HH (2007)

Otro Portugués
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Año del apunte 2007
Páginas 41
Fecha de subida 19/10/2014
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 1. ESTRUCTURA QUÍMICA DELS ÀCIDS NUCLEICS (AANN) Àcids nucleics: estructura química i composició El DNA és un polímer d’unitats de desoxiribonucleòtid. Un nucleòtid està format per: grup fosfat (un o més) + sucre (ribosa o desoxiribosa: furanosa) + base nitrogenada.
*A les posicions de sucre hi afegim un apòstrof (ex. 1’) per diferenciar-les de les de la base nitrogenada.
*El prefix d indica que el sucre és la desoxiribosa (dATP) i sinó és la ribosa (ATP).
En el nucleòtid de la figura hi observem enllaços ester en 5’. En el carboni 1’ hi trobem l’enllaç N-beta-glicosídic.
Les bases nitrogenades La base nitrogenada deriva de la purina o de la pirimidina (bases febles i hidrofòbiques a pH=7, de manera que són insolubles en aigua). La pirimidina és un heterocicle de carboni de sis posicions i té una gran quantitat de dobles enllaços que li permet tenir estructures de ressonància i és plana i hidrofòbica. La purina són dos heterocicles de carboni (un de cinc posicions no planar i l’altre de sis pla) i és casi planar, però no totalment, i també és hidrofòbica. En solucions aquoses les BN tenen tendència a apilar-se cara amb cara fent contacte de Van der Waals i dipol-dipol.
El DNA conté dues bases derivades de la purina (adenina i guanina) i dues de la pirimidina (timina i citosina). El RNA també conté les mateixes bases derivades de la purina, però de la pirimidina enlloc de timina hi té uracil. La diferència entre timina i uracil és que la timina té un metil en la posició dos.
1 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El fet que trobem timina en el DNA i uracil en el RNA (hi ha alguns tRNA que tenen timina) té una explicació, és degut al fenomen de la disseminació espontània, que és la tendència natural de les BN que fa que la citosina es converteixi en un uracil. Per compensar-ho, cada dia (també depèn del què mengem) hi ha un sistema dissenyat per canviar qualsevol uracil per citosina en el DNA, és un fet mecànic. Si tinguéssim uracil natural, no podríem diferenciar el ja existent del què era citosina, per això no n’hi ha en el DNA.
Les bases nitrogenades tenen un elevat grau de conjugació degut al caràcter parcial de doble enllaç entre carboni i carboni i degut a què són capaces d’absorbir llum UV (260nm), un fet important a l’hora de quantificar àcids nucleics. Absorbeixen entre 240-280nm (260 és la mitjana) (l’absorbància del DNA depèn de la seva composició).
2 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El sucre pentosa La desoxiribosa és el sucre dels desoxiribonucleòtids; el prefix desoxi- significa que en aquest sucre li falta un oxigen que la ribosa sí que té. La desoxiribosa la trobem en el DNA i la ribosa en el RNA. Aquests sucres són pentoses, concretament la i la , que es troben en forma d’anells de furanosa.
La ribosa té dues conformacions possibles (de fet quatre), perquè no és plana: endo (en el pla del C-5’), exo (contrari al pla del C-5’) i la forma de sobre (C-2’ i C-3’ estan fora del pla).
Tant la ribosa com la desoxiribosa formen un anell de 5 àtoms de carboni que no estan en el mateix pla. Això és degut a què, si no fos així, els núvols electrònics se solaparien. D’aquesta manera, un o més àtoms de carboni sempre queden per fora del pla en el què es troben la resta. Així, el sucre pot presentar forma de sobre o forma E quan un dels carbonis queda per fora del pla, o bé forma T quan dos dels carbonis queden per fora del pla i en cantons oposats. A més a més, per cada un d’aquests carbonis, la conformació pot ser “endo” (carboni dirigit cap a on ho està el carboni 5’) o “exo” (carboni dirigit cap al cantó oposat del carboni 5’). Els únics carbonis que poden donar lloc a aquests plegaments són el 2’ i 3’.
El sucre del B-DNA adopta una conformació en forma E i C-2’ endo.
3 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Com s’uneix la base i el fosfat a la pentosa En la figura observem un ester fosfòric. Té el pka molt proper a 0 (sempre estan desprotonats).
Les pentoses s’uneixen a les bases nitrogenades donant lloc a uns compostos anomenats nucleòsids. La unió es realitza mitjançant un enllaç N-glicosídic entre l’àtom de carboni carbonílic de la pentosa (C-1’) i un dels àtoms de nitrogen de la base nitrogenada (posició 1 si és pirimidínica o posició 9 si és púrica).
L’enllaç N-glicosídic té lloc quan un hemiacetal intramolecular reacciona amb una amina, en lloc de amb un alcohol (O-glicosídic), alliberant una molècula d’aigua.
Els nucleòsids en estat lliure només es troben en quantitats mínimes en les cèl·lules, normalment com a productes intermediaris en el metabolisme dels nucleòtids. Hi ha dos tipus de nucleòsids: ribonucleòsids (ribosa) i desoxiribonucleòsids (desoxiribosa). Els nucleòsids es nombren afegint la terminació –osina al nom de la base nitrogenada si és púrica, o bé –idina si és pirimidínica. Els quatre nucleòsids del DNA s’anomenen desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina i desoxicitidina.
Els nucleòtids resulten de la unió mitjançant un enllaç ester de la pentosa d’un nucleòsid amb una molècula d’àcid fosfòric. En aquesta unió s’allibera una molècula d’aigua i pot produir-se amb qualsevol dels grups hidroxils lliures de la pentosa, però com a regla general té lloc en l’hidroxil que ocupa la posició 5’. Dit en altres paraules, els nucleòtids són els 5’-fosfats dels nucleòsids. La possessió d’un grup fosfat, que a pH 7 es troba ionitzat, confereix als nucleòtids un caràcter marcadament àcid.
4 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica A més a més dels nucleòtids monofosfat descrits (conformen estructura àcid nucleic), també hi ha nucleòtids di- i trifosfat, que resulten de la unió mitjançant un enllaç anhídrid d’una o dues molècules d’àcid fosfòric addicionals a la que ja hi havia unida en la posició 5’.
Resumint, en un desoxiribonucleosid, l’àtom de carboni C-1 de la desoxiribosa s’enllaça amb el N-1 de la pirimidina o el N-9 de la purina. La configuració d’aquest enllaç N-glicosídic és beta (la base està per sobre del pla de l’anell del sucre). L’ester fosfòric d’un nucleòsid és el què s’anomena nucleòtid. La posició més freqüent d’esterificació dels nucleòtids naturals és el grup hidroxil del carboni C-5 del sucre. Aquest compost s’anomena nucleòsid 5’-fosfat o 5’-nucleòtid.
Així, per exemple, la desoxiadenosina-5’-trifosfat (dATP) és un precursor activat de la síntesis del DNA; el nucleòtid s’activa per presència de dos enllaços fosfoanhídrid en la seva unitat trifosfat.
Estructura i nomenclatura dels nucleòtids Podem classificar els nucleòtids en ribonucleòtids (ribosa) i desoxiribonucleòtids (desoxiribosa).
La part variable del DNA és la seqüència dels quatre tipus de bases (A, G, C, T). Els nucleòtids corresponents a aquestes bases s’anomenen desoxiadenilat, desoxiguanilat, desoxicitidilat i desoxitimidilat.
Hi ha diverses maneres de nombrar els nucleòtids, la més utilitzada és la següent. Cada nucleòtid s’identifica mitjançant tres lletres majúscules, la primera lletra és la inicial de la base nitrogenada, la segona indica si el nucleòtid és Mono, Di o Trifosfat, i la tercera és la inicial del grup fosfat (P, perquè és en anglès). En el cas dels desoxiribonucleòtids s’anteposa una d minúscula en aquestes tres sigles. Exemples: ATP (adenina-tri-fosfat), AMP (adenina-monofosfat), GTP (guanina-tri-fosfat), dTDP (desoxi- timina- di-fosfat)...
5 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 2. ENLLAÇ FOSFODIÈSTER L’enllaç fosfodièster és un tipus d’enllaç covalent que es produeix entre el grup –OH en el carboni 3’ i un grup fosfat en el carboni 5’ del nucleòtid entrant.
L’esquelet del DNA, que és constant al llarg de la molècula, està format per desoxiriboses lligades per ponts fosfodièster. Concretament, l’hidroxil 3’ del sucre d’un desoxiribonucleòtid està unit a l’hidroxil 5’ del sucre adjacent per un enllaç fosfodièster.
Aquest tipus d’unió, en la què un grup fosfat queda unit per dos enllaços ester a dos nucleòtids successius, es coneix també com a pont fosfodièster.
6 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 3. ESTRUCTURA PRIMÀRIA DELS AANN I INFORMACIÓ GENÈTICA Com és el bri (hebra) de polinucleòtid L’esquelet de la cadena té una part constant de P i pentoses i és hidrofílica, la part variable és la hidrofòbica. Els nucleòtids estan units per un enllaç fosfodièster entre 5’ i 3’. La cadena és polar i no té una polaritat simètrica.
L’extrem 5’ no sempre tindrà un fòsfor associat.
Quan dos nucleòtids s’uneixen mitjançant un pont fosfodièster el dinucleòtid que resulta conserva un grup 5’ fosfat lliure en un extrem que pot reaccionar amb el grup hidroxil 3’ d’un altre nucleòtid, i un grup hidroxil 3’ que pot reaccionar amb un altre grup 5’ fosfat d’un altre nucleòtid. Aquesta circumstància permet que mitjançant ponts fosfodièster es puguin enllaçar un nombre elevat de nucleòtids per formar llargues cadenes lineals que sempre tindran en un extrem el grup 5’ fosfat lliure i en l’altre extrem el grup hidroxil 3’.
Podem definir, doncs, l’estructura primària dels àcids nucleics com la seva seqüència de nucleòtids. Aquesta estructura és anàloga a la de les proteïnes, en què les cadenes polipeptídiques posseeixen un esquelet monòton a partir del qual es projecten lateralment els grups R dels diferents aminoàcids. En el cas dels àcids nucleics, posseeixen un esquelet de les mateixes característiques, format per una successió alterna de pentoses i grups fosfat, a partir del qual es projecten lateralment les bases nitrogenades.
Existeixen dos tipus principals d’àcids nucleics: DNA i RNA. Les diferències en quant a composició entre aquests dos tipus d’àcid nucleic vénen donades per les què existeixen entre els seus nucleòtids constituents i resideixen en el tipus de pentosa i bases nitrogenades característiques d’un i altre.
7 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Les cadenes de DNA i RNA tenen polaritat. La seqüència de bases està escrita en direcció de 5’ a 3’. L’enllaç es fa en el 3’ i no en el 2’, encara que sigui més estable, no se sap ben bé, però podria ser perquè el 2’ podria fer hèlixs superiors, com triplehèlixs.
El RNA és menys estable que el DNA El RNA és susceptible a atacs nucleofílics, de manera que té tendència a hidrolitzar-se.
Aquesta tendència s’accelera en medi bàsic (se segresta el H+), de manera que no pot emmagatzemar-se en ambient bàsic, sinó que es guarda a -80º i a pH=8~7.
La desoxiribosa en el DNA conté enllaços C-H, de manera que és més estable i reacciona menys en condicions alcalines. El DNA resulta molt difícil d’atacar per enzims o altres substàncies perjudicials. En canvi, la diferència amb la ribosa és que és més reactiva amb enllaços C-OH i no és tan estable en condicions alcalines, fet que confereix una gran vulnerabilitat als atacs d’enzims o la exposició de raigs ultraviolats. Comparat amb el DNA, el RNA és relativament més resistent als raigs ultraviolats.
La desoxiribosa en el DNA és menys reactiva que la ribosa. En general, els enllaços C-H són menys reactius que els C-OH. A més a més, el RNA no és gaire estable en solucions alcalines, mentre que el DNA sí.
La doble hèlix del DNA té solcs molt petits on poden atacar els enzims perillosos, de manera que és molt més difícil d’atacar el DNA. El RNA té solcs més grans, de manera que serien més susceptibles als atacs.
La connexió entre les “hebras” de DNA de doble hèlix és molt més estreta, de manera que és molt més fàcil descomprimir RNA. D’aquesta manera, és molt més ràpid i requereix menys energia trencar i reformar RNA que no DNA. Per això el material genètic es guarda en el DNA, perquè és important que sigui estable i pateixi el mínim de modificacions possibles.
8 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El DNA-B és una estructura estable gràcies als ponts d’hidrogen que es formen entre els parells de bases (confereixen estabilitat termodinàmica a la doble hèlix), a l’apilament de les bases nitrogenades (estabilitzen la hèlix) i la hidratació dels grups polars de l’esquelet sucrefosfat en medi aquós.
9 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 4. ESTRUCTURA SECUNDARIA DELS AANN: Models de doble hèlix i altres estructures Estructura del DNA Rosalind Franklin i Marice Wilkins A inicis dels anys 50, Rosalind Franklin i Marice Wilkins van fer els primers estudis físics del DNA mitjançant la tècnica de cristal·lografia de raigs X patrons de difracció, que va revelar que la molècula de DNA és una cadena estesa amb una estructura altament ordenada, que la molècula de DNA és helicoïdal i té un diàmetre de 20A i que les BN estan apilades amb els plans separats per una distància de 3,5A.
Model de Watson i Crick (conformació B) Model de Watson i Crick: dos brins antiparal·lels que giren al voltant d’un eix central en sentit dextrogir. Les bases nitrogenades estan enfocades cap a l’interior (part hidrofòbica). Els grups exocíclics exposats en cada “surco” són diferents. Pas de rosca: 36A (cada base rota 36º, de manera que hi ha entre 10 i 10,5 pb per volta). Els aparellaments són específics (lleis de Chargaff: [A]=[T] i [C]=[G]). L’estructura de DNA de Watson i Crick és certa per a DNA natiu (92% humitat mínim) i es coneix com a DNA de tipus B (l’eix central travessa la part central dels parells de bases). És una estructura molt compacta, molt regular i sense forat intern. Quan deshidratem el DNA de tipus B obtenim el DNA de tipus A (75% humitat).
El 1953 Watson i Crick van combinar dades físiques i químiques del DNA deduint l’estructura tridimensional del DNA i interpretant-ne el mecanisme de replicació. Watson i Crick van analitzar les fotografies de difracció de raigs X de fibres de DNA, obtingudes per Rosalind i Maurice, i van proposar un model estructural que ha demostrat ser essencialment correcte. Les característiques més rellevants del seu model de DNA són: a) Hi ha dues cadenes helicoïdals de polinucleòtids enrotllades al llarg d’un eix comú. Les cadenes corren en direccions oposades.
b) Les bases de purina i pirimidina es troben en l’interior de l’hèlix, mentre que les unitats de fosfat i desoxiribosa es troben en l’exterior. Els plans que contenen les bases són perpendiculars a l’eix de la hèlix. Els plans que contenen els sucres estan formant angles casi rectes amb els de les bases.
c) El diàmetre de la hèlix és de 20A. Les bases adjacents estan separades 3,4A al llarg de l’eix de la hèlix i desplaçades per una rotació de 36 graus. Per tant, l’estructura 10 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica helicoïdal es repeteix en cada cadena després de deu residus; això és a intervals de 34A.
d) Les dues cadenes romanen unides per ponts d’hidrogen entre els parells de bases.
L’adenina està sempre aparellada amb la timina i la guanina està sempre aparellada amb la citosina.
e) La seqüència de les bases possibles al llarg de la cadena de polinucleòtid no està restringida de cap manera. L’aspecte més important de la doble hèlix de DNA és l’especificitat de l’aparellament de bases. El fet que s’aparellin A-T i C-G és degut a factors estèrics (els enllaços glicosídics que uneixen a la cadena un parell de bases enfrontades estan sempre separats per 10,8A. Un parell de bases purina-pirimidina s’ajusta perfectament a això. És per això que una de les hèlix del parell ha de ser purina i la altra pirimidina, si fos purina-purina seria massa petit i pirimidina-pirimidina estarien massa lluny per formar ponts d’hidrogen) i a la formació de ponts d’hidrogen (els àtoms d’hidrogen de les bases purina i pirimidina tenen posicions molt definides. L’adenina no pot aparellar-se amb la citosina perquè hi hauria dos hidrògens molt pròxims en una posició de l’enllaç i cap en l’altra. En canvi, A-T i C-G, les orientacions i distàncies d’aquests enllaços d’hidrogen són òptimes per a què es produeixi una forta interacció entre bases).
La doble hèlix clàssica descrita per Watson i Crick és la coneguda forma B del DNA, però aquest pot adoptar altres formes com la A-DNA i la Z-DNA. En condicions fisiològiques, la majoria del DNA es troba en la conformació B descrita per Watson i Crick.
11 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El B-DNA té una doble hèlix dextrògira, amb els grups sucre-fosfat a l’exterior i les bases nitrogenades a l’interior. Els parells de bases A-T i C-G se situen casi perpendicularment a l’eix de la hèlix. Donat que cada parell de bases té la mateixa mida, es forma una estructura regular.
D’aquesta manera, com a resultat de la asimetria de cada parell de nucleòtids, el B-DNA presenta solcs de mida diferent, i com que cada parell de bases gira uns 35º respecte a l’anterior, aquests solcs es van repetint. Aquests solcs són les zones des d’on les bases nitrogenades seran accessibles des de l’exterior. Es van alternant dos tipus de solcs un major i un menor. La major capacitat informativa es troba en els solcs majors, ja que són més accessibles a les proteïnes, que els és més fàcil identificar la seqüència sense haver d’obrir la hèlix. En el menor no es pot distingir T-A de A-T ni C-G de G-C.
El B-DNA té una estructura monòtona, és a dir, per cada volta completa o pas de rosca de la hèlix hi ha el mateix nombre de parells de bases, que són 10,4pb.
Model de replicació del DNA És un model semiconservatiu, els dos brins són portadors d’informació.
El model de doble hèlix del DNA suggereix immediatament un mecanisme per a la seva replicació. Segons Watson i Crick: si es conegués l’ordre real de les bases d’una de les dues cadenes, podria escriure’s l’ordre exacte de les bases de l’altra cadena, degut a l’especificitat d’aparellament; és per això que és com si una cadena fos el complement de la altra. Aquesta característica és la què suggereix com pot duplicar-se a sí mateixa la molècula de DNA. La doble hèlix de DNA representa un parell de motlles, cada un del qual és complementari de l’altre. Van suposar que abans de la duplicació els ponts d’hidrogen es trenquen i les cadenes se separen i cada una forma la seva complementaria de manera que acabem amb dues dobles 12 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica hèlix de DNA. Així doncs, Watson i Crick van proposar que una de les dues cadenes de cada molècula filla de DNA se sintetitza de nou, mentre que la altra prové de la molècula de DNA parental.
Aquesta distribució d’àtoms parentals s’anomena semiconservativa (la replicació del DNA és semiconservativa).
Es va fer un estudi amb aquestes conclusions, que corroboraven tal hipòtesi: “el nitrogen d’una molècula de DNA es divideix en quantitats iguals entre dues subunitats físicament continues; que, en el procés de duplicació, cada molècula filla rep una d’aquestes quantitats; i que les subunitats es mantenen al llarg de moltes duplicacions”.
Enllaços amb capacitat de rotació L’enllaç N-glicosídic té capacitat de rotació en les purines, de manera que hi ha una gran diversitat conformacional. Les piridines sempre estan en anti degut a l’impediment estèric i elèctric.
Tant l’enllaç glicosídic com l’enllaç entre els carbonis 4’ i 5’ del sucre presenten llibertat de gir, fet que dóna lloc també a diferents conformacions. En el cas de l’enllaç N-glicosídic, pot aparèixer la conformació “anti” si la part més voluminosa de la base queda allunyada del sucre, o la conformació “sin” si el pla de la base nitrogenada està dirigit cap el sucre. La conformació “anti” és més estable que la “sin”. En el cas de l’enllaç C4’-C5’ del sucre, pot donar-se tres conformacions en relació a la posició de l’oxigen del C5’ (O5’) respecte dels enllaços C4’-O4’ i C4’-C3’. Per a la nomenclatura es té en compte els angles que es formen entre O5’ i C4’ i entre O5’ i C3’, de manera que si l’angle és de 60’ es diu que és “gauche” i si l’angle és de 180º es 13 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica diu que és “trans”. Com que es tenen en compte dos angles, les conformacions que es poden donar són: sinclinal positiva (gauche-gauche), antiperiplanar (gauche-trans) i sinclinal negativa (trans-gauche). El B-DNA presenta conformació “anti” per l’enllaç N-glicosídic de totes les BN i conformació sinclinal + per a l’enllaç C4’-C5’.
Altres conformacions: A-DNA (medi etanol) Les altres conformacions de DNA corresponen a situacions ambientals diferents i poden intercanviarse. En el cas de l’A-DNA, el trobem en espores de gram + i en un ambient de <75% d’humitat. És més curt i ample, 11 pb per volta i un pas de rosca de 28A.
El pla del parell de bases és inclinat (20º) i el “surco” major és molt profund i estret. L’eix no travessa la part central dels parells de bases (tota la doble hèlix gira al voltant seu). Hi ha un forat intern.
El DNA s’estabilitza per interaccions del tipus pdH (la temperatura afecta) i hidrofòbiques (el medi afecta) i es desestabilitza pels grups fosfats de l’esquelet (en la cèl·lula això és contra-restat per contraions com les poliamines).
El DNA de tipus A també és dextrògir, però és més ample (11pb enlloc dels 10pb del B-DNA) i més curt (28A de longitud enlloc de 34A del B-DNA). Així doncs, la doble hèlix del A-DNA està més oberta, té major diàmetre i una disposició de les BN més allunyada de l’eix de la hèlix. Les BN estan molt inclinades respecte de la horitzontal, més pròximes entre sí i localitzades més simètricament respecte al centre.
L’eix vertical no passa pel centre, és com si l’hèlix s’obrís i quedés un forat intern d’uns 6A.
Està inclinat (es considera que el B-DNA no ho està, encara que en realitat sí que ho està una mica) en el pla de les bases (20A).
Té un solc menor poc profund i una mica més ample que el major, que és més estret i profund.
El trobem en estructures deshidratades (condicions d’humitat escassa i menor temperatura): en espores de bacteris gram positiu. No és fisiològica del DNA (no l’acostumem a trobar), però és la única per al RNA quan forma hèlixs localment o híbrids RNA.
14 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Altres conformacions: conformació del Z-DNA En el Z-DNA no hi ha un canvi d’humitat, es dóna en seqüències d’alternança purina-piridina n vegades. Té un paper regulador i és levogir (perquè les purines estan en sin, fet que canvia el gir del pb). Hi ha 12pb per volta, és més allargat i r=37A. L’estructura és més irregular (zig-zag).
El canvi de B a Z pot donar-se en condicions fisiològiques: es creu que reprimeix la transcripció dels gens propers a aquesta seqüència, que els inactiva de manera que la RNA polimerasa no pot unir-se: regulació metilant el C (enterrar el metil dins (interacció hidrofòbica) i augmentar la concentració de la sal).
El DNA de tipus Z, en comparació amb el B-DNA, és més allargat (45A) i estret (malgrat tenir 12pb per gir complet / volta). A diferència del A-DNA i del B-DNA, el Z-DNA és levogir (gir antihorari) perquè les purines canvien a la configuració “sin” (la base i la pentosa estan situades del mateix cantó que l’enllaç glicosídic) i el pla dels parells de bases ha fet una rotació, un gir de 180º, i es troben al revés. Té una conformació de l’esquelet en zig-zag.
Els grups fosfat es troben més propers entre ells en comparació amb el B-DNA. El centre de la hèlix, al igual que el A-DNA i a diferència del B-DNA, no passa pel mig i si fas un tall transversal no hi veus una zona buida.
Només hi observem un solc, l’aparellament entre les bases (que formen el solc major, el proper a l’eix, en el B-DNA) es troba cap a un lateral, en la superfície exterior, lluny de l’eix. Així, el solc ample desapareix totalment i l’estret es fa encara més estret i profund.
Existeix a la naturalesa? El podem trobar en segments de DNA amb seqüències purinapirimidina-purina-pirimidina-... alternadament, sobretot si són citosina-guanina, i sobretot si la citosina està metilada (C-CH3), tot això afavoreix al Z-DNA. Degut a la conformació alternant dels residus sucre-fosfat segueix un curs en forma de zig-zag.
Les seqüències de DNA poden passar de la forma B a la forma Z i viceversa.
Es creu que el Z-DNA seria un bon inhibidor de la transcripció perquè les proteïnes es neguen a ensamblar-se perquè no és el DNA normal. Si la proteïna se’l troba veu que no és el B-DNA i pot decidir no unir-se.
15 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Comparació entre les diferents conformacions del DNA 16 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 17 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Estructures locals que depenen de la seqüència Palíndrom: doble eix de simetria (el què es coneix com a palíndrom en el diccionari és el que en diem “mirror repeat” a aquí) (forma una estructura cruciforme).
El palíndrom és l’auto-complementarietat en el mateix bri (doble eix de simetria), mentre que el “mirror repeat” és la repetició especular (un únic eix de simetria).
El palíndrom forma estructures reconegudes per proteïnes i enzims anomenades cruciformes.
El palíndrom consisteix en dues seqüències iguals en brins contrari. Aquest, mostra una complementarietat interna dins el propi bri, de manera que pot fer estructures denominades cruciformes (s’han vist in vitro i in vivo s’han detectat amb anticossos).
Modificacions químiques del DNA La metilació enzimàtica del DNA té les següents característiques:  En procariotes A i C es troben metilades amb més freqüència que G i T  No es produeix a l’atzar  Totes les DNA-metilases conegudes utilitzen S-adenosimetionina (SAM)  En E. coli existeixen dos sistemes principals: mecanisme de restricció-modificació i reparació de parells de bases incorrectes. Els bacteris es defensen de virus (el bacteri protegeix el seu metilant, de manera que no serà susceptible a l’enzim de restricció).
 En eucariotes, aproximadament el 5% de C es troba en forma de 5-metilcitosina (molt freqüent en seqüències riques en CG anomenades CpG). Metilació del DNA: com que el 18 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica de nova síntesi no està metilat, serveix per a diferenciar la cadena vella de la nova i així la cèl·lula sap quin bri corregir.
 La 5-metilcitosina en seqüència CpG repetitiva: tendència d’aquesta seqüència a adoptar la conformació Z.
En bacteris la metilació de bases és un mecanisme de defensa (procariotes) – enzims de restricció?. A més a més, la metilació és un sistema de regulació, tant en eucariotes com en procariotes: reparació d’aparellaments incorrectes (serveix per diferenciar una “horquilla” de la altra de DNA perquè durant uns pocs segons el DNA sintetitzat no està metilat, si troba citosines metilades el sistema eliminarà la altra “horquilla”, ja que considera que la metilada és la R-parental i elimina la de nova síntesis, que representa que és l’error).
La metilació també serveix per regular l’expressió gènica en eucariotes. En resum, la metilació enzimàtica és un sistema de defensa en procariotes i un sistema de defensa i de regulació en eucariotes.
Propietats físic-químiques del DNA Les propietats físico-químiques del DNA són diferents de les del DNA desnaturalitzat. El DNA dúplex és menys dens, més viscós i absorbeix menys llum que el DNA monocatenari. La desnaturalització parcial comença en zones riques en A-T. La desnaturalització del DNA pot ser degut a la temperatura, al pH (canvi de càrrega dels nucleòtids) o a sals. El procés de 19 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica desnaturalització és un procés cooperatiu (procés inicial lent i després va sent més ràpid; depèn de la [DNA]). Costarà més desnaturalitzar el DNA segons el % de C-G (com més elevada més difícil), la longitud (com més llarg més difícil), la concentració de sals (com el magnesi; com més, més difícil) i la polaritat del solvent (polaritat baixa).
El DNA a temperatures molt altes o a pH extrems (molt àcids o molt bàsics) pot arribar a la desnaturalització (pot renaturalitzar-se). La zona on hi ha A-T és la primera en obrir-se, perquè és la més inestable: s’obre com traus (hojales). Si estan parcialment desnaturalitzats ràpidament tornen a renaturalitzar-se en un procés cooperatiu, però si la separació és total el procés és més lent.
Així doncs, els dos brins de la hèlix de DNA poden separar-se fàcilment quan s’escindeixen els enllaços d’hidrogen entre les bases aparellades. Això s’aconsegueix escalfant la dissolució de DNA o bé afegint àcid o àlcali per ionitzar les seves bases. El desenrotllament de la doble hèlix s’anomena fusió, perquè té lloc de manera brusca i a una temperatura determinada. La temperatura de fusió és aquella temperatura en la qual es desfà la meitat de l’estructura helicoïdal. La brusquedat de la transició indica que la doble hèlix del DNA és una estructura molt cooperativa que es manté unida per varis enllaços de reforç; s’estabilitza tant per l’acumulació com per l’aparellament de les bases.
La fusió del DNA es pot seguir fàcilment mesurant l’absorbància a 260nm. L’alliberament dels parells de bases es tradueix en un increment de l’absorbància, efecte denominat hipercròmic.
La imatge ens mostra com l’absorbància a 260nm d’una dissolució de DNA augmenta quan es fon l’hèlix, que origina filaments prims.
20 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Hi ha 50 micrograms per mil·lilitre per cada unitat d’absorbància per al DNA de doble cadena (no és el 100% precís, és una mitjana). Per la mateixa quantitat de DNA observem que si està desnaturalitzat absorbeix més llum. La cinètica de re associació del DNA és més lenta a T baixes.
La temperatura de fusió (Tm) de la molècula de DNA depèn notablement de la seva composició de bases. Les molècules riques en parells de bases GC tenen temperatures de fusió més elevades que les que tenen abundància de parelles AT. De fet, la temperatura de fusió del DNA de moltes espècies varia linealment amb el contingut en GC, augmentant des dels 77º fins als 100º quan la fracció de parelles GC augmenta del 20% al 70%. Les parelles GC són més estables que les parelles AT perquè es mantenen unides per tres ponts d’hidrogen en lloc de dos. En resum, els parells de base GC adjacents interactuen amb més força els uns amb els altres que els parells de bases adjacents AT. Així doncs, les regions del DNA riques en AT són les primeres en fondre’s. La doble hèlix es fon in vivo per l’acció de proteïnes específiques.
Els brins complementaris de DNA separats es tornen a associar espontàniament per formar una doble hèlix quan la temperatura baixa per sota de la temperatura de fusió. El procés de renaturalització a vegades s’anomena “annealing (recuit)”. La facilitat amb la què les dobles hèlix poden fondre’s i tornar-se a associar és essencial per a les funcions biològiques del DNA.
És també important ressaltar que el DNA és una molècula flexible, fins i tot en temperatures molt per sota de la de fusió.
La Tm és característica de cada àcid nucleic. El procés és ràpid degut a l’efecte cooperatiu (corba sigmoïdal). Per augmentar Tm podem augmentar el % C-G, la [sal] o la longitud.
DNA purificat (lliure de proteïnes): al laboratori quantifiquem amb una proveta (1 cm): dsDNA (ds = doble hèlix): abs. = 1 = 50 micrograms / mL. A (260/280): 1,8 (normalment, probablement 21 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica serà pur), <1,8 (contaminants), >1,8 (contaminat per RNA) // ssDNA: abs. = 1 = 33 micrograms / mL.
Així podem fer les corbes de desnaturalització: són corbes sigmoïdals, fet que demostra que és un procés cooperatiu. En el punt mig hi trobem Tm (melting temperature): s’utilitza en PCR, per processos d’hibridació... Tm depèn de les condicions del medi ([sal], [pH]...), la longitud del DNA i el % de C-G (com més percentatge de C-G més elevada serà la Tm perquè més costarà de desnaturalitzar).
5. ALTRES FUNCIONS DELS NUCLEÒTIDS Altres funcions dels nucleòtids Els nucleòtids, a part de ser l’estructura principal dels àcids nucleics, també tenen altres funcions importants en les cèl·lules:  Implicats en el transport d’energia (ATP: transfereix i emmagatzema energia) Els enllaços anhídrid que uneixen els grups fosfat addicionals són enllaços rics en energia, ja que necessiten una aportació energètica important d’energia que alliberen quan es trenquen. Això els permet actuar com a transportadors d’energia, concretament l’ATP, que és l’universal. Però en algunes reaccions metabòliques també podem trobar GTP, CTP, UTP.
 Alguns nucleòtids o els seus derivats poden actuar com a coenzims (substàncies orgàniques no proteiques que resulten imprescindibles per a la acció de molts enzims). Aquest és el cas del NAD+, NADP, FAD o FMN, nucleòtids complexes en els què apareixen bases nitrogenades diferents a les típiques dels àcids nucleics, que actuen com a transportadors d’electrons en reaccions metabòliques d’oxidació-reducció.
 Altres nucleòtids com l’AMPc, un fosfat cíclic d’adenosina en el què el grup fosfat està unit mitjançant enllaç ester a l’hidroxil de la posició 3’ i al de la posició 5’, actuen com a mediadors en determinats processos hormonals, transmetent al citoplasma cel·lular senyals químiques procedents de l’exterior.
22 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 6. ESTRUCTURES TRIDIMENSIONALS DEL RNA Estructura tridimensional del RNA El RNA és una molècula mediadora, té una funció reguladora i catalítica. El sRNA és el RNA que s’hibrida amb un RNA de l’hoste que codifica per a un caràcter no desitjat (l’inactiva; ús en teràpia). Majoritàriament trobem el RNA en forma ribosomal (80%), un 19% tRNA i un 5% mRNA. El RNA té UNA hèlix dextrogira (les purines tendeixen a apilar-se: stacking).
La presència del grup 2’-OH suposa petites modificacions conformacionals en el RNA, suficients com perquè la conformació d’aquest sigui C3’-endo.
La conformació global del RNA s’adapta molt bé a la què coneixem com a conformació A.
L’estructura del A-RNA és molt semblant a la del A-DNA, amb forma de doble hèlix, i aparellaments iguals.
El RNA, però, apareix en general (in vivo) com una cadena senzilla, fet que implica que per adoptar estructures de doble hèlix s’ha de replegar sobre ell mateix i seleccionar el tros complementari que li doni més estabilitat. És per això que en l’estructura del RNA hi trobem protuberàncies, bucles interns... El RNA té tendència a formar estructures 3D complexes, fet que li permet tenir una sèrie de funcionalitats pròpies de les proteïnes (com per exemple el RNA ribosomal, el RNA de transferència o els ribozims).
S’ha detectat la presència de RNA en triples hèlixs que semblen tenir una estructura semblant a la del DNA, encara que encara no hi ha una descripció en alta resolució.
És menys flexible que el B-DNA.
23 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El RNA pot formar dúplex: l’estructura de RNA dúplex, és un tipus de DNA, li diuen RNA onze: un –OH més en la cadena de pentosa i una timina enlloc d’adenina.
El DNA i el RNA poden formar dúplexs (una hèlix de DNA i una altra de RNA). Aquestes estructures tenen una gran importància en la vida de la cèl·lula:  Es formen quan la transcriptasa reversa forma DNA a partir de RNA  Quan la RNA polimerasa forma mRNA a partir de DNA  Es formen durant la replicació dels “primers” en els fragments d’Okazaki.
En mRNA la traducció necessita helicases per a trencar els aparellaments.
El tRNA es replega en l’espai donant una estructura terciària en forma de L, que és estabilitzada per interaccions de Van der Waals, ponts d’hidrogen (entre zones allunyades de la cadena, no els ponts d’hidrogen de Watson i Crick que formen l’estructura secundaria)... Té una estructura terciària molt compacta i molt estable. El tRNA s’encarrega de “carregar” un aminoàcid que és el que es correspon amb el seu codó.
Els ribozims són RNA amb activitat catalítica. Molts ribozims naturals catalitzen la hidròlisi d’un dels seus propis enllaços fosfodièster o d’enllaços d’altres RNA.
El mRNA és l’àcid ribonucleic que conté la informació genètica procedent del DNA per utilitzarse en la síntesi de proteïnes, és a dir, determina l’ordre en el què s’uniran els aminoàcids.
24 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 7. SUPERENROTLLAMENT DEL DNA El genoma humà GENOMA = gens + regions no codificants + regions reguladores... Els gens són una part molt petita del genoma.
El genoma no és només el conjunt de gens, sinó que és el conjunt de gens, seqüències reguladores... (tota la informació genètica, tot el que té dins del seu “paquet”: gens, transposons...). Un gen és la unitat bàsica de l’herència i porta la informació genètica necessària per a la síntesis d’una proteïna (gens codificants) o d’un ARN no codificant (gens d’ARN). Està format per una seqüència promotora, que regula la seva expressió, i una seqüència que es transcriu.
Observem que un 30% del genoma humà són gens i que dins d’aquests la majoria són introns (28,5%), només un 1,5-2,5% són exons, que és la part codificant.
Els transposons (45%) són els què permeten l’evolució (fusió gens...): evolutivament generen variables que de vegades poden ser favorables (normalment no).
Hi trobem els LINEs (fan duplicacions, canvien de lloc, són gens (passa en menys freqüència): són llargs), SINEs (DNA satèl·lit (repetitiu): fragments curts, 50.000 còpies de l’element alu: tenen un punt de tall que es diu alu (no sabem què fan, funció evolutiva?).
Finalment trobem un 25% d’elements diversos, entre els quals hi ha els SSR (DNA satèl·lit, part més variable entre individus; riquesa d’A i T), els SD (pseudogens: els falten elements que els 25 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica impedeix que siguin funcionals) i un grup que no se sap el què fa, és inclassificable i ocupa el 17% dels elements diversos.
Els telòmers i centròmers estan formats per DNA altament o moderadament repetitiu.
No tots els gens tenen fenotip. Un gen pot codificar per un polipèptid o per un RNA (amb funció pròpia, com els RNA catalítics o ribosòmics).
Superenrotllament del DNA A la hèlix del DNA li falten voltes: es desenrotlla, però això provoca un superenrotllament altament regulat per les DNA topoisomerases. Durant la replicació o la transcripció hi ha tensió estructural. En un superenrotllament, la hèlix s’enrotlla sobre sí mateixa. És important veure que els extrems no estan lliures (si ho estiguessin rotarien i es relaxaria la tensió), en procariotes trobem el cromosoma tancat covalentment i en eucariotes DNA associat a proteïnes.
En la naturalesa, les molècules circulars de DNA (el cromosoma bacterià, els plasmidis bacterians i alguns DNA vírics) es troben habitualment superenrotllats. Aquesta naturalesa circular tancada dóna lloc a diferents estats de superenrotllament estables i no interconvertibles ( a no ser que es trenquin enllaços covalents). En quant al material genètic nuclear eucariòtic, està format per grans molècules de DNA lineals (cromosomes), és a dir, amb dos extrems que, per sí soles no poden mantenir un superenrotllament. Malgrat tot, les trobem associades estretament amb proteïnes que ancoren els extrems delimitant un bucle on la doble hèlix té el gir restringit. Forcen l’enrotllament del DNA al voltant de la pròpia proteïna, formant un o varis 26 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica bucles superhelicoïdals. En conclusió, tant en el DNA circular com en el lineal es dóna el fenomen de superenrotllament.
El superenrotllament és el gir d’una hèlix sobre sí mateixa, de manera que el seu eix no segueix una línia recta, sinó una hèlix. El superenrotllament només persisteix si els extrems es mantenen retinguts o subjectes, que pot ser externa o perquè els extrems estan units entre sí (DNA circular, present en bacteris i orgànuls d’eucariotes (mitocondris i cloroplasts)).
Hi ha molècules de DNA que són circulars, fet que fa referència a la continuïtat de la cadena de DNA i no a la seva forma geomètrica.
Quan un DNA de doble hèlix (dúplex) lineal es converteix en una molècula de DNA circular tancada apareix una propietat nova. L’eix de la doble hèlix pot estar enrotllat formant una superhèlix. A un DNA circular sense estructura superhelicoïdal se’l anomena molècula relaxada. El superenrotllament és biològicament important per dos motius:  Un DNA superenrotllat té una forma més compacta que el DNA relaxat corresponent.
Consegüentment, el superenrotllament és important en l’empaquetament del DNA de la cèl·lula.
 El superenrotllament influeix en el grau de desenrotllament de la doble hèlix i, per tant, afecta en les seves interaccions amb altres molècules.
Topologia del DNA 27 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Observem que en el cas L=26 no es pot separar si es desnaturalitza perquè està unit topològicament. El mateix passa per L= Lk = 1. L o Lk o linking number és el número de cops que un bri gira al voltant de l’altre. És una propietat intrínseca del DNA en absència de proteïnes.
Imaginem una molècula bicatenària de DNA de 104pb. Si adopta la conformació B hi haurà exactament deu voltes d’hèlix. El valor del nombre de gir T, doncs, serà 10. Ara suposem que flexionem la molècula, aproximant els seus extrems per a formar un cercle. Donat que el nombre de voltes de la hèlix en les molècules és enter (10 en aquest cas), els extrems d’ambdós brins quedaran correctament alineats amb la possibilitat d’unir-se per un enllaç fosfodièster. Si es realitza aquesta unió, tindrem una molècula circular tancada.
Al ser aquesta molècula plana (en veritat el què és pla no és la molècula sinó la trajectòria de l’eix de la doble hèlix) i sense tensió estructural (segueix adoptant la conformació B) se l’anomena forma relaxada. Per definició, la conformació relaxada és aquella que té superenrotllament zero.
Com a conseqüència del tancament de la molècula els brins ja no poden separar-se físicament (per exemple tibant d’ells en sentit contrari), sinó que estan travades, lligades, entrellaçades (molt similar als eslavons d’una cadena). Concretament, en aquest exemple estan entrellaçades deu vegades i es diu que la molècula té un nombre d’enllaç topològic 10. La molècula de la figura té L = 26.
Un valor de L = 0 significa que els dos brins no estan lligats, de manera que és possible separar-los. Quan L és diferent de zero, els dos brins estan lligats físicament, és a dir, no es poden separar. Això és així malgrat no haver-hi enllaços covalents entre ells. Per a referir-nos a aquesta unió física sense enllaç covalent es diu que hi ha un enllaç topològic. En una molècula amb enllaç topològic només poden separar-se els brins mitjançant el trencament d’un enllaç covalent (fosfodièster), és a dir, tallant un bri. El mateix és aplicable per a qualsevol procés que canviï el valor de L. Per aquesta mateixa raó, la deformació, plegament... dels brins sense tallar-los no altera L. A part, cal remarcar que si el DNA es talla i es torna a empalmar tampoc canvia L, només canvia la relació T-W (recorda que si hi ha un bri trencat no hi ha L).
L = T = 10, de manera que si L = T + W observem que sí que esta relaxada, ja que W = 0 (aquest fet mai passa).
28 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Nombre de gir i torsió L = T + W, on T és el nombre de gir i W el nombre de torsió.
El nombre de gir o twist number és el nombre de vegades que un bri gira al voltant de l’eix del dúplex de DNA (en condicions normals T=10). El nombre de torsió és el nombre de vegades que l’eix del dúplex gira al voltant d’un eix extern (superenrotllament).
Desenrotllament i superenrotllament En la figura observem què passa a nivell topològic amb el DNA (els DNA amb la mateixa L són equivalents topològicament). Observem quatre casos: a) Relaxat Hi ha vuit girs, L = 8 + 0, que és L sub-zero de Watson i Crick. Una volta = 10 pb.
b) Strained Hi ha set girs, L = 7 + 0 Per passar de (a) a (b) hem trencat el bri, l’hem rotat i l’hem tornat a tancar: una topoisomerasa ha tret una volta (amb els mateixos parells de bases). En aquí una volta = 11,4pb.
c) Supercoil (superenrotllament) El pas de (b) a (c) és un pas fàcil, que gasta poca energia.
L = 8 + (-1) (ha recuperat la seva estructura T = 8 a costa d’una superhèlix, de manera que és més estable, però L no canvia!!!).
Manté les seves vuit voltes amb un gir negatiu de superhèlix.
d) Strand separation 7 + 0 (70pb a banda i banda; recupera vuit votes a costa de separar un tram, 10pb).
29 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El DNA sempre tendeix a recuperar el seu nombre de gir. De (b) a (d) són topològicament equivalents.
Al DNA natiu li falten voltes de gir, per a compensar-ho augmentarà la seva torsió (origen de la tensió: treure o afegir voltes). En la cèl·lula eucariota, doncs, falten entre un 5 i un 7% de les voltes de gir (el DNA està desenrotllat). Això suposa unes avantatges: permet compactar el DNA (primer nivell), és molt fàcil obrir el DNA per a la seva transcripció o replicació (menor cost energètic).
El superenrotllament és negatiu quan la hèlix té menys voltes de l’esperat, mentre que és positiu quan la hèlix té més voltes de l’esperat. En el superenrotllament negatiu hi ha més parells de bases per volta (11 per exemple) i un menor gir per a cada residu (32A per exemple), mentre que en el positiu hi ha menys parells de bases per volta (9 per exemple) i un major gir per a cada residu (40A per exemple) comparat amb el B-DNA. El negatiu forma una superhèlix cap a la dreta i el positiu cap a l’esquerra, per disminuir la tensió.
Tipus de superenrotllaments Hi ha dos tipus de superenrotllaments: plectonèmic (sense proteïnes) i solenoïdal (amb histones; les histones indueixen a la superhèlix amb moviment solenoïdal).
El superenrotllament s’origina quan es giren els brins al voltant de l’eix de la doble hèlix, per a perdre o guanya torsió, i s’uneixen de nou els extrems. En les cèl·lules existeixen uns enzims denominats topoisomerases que catalitzen precisament aquest procés. Les topoisomerases converteixen uns topoisòmers en uns altres.
Hi ha dos tipus de topoisomerases: o Topoisomerasa de tipus I: trenca un bri.
Hidrolitzen un enllaç fosfodièster en un bri, fan passar l’altre bri a través del tall i tornen a unir els extrems del primer; com a resultat, L augmenta o disminueix una unitat.
o Topoisomerasa de tipus II: trenca dos brins.
Hidrolitzen els enllaços fosfodièster en ambdós brins i fan passar un doble bri a través del tall, resegellant aquest de nou; d’aquesta manera, L varia dues unitats de cop.
30 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica 8. CROMATINA EUCARIOTA Estructura de la cromatina La cromatina és el conjunt de DNA, histones i proteïnes no històniques que es troben en el nucli de les cèl·lules eucariotes i que constitueix el cromosoma d’aquestes.
Hi ha diferents tipus d’histones, concretament cinc variants: o H1: té moltes variants o H2A i H2B: tenen algunes variants o H3 i H4: tenen molt poques variants, estan molt conservades, especialment la H3.
Totes excepte la H1 (es relaciona en fibres de 30nm) (no té perquè estar associada al nucleosoma) constitueixen el nucleosoma, que té uns 200pb de mitjana. El nucleosoma està format per un nucli d’histones (petites, 11-21 KDa, bàsiques: riques en Arg i Lys, q>0) envoltat de DNA linker. Nucleosoma: dues voltes al voltant de l’octàmer. Disc (octàmer d’histones): H2A+H2B, H3+H4 H4+H3, H2B+H2A.
A la figura observem la fibra de 10 nm (rosari). En aquesta estructura es permet la transcripció, ja que no dificulta el pas de la polimerasa (si es compacta més no, és un mecanisme de regulació, com més compactat més repressió de gens).
H1 interacciona amb el DNA linker i el DNA del nucli, de manera que regula la distància entre els nucleosomes.
31 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Estructura del cromosoma eucariota: cromatina La cromatina pot trobar-se de dues maneres: o Eucromatina Gens transcripcionalment actius.
o Heterocromatina Gens que no són transcripcionalment actius (reprimits).
En el cromosoma de la imatge observem que hi ha d’haver nul·la activitat transcriptiva (està molt condensat = heterocromatina). El grau de compactació és de 10.000x i el gir del DNA al voltant dels nucleosomes de +x.
Nivells superiors d’estructuració de la cromatina eucariota: L’eucromatina és la fibra de 10nm. Si es compacta ja és heterocromatina (diferents graus de compactació). L’empaquetament comença a la fibra de 30nm (compressió 100x) (ja no es permet la transcripció) (relacionada amb H1), l’empaquetament es produeix si hi ha suficient H1. Per a la transcripció és necessària la descondensació cap a nucleosomes.
SAR: regions d’unió al scaffold (unió a una matriu proteica). MAR: regions d’unió a la matriu.
32 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica L’estructura o posició dels nucleosomes pot ser modificada Com es regula l’estructura de la cromatina a nivell epigenètic? No tots els gens s’expressen a la vegada (en trobarem de compactats i no disponibles per a la transcripció, d’altres que no).
L’epigenètica és la regulació en funció de la histona, els complexes que varien l’estructura de la cromatina...
S’ha de tenir en compte que el nucleosoma es troba associat amb el seu DNA gran part del seu temps, però no sempre, hi ha un període de temps molt curt on el DNA es troba desenrotllat.
D’aquesta manera, hi ha un equilibri entre l’estat d’associació i el de no associació. Els enzims poden canviar l’equilibri modificant les histones (canviant la seva càrrega neta o modificant-les), però també existeixen els complexes de remodelació (gasten ATP), que canvien la correlació del DNA amb les histones (canvien el gir: no gir superhèlix negatiu introduint ni que sigui una mica d’interacció superhèlix positiva de manera que disminueix l’associació).
L’estructura del DNA envoltant el nucleosoma pot transcriure’s, però cal que es desplacin els nucleosomes. Quan passa? Els complexes de remodelació desplacen el nucleosoma o el poden eliminar temporalment (desplaçar o des associar per disminució de l’afinitat).
Pot haver-hi recanvi d’histones Els complexes de remodelació i de modificació són qualsevol complex associat a DNA.
Pot haver-hi pèrdua total o recanvi d’alguna part de les histones. En els dos casos reinstal·lant un altre amb unes altres variants d’histones (el nucleosoma tindrà diferent estabilitat) i metilació del DNA.
33 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica El nou octàmer pot estar modificat (post-traduccionalment) o pot ser subtipus de H1, H2A, H2B i H3 que tenen diferent afinitat pel DNA (diferents gens per a cada histona).
Modificacions d’histones L’epigenètica és tot allò que justifica els canvis en l’expressió genètica heretables o no (ex.
bessons univitel·lins depèn on visquin registren canvis epigenètics) que no són deguts a la seqüència del DNA. Molts d’aquests canvis són degut a modificacions a histones.
En les histones la part N-terminal es troba projectada cap a l’exterior, de manera que pateix moltes modificacions que poden afectar al propi nucleosoma (afinitat histona-DNA), però també al veí!!! Així doncs, la propagació és un fet comú (hi ha barreres per evitar-ho) i la majoria de modificacions ens histones es produeixen en el N-terminal.
Aquesta modificació pot reclutar proteïnes de reconeixement que recluten més proteïnes modificadores o remodeladores.
34 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Acetilació d’histones L’acetilació d’histones es dóna en les lisines (Lys) de l’extrem N-terminal (exterior) i provoca una variació en la càrrega (li treu càrrega positiva) de manera que disminueix l’afinitat elèctrica per al DNA. Poden haver-hi vàries modificacions per histona. La pèrdua de la càrrega positiva provoca una pèrdua de l’afinitat pel DNA i, per tant, una descompactació de la cromatina (pot haver-hi transcripció).
En general les zones d’eucromatina es troben més acetilades que les d’heterocromatina.
Trobem dos tipus d’histones, les HAT i les HDAC. Les HAT (histones acetil transferases) poden trobar-se de dos tipus, les de tipus A i les de tipus B. Les de tipus A actuen a nivell de citosol i només acetilen H3 i H4 per reincorporacions en cromatina (no modifica la cromatina). Les de tipus B i modifiquen les histones acoblades en la cromatina i estan implicades en zones que han de ser transcrites. Les de tipus B modifiquen el nucli activament fent accessible la cromatina per a la transcripció. Aquest és un procés reversible, existeixen histones desacetilases (HDAC) que són enzims / complexes silenciadors (molts usen com a coenzim el NAD+, de manera que hi ha vincles amb el metabolisme energètic; trenquen NAD+ i alliberen vitamina D provocant canvis fenotípics associats a estrès).
En resum, les HAT són complexes multimèrics de transcripció.... Mentre que les HDAC s’ocupen del silenciament gènic, silencien la cromatina.
35 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Metilació d’histones La metilació d’histones modifica Lys o Arg (arginina) en l’extrem N-terminal, en aquest cas no afecta a la càrrega. Les histones poden trobar-se de diferents maneres: o Monometilades o Dimetilades o Trimetilades En aquest cas, depenent del residu de Lys o Arg modificat tindrem un efecte o un altre perquè l’efecte no és directe, sinó que recluta proteïnes d’unió.
Mirem un exemple: metilació i acetilació d’H3 i H4.
La histona H3 té diverses posicions que poden ser acetilades i/o metilades (no tots els residus de Lys poden ser metilats). Hi ha posicions, doncs, que hi ha competència entre aquests processos perquè si són metilades no poden ser acetilades a no ser que vingui l’enzim desmetilasa, i si són acetilades no poden ser metilades a no ser que vingui l’enzim desacetilasa.
Per exemple, en la H3 la Lys 9 (K 9) metilada es compacta (heterocromatina) i recluta enzims que metilen la Lys 14 de manera que amplifica la senyal de compactació i inhibeix que s’acetili la 14: repressió de gens. Però si hi ha una metilació de la Lys 4, hi ha un efecte oposat, hi ha la obertura de la cromatina (descondensació). No és un efecte directe, sinó modificat per proteïnes que ho reconeixen i es reuneixen i recluten altres proteïnes que fan més canvis: recluta enzims que descompacten, sentit activador.
En definitiva, la metilació depenent del residu modificat pot tenir una reacció diferent i a més pot inhibir altres acetilacions o metilacions. Com en l’exemple, on la metilació en la posició nou no només evita l’acetilació, sinó que inhibeix l’acetilació en la posició 14. La metilació de Lys en posició 9 recluta proteïnes (DNA metilases) que metila DNA en citosina.
36 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Això dóna la idea de què hi ha una intercomunicació entre les diferents senyals de modificació.
Metilen les His metiltransferases (HMT), també hi ha His demetilases (HDM) que oxiden el CH3 fent un hidroximetil (demetilació oxidativa), les demetilases necessiten oxigen i betacetoglutamat i el producte final és formaldehid, CO2 i succinat (un altre cop relacionat amb el metabolisme).
Ubiquitinació d’histones La ubiqüitina és un polipèptid d’uns 76 aminoàcids (bastant petita) que té una hèlix central i una fulla beta que la rodeja. Té una Gly (glicina) en l’extrem C-terminal que es pot unir a través d’ubiqüitina ligasa (enzim) a la Lys (K) de la proteïna diana (en el nucli d’aquesta!!! No en el Nterminal).
Mètode normal: Un ubiqüitina s’uneix a una altra formant una cadena d’ubiqüitines, de manera que una proteïna poliubiqüitinada està marcada per a ser degradada en el protosoma (sistema de degradació específic: NO és el general; ex. regulen ciclines).
Mètode en His: Les histones també poden ser ubiqüitinades, la diferència és que s’ubiqüitina per una única ubiqüitina i no serà degradada. S’uneix en la part interna de la His, no en el Nterminal. Així doncs, la ubiqüitina no indueix a la seva degradació, sinó que fa de senyal per a reclutar altres proteïnes que facin més modificacions.
S’ha observat que només s’ubiqüitinen les histones H2A (posició 119) i H2B (posició 220) i en la seva zona globular (nucli).
La ubiquitinació té un efecte indirecte, ja que recluta proteïnes de reconeixement que recluten altres proteïnes de modificació provocant diferents efectes: en la H2A provoca compactació de 37 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica la cromatina (inhibeix; repressió), mentre que en la H2B recluta histones acetilades de manera que provoca descompactació de la cromatina (s’activa).
Sumoilació És un procés dut a terme per SUMO (small ubiquitin-related modifier). Estructuralment és similar a la ubiqüitina, però tenen seqüències diferents (en veritat procedeixen de camins molt diferents) i, per tant, efectes diferents. SUMO, a diferència que les ubiqüitines, sempre actua en un sentit: sempre reprimeix (compacta la cromatina) i pot modificar les quatre histones.
Quan una histona és sumoilada recluta HDAT i desacetilen el nucleosoma (veure imatge).
En resum, SUMO pot induir a la compactació mitjançant histones del nucli (recluten les histones d’acetilases). La sumoilació és posttraduccional (no és exclusiva de les histones).
*Important no confondre la metilació del DNA amb la metilació de les histones!!! 38 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Fosforilació La fosforilació té lloc en l’extrem N-terminal i afecta als aminoàcids Ser i Thr. En aquest procés també hi ha una modificació de la càrrega, però en aquest cas enlloc de treure càrrega positiva, el què fa és afegir càrrega negativa, fet que provoca un efecte de descompactació (s’ha vist en gens d’estrès tèrmic).
La fosforilació fa baixar l’afinitat de la histona per a l’àcid nucleic provocant la descompactació i pot propagar-se. Aquest mètode reconeix un patró de modificació concret (codi histona), de manera que produirà una resposta determinada.
En la imatge observem un cas concret on la fosforilació de Ser 10 provoca l’acetilació de Lys 9 i Lys 14, fet que competeix amb la metilació de Lys 9, que impedeix la fosforilació de la Ser 10.
Cal remarcar que en una histona no trobem només una única modificació, el codi histona va regit per més d’una modificació.
Codi Histona Combinacions de modificacions d’histones histona) superfície d’interacció d’altres proteïnes (codi regulació de l’expressió gènica.
39 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Variants d’histona Hi ha diferents variants per a una mateixa histona (excepte la H4), sobretot la H1, i poden variar segons l’espècie. En la figura comentem les més estàndards i en el cas concret dels mamífers: En la histona H2A la zona de la C-terminal és la part variable.
o H2AX: Cromatina marcada per a la replicació. Quan s’ha de reparar el DNA perquè s’ha trencat o el què sigui, en la zona del trencament els complexes de remodelació intercanvien H2A per H2AX (és fosforilada i fa de senyal per a cridar factors de reparació, que se situen a allà i s’acoblen per a reparar el DNA).
o H2AZ: Abunda en zones amb cromatina poc compactada (activa transcripcionalment).
o MacroH2A: Abunda en corpuscles de Barr i compacta la cromatina. És l’encarregada de la inactivació del cromosoma X en dones (el cromosoma X inactiu conté macroH2A). En xoc tèrmic, les xaperones tenen els seus gens rics en H2AZ (major i millor activitat transcripcional).
o H3.3: Es troba en gens transcripcionalment actius (en eucromatina) i té quatre aminoàcids diferents respecte H3.
o CENP-A: Es troba en el centròmer, en la regió del superenrotllament positiu (la resta de zona és negativa), és a dir, a la del fus mitòtic.
40 TEMA8. Nucleòtids i àcids nucleics Bioquímica Complexes de remodelació de cromatina Fins ara hem vist els complexes de modificació, que són reclutats a la zona on han d’actuar per senyals de factors de transcripció... Els complexes de remodelació no modifiquen histones, però sí la relació del nucleosoma amb el DNA. Poden moure, desplaçar o recanviar histones.
En eucariotes hi ha tres macrocomplexes de remodelació (SWI/SNF, RSC i ISWI) tots amb ATPases i molt grans que es creu que modifiquen topològicament el DNA.
41 ...