ADN (fialment vermell) i un factor de transciprció (blau) que està operant per sobre de la molecula d'ADN.
Es poden arribar a veure àtoms.
Anem tocant la superficie de la mostra. En aquesta molecula de ADN, no s'ha de fer cap tractament químic.
47 Tècniques de diagnòstic Helicoidal filaments (beta-amiloide) form brain tissue model of Alzheimer S'intueix una forma helicoidal.
Pseudo-color 3D topography image of a single lung epithelial cell La deformació ens limita la resolució, per aquesta tècnica el que controla la resolució és la duresa de la mostra. Si es molt dura tindrem poca defomació quan la toquem i podrem reseguir la topografia de la mostra.
Si tenim mostra moltes toves, quan toquem es deofrma molt i costarà me´s reseguir els canvis i només es podra veure millor als canvis com les fibres d'actina.
Physical principle És una tècnica de conctacte que ens permet tocar la mostra i aplicar-li una força controlada. Això es fa mab un sensor (cantilever) que és un pal molt llarg i prim i per tant és molt flexible. AL final de tot té una punta afilada. El que passa quan ens apropem a la mostra i la comencem a apretar, com a conseqüència de la resistència que la mostra fa a ser apretada, el cantilever és flexiona. Hi ha una relació entre el que es flexiona i la força que fa mentre està flexionada. Mesurant la flexió vertical ho podem convertir en força.
Tenim uanr esolució de força molt bona. La força més petita que és pot mesurar és 10 pico Newton. Es prou petit com per poder aplicar força sobre mostres biològiques sense danyar-les.
La manera com es mesura la flexió és utilitzar un sistema òptic que funciona de manera que la superfició del detector funciona com un mirall i fa que s'incideixi un laser en els extrems . Aquest sensor reflexa la llum laser que es detectada en el detector.
El detector esta dividit en 4 quadarnts de manera que una deformació vertical i lateral es detecta amb el 48 Tècniques de diagnòstic detector.
De sensors en tenim de moltes mides. El nanotub (que es troba a la punta) és un cilindre amb un gruix d'un nanometre que és el que acaba tocant la mostra.
TEMA 9. INTRODUCCIÓ DE LA MICROSCOPIA ELECTRÒNICA Enviem electrons contra la mostra i analitzarem que passa quan xoquen.
Tenim un feix d'electrons accelerats que arriben i en les interaccions que tenen lloc a la mostra es generaran moltes coses 8squema).
Els blaux utilitzarem per la microscopia electrònica de rastreig i la verda per fer microscopia electrònica de transmissió.
49 ...

Comprar Previsualizar