Seminari 4: Quantificació de l'expressió gènica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2016
Páginas 4
Fecha de subida 28/03/2016
Descargas 48
Subido por

Vista previa del texto

MRDD QUANTIFICACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA Mitjançant quins mecanismes...
 En Joan no veu bé els colors? Hi ha 2 gens que codifiquen per a receptors de dos colors (verd i vermell) que, o bé un d’ells a desaparegut o bé s’han recombinat donant lloc a un híbrid.
 Algunes persones són intolerants a la lactosa? Perquè de grans deixen d’expressar l’enzim de la lactasa, tot i tindre’l en el seu DNA.
 L’aspirina actua com un antiinflamatori? Inhibeix l’enzim COX  L’aspirina disminueix el risc d’evolució d’alguns CRC (càncers colorectals)? Inhibeix l’expressió de EGFR (factor de transcripció) Les funcions biològiques venen determinades per proteïnes / enzims. (1 proteïna = 1 funció).
Transcripció: 1r punt de control d’una funció Dogma central de la Biologia Molecular: La informació genètica es troba emmagatzemada en forma de DNA, aquest es transcriu a RNAm el qual informa de la funció que ha de fer i en quina quantitat. Finalment aquest es traduït a proteïnes, les quals produiran la funció determinada.
Exemple d’estudi S’ha descobert que l’administració d’una molècula d’origen vegetal a individus obesos: - Disminueix la gana - Disminueix la ingesta - Al llarg del temps, disminueix el pes corporal Aquesta disminució de gana es sospita que es podria disminuir l’expressió d’una hormona que fa venir la gana.
MRDD PASSOS QUE SEGUIM 1.
Extracció de RNA (fenol – cloroform) S’agafen mostres de RNA dels dos grups i les triturem (homogenat) i, a partir d’aquest homogenat intentem purificar aquest RNA. Per fer-ho es pot fer amb fenol – cloroform (molècules menys polars que l’aigua) barrejant-les amb la mostra (aquosa) per a fer una extracció líquid - líquid. Al barrejar els dos compostos, com que són immiscibles, quan es deix reposar i centrifugar la mostra,veiem que es divideix amb dues fases: una orgànica (lípids, proteïnes) i una inorgànica (RNA i DNA).
[Les proteïnes fan cap a la part no aquosa ja que la seva estructura terciària és gràcies a l’addició de compostos hidròfobs, els quals quan interaccionen entre ells, es col·loquen al nucli i deixen els hidrofílics a la part de fora, el que ajuda a donar forma a les proteïnes. Tot i això, quan aquestes entren en contacte amb el fenol, aquest crea una interacció amb els hidrofòbics fent-los sortir a l’exterior perdent la seva estructura i precipitant] Per a separar ara el DNA de la barreja DNA-RNA s’afegeix un medi àcid, el qual farà que el DNA es quedi en la interfase entre el RNA i la solució de lípids i proteïnes anteriors.
El RNAm, per molt que es bloquegin els seus grups fosfats (amb el medi àcid), té unes bases nitrogenades que no estan formant ponts d’H ja que és una cadena monocatenaria i tenen la capacitat de formar ponts d’H amb l’aigua i per tant, queden en la fase aquosa.
A més a més, es fan servir altres molècules com l’isotiocianat de guanidini que són caòtrop (RNases), els quals desestabilitzen les proteïnes que puguin quedar i no només és important per obtenir una fracció més pura de RNA sense proteïnes sinó que per evitar contaminacions.
Després de l’extracció líquid – líquid el RNA es sol purificar: a) Fent un segon rentat amb cloroform b) Precipitant-lo amb etanol o isopropanol c) En una columna de sílica Aquesta columna de sílica reacciona amb els grups fosfats dels RNA i DNA i els enllaça, quedant els dos units en la fase sòlida.
En aquests rentats també se’ls hi afegeix caòtrops per a desestabilitzar l’aigua i, més especialment la interacció d’aigua amb la sílica. En condicions normals H2O – Si s’unirien sense problemes, però com que no ho permeten els caòtrops, el que passa és que la sílica s’uneix més fortament amb els RNA i DNA. Passa el mateix si afegim etanol, ja que aquest afavoreix la interacció Si - RNA. Quan es centrifuga aquesta mostra, queda la sílica molt seca però amb RNA dins. És llavors quan s’uneix aigua i el que fa aquesta és unir-se amb la sílica i alliberar RNA.
2.
Retrotranscripció: No es pot treballar amb RNA cru perquè és molt làbil i es fa malbé. Per això el convertim en cDNA. Per a fer aquest procés s’empra la tecnologia d’un altre organisme per a fer aquest procés. El procés es basa en el procés que fan els retrovirus.
MRDD En el procés que fem, es posa el RNA cru, els nucleòtids l’enzim retrotranscriptasa i uns primers per a transformar-lo en DNA. Es fa servir una cua o un primer oligodT per unir-lo a la cua poliA i s’amplifiquen tots els RNAm que hi ha en la mostra.
En comptes d’utilitzar aquests primers oligodT, també es poden utilitzar random primers. Es diu que la transcriptasa no té la mateixa eficiència quan comença el procés que quan l’acaba; a 5’ és menys eficient i no es transcriuen tots els RNAm. Per a suplir aquest problema, es van inventar aquests primers al atzar, els quals tenen seqüències aleatòries en infinites combinacions. Amb això s’aconsegueix cobrir a tots els RNAm i quan es transcriuen, es transcriu tot aquest RNAm amb la mateixa eficiència tant al principi com al final.
En l’últim pas es calenta la mostra per a destruir el RNA ja que té una temperatura de fusió més baixa i obtenir DNA pur.
3.
Reacció en cadena de polimerasa (PCR) En el pas anterior, s’han passat a DNA tots els RNAm que hi havia en la mostra. Ara es fa una selecció dels RNA que ens interessaven. És a dir, dupliquem el cDNA del RNA que ens interessa.
Per fer-ho, emprem primers específics, polimerasa i nucleòtids. S’usen polimerases de bacteris termòfils, ja que per a fer la PCR, es necessita augmentar molt la temperatura per a que les cadenes es separin però sense que les proteïnes no es desnaturalitzin.
El primer que es fa és posar la mostra a 95ºC per a aconseguir les cadenes separades i es torna a baixar fins uns 40ºC per a que aquestes cadenes s’uneixin al seu primer específic. En acabat, es torna a pujar fins a 72ºC per a que la polimerasa treballi expandeixi aquesta regió.
MRDD La PCR es fa en un termociclador amb lector de fluorescència. Afegim a la reacció quelants fluorescents o sondes fluorescents. Aquestes ens permeten identificar el gens que volem estudiar.
Les que s’utilitzen en aquests tipus d’estudis són per exemple les sondes TaqMan, les quals són primers que, a part de ser específics per al gen que es vol estudiar i amplificar, tenen dues molècules enllaçades covalentment. La primera, el “reporter” emet fluorescència (els seus e al excitar-se i desexcitar-se emeten una longitud d’ona que és fluorescent) i la segona és una molècula anomenada “quench” que el que fa és absorbir a la mateixa longitud d’ona (per tant no es veu fluorescència) que l’altre emet i tornar a emetre a una tercera, que aquesta no emetrà fluorescència. Mentre les dues molècules estan properes, no es mostra fluorescència.
Quan el primer s’hibrida i la cadena s’exten, la polimerasa trenca aquest enllaç covalent alliberant el reporter i mostrant fluorescència.
Cada línia és el gen d’un individu diferent a mesura que passa el temps i va alliberant fluorescència.
Hi ha un altre mètode, anomenat “SYBR green” es basa en utilitzar una molècula que és calant.
Quan està entre una cadena bicatenària emet fluorescència. Per tant quan s’uneixen dues cadenes es veu fluorescència i a més cadenes hi ha formades, més fluorescència s’aprecia.
4.
Anàlisi Per a observar els resultats, en la gràfica obtinguda és col·loca una ratlla com a valor llindar anomenat CT i, el que es mira és quan triga cada individu en arribar en aquest nivell llindar, és a dir, quans cicles s’han de produir per a arribar en aquest valor establert.
Per exemple, ens individus que en la gràfica es mostren com a línies taronja, tenen menys DNA de partida que no pas els que es mostren amb les línies blaves.
Com a referència hi ha les gràfiques verdes, els quals mostres gens “housekeeping” els quals no canvien la seva expressió tot i canviar les condicions en les que es trobin, són molt estables.
Llavors serveix per donar una referència estable sobre un gen normal respecte el que s’estudia, és a dir, per a normalitzar-lo.
Es va servir una inversa matemàtica entre les còpies respecte el nombre de cicles per a obtenir el percentatge de normalitat del gen que s’estudia.
...