Resum Seminaris (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecniques de bioquímica i biologia molecular
Año del apunte 2016
Páginas 37
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

Seminaris Tècniques de Bioquímica i Biologia Molecular ÍNDEX Seminari 1. Aïllament, purificació i quantificació de proteïnes........................................................................................ 1 Seminari 2. Aïllament, purificació i quantificació d’àcids nucleics ................................................................................. 4 Seminari 3. Tècniques immunohistoquímiques ................................................................................................................ 6 Seminari 4. ChIP-on-chip ................................................................................................................................................. 8 Seminari 5. ELISA (Enzyme-Linked Inmunosobent Assay) .......................................................................................... 10 Seminari 6. Multiplez Bead Array Assays (Luminex) .................................................................................................... 12 Seminari 7. Difference in Gel Electroforesi (DIGE) ...................................................................................................... 14 Seminari 8. PCR.............................................................................................................................................................. 16 Seminari 9. Real Time PCR (qPCR) ............................................................................................................................... 18 Seminari 10. Detecció de SNPs mitjançant sondes TaQman .......................................................................................... 20 Seminari 11. Seqüenciació Sanger per electroforesi capil·lar......................................................................................... 22 Seminari 12. Detecció de SNPs mitjançant SNaPshot .................................................................................................... 25 Seminari 13. Next Generation Sequencing (NGS). Plataforma Ion Torrent ................................................................... 26 Seminari 14. Next-generation sequencing (NGS): Plataforma Illumina ......................................................................... 29 Seminari 15. Detecció de la Metilació mitjançant conversió amb Bisulfit ..................................................................... 32 Seminari 16. Detecció de SNPs mitjançant Sequenom MassARRAY ........................................................................... 35 Seminari 1. Aïllament, purificació i quantificació de proteïnes 1. Preparació de la mostra: Seminari 1. Aïllament, purificació i quantificació de proteïnes 1. Preparació de la mostra Es fa una lisi cel·lular mitjançant mètodes físics/mecànics (liquadores, homogeneïtzador Dounce o d’ultrasons, purificació en nitrogen líquid i perles de vidre) o químics (detergents, solucions hidrofòbiques), on els segons dependran del tipus i localització de la proteïna d’interès i els primers es tractaran de mètodes més o menys agressius segons el tipus de cèl·lula (en el cas de plantes s’usen mètodes més agressius perquè s’han de trencar dues barreres: la paret i la membrana cel·lular). En aquest pas és molt important l’ús d’inhibidors de proteases i fosfatases, els quals són alliberats i poden danyar les nostres proteïnes d’interès. També és molt important l’ús de baixes temperatures (es a dir, fer aquest procés en gel), per tal d’inhibir l’activitat dels enzims hidrolítics.
Posteriorment a la lisi cel·lular, es duu a terme una centrifugació per tal de descartar les fraccions que no ens interessen. Podem fer una centrifugació normal per descartar fragments de membrana i nuclis per quedar-nos amb el sobrenedant, o bé podem fer una centrifugació diferencial, en la qual podem separar els mitocondris.
2. Mètodes de purificació: la purificació consisteix en un aïllament d’un o més enzims de interès basant-nos en característiques fisicoquímiques.
a. Dependents de la mida o massa: ultracentrifugació, diàlisi, cromatografia de filtració en gel, ...
b. Dependents de la polaritat: cromatografia de bescanvi iònic, cromatoenfoc, electroforesi (en gel o en paper), cromatografia d’interacció hidrofòbica, ...
c. Dependents de la solubilitat: precipitació amb sulfat d’amoni, amb TCA, amb acetona, amb acetona + TCA, .... En aquests mètodes es pot provocar la precipitació de les proteïnes.
3. Mètodes de quantificació de proteïnes a. Mètode de Kjeldahl: és l’únic mètode analític, els que venen desprès són únicament preparatius i requereixen d’altres mètodes per una posterior quantificació. Determina la quantitat de nitrogen de la mostra, basant-se en que el contingut de nitrogen de les proteïnes acostuma a ser el 16% del pes total.
Cal tenir en compte que pot haver interferències de continguts no proteics que contenen nitrogen. Es poden analitzar, com a màxim, 8 mostres a la vegada.
Compostos proteics (color negre/marró) + H2SO4 concentrat + catalitzador  els grups nitrogenats s’oxiden donant com a resultat NH3 (amoníac: color transparent). S’afegeix potassi i sulfat d’amoni (per augmentar el punt d’ebullició), a més, s’ha de vigilar, evitant així un escalfament excessiu  Es deixa en repòs diverses hores (el calor s’ha de mantenir aproximadament dues hores)  Barreja refredada es transfereix a un flash de destil·lació de vapor  Mescla alcalina amb NaOH en excés  Destil·lació de l’amoníac en un flash receptor Solució amb amoníac i àcid bòric  Ions amoni es valoren amb una solució d’HCl estàndard.
Càlculs: mitjançant estequiometria: 1 àtom de N  1 mol de NH3  1 mol HCl = 14 g N, desprès es té en compte que en 100 g totals de proteïna trobem 16 g de nitrogen. Amb els factors de conversió necessaris, obtenim el valor de grams totals de proteïna en la mostra.
b. Mètode de Biuret: és un mètode colorimètric que permet determinar la concentració de proteïnes d’una mostra mitjançant espectroscòpia ultraviolada (540 nm). El reactiu de Biuret és una mescla d’una base forta (medi alcalí, normalment NaOH) amb sulfat de coure (II) i és de color blau. En presència de proteïnes, reacciona amb els enllaços peptídics donant com a resultat una coloració lila.
La quantitat de producte que es forma és proporcional a la concentració de proteïna de la mostra, de forma que el color lila també ho serà. El reactiu de Biuret reacciona amb dos o més enllaços peptídics de la proteïna, generant un compost lila.
c. Mètode de Lowry: un altre mètode colorimètric que ens permet quantificar el nombre de proteïnes.
Consisteix en l’addició d’un reactiu que forma un complex colorejat amb les proteïnes en que la intensitat del color és proporcional a la concentració de proteïnes, consta de dues reaccions: 1- Reacció de Biuret: formació del complex Cu2+-proteïna, donant color blau clar i on s’exposen els residus fenòlics de la tirosina. Reactiu s’uneix als enllaços peptídics formant un complex de coordinació.
2- Reacció de Folin-Ciocalteau (àcid fosfomolibdetúngs): reducció dels grups fenòlics que s’han exposat en l’anterior reacció donant lloc a un color blau fort. (groc  blau) Per últim es fa una observació colorimètrica mesurant l’absorbància a una longitud d’ona de 540 nm. Els resultats són tractats amb la Llei de Lambeert-Beer.
d. Mètode de Bradford: mètode colorimètric que es basa en l’ús del colorant Comassie Blue G-250, el qual presenta dues formes colorejades en medi àcid: blau i vermell/marró. Les proteïnes s’uneixen a la forma blava per formar un complex proteïna-colorant amb un major coeficient d’extinció molar que el colorant lliure. Es determina el contingut proteic mitjançant una corba de calibratge: a major quantitat de proteïna  major intensitat de color  major absorbància (llei de Lambert-Beer). És més sensible que els anteriors però presenta interferències.
e. BCA: combina la reacció de les proteïnes amb Cu2+ (mètode de Biuret) en un medi alcalí (genera Cu1+) amb un reactiu per a la detecció de Cu1+ altament sensible i selectiu que és l’àcid bicintxonínic (BCA). L’estructura macromolecular de la proteïna amb quatre pèptids específics dóna lloc a la formació de color quan es combinen amb BCA  un altre mètode colorimètric. Requereix la construcció d’una recta patró.
Els tres últims mètodes no són analítics, mentre que el mètode Kjeldahl sí que ho és. Aquests tres últims són mètodes preparatius per desprès poder dur a terme altres mètodes (espectrofotometries), de forma que en aquests es requereix la construcció d’una recta patró, que acostuma a ser d’albúmina bovina, però com tot, dependrà del tipus de mostra que volem quantificar (globular o fibrosa).
El mètode estàndard és el Kjedahl, on les proteïnes es destrueixen.
Seminari 2. Aïllament, purificació i quantificació d’àcids nucleics 1. Extracció d’àcids nucleics a. Passos generals d’extracció d’àcids nucleics Alliberació dels àcids nucleics de les cèl·lules: bacteris, fongs o virus, s’usen mètodes agressius com bullir aigua destil·lada, sabons en fred i calor o enzims  protecció i estabilització dels àcids nucleics enfront la degradació  eliminació d’inhibidors de l’amplificació  concentració de la mostra i la diana en un petit volum  col·locació de la diana en un medi aquós compatible amb el mètode d’amplificació b. Manipulació del RNA: aquest acostuma a degradar-se molt més fàcilment que el DNA, de forma que s’ha de tenir major precaució durant la manipulació, ja que les RNAses són difícils d’inactivar, inclús quan les solucions passen per un autoclau. Les dues mesures que s’han de prendre són: evitar la contaminació amb RNases, treballant amb material lliure de RNases i treballant amb guants en tot moment (evitant el contacte amb el cos i superfícies) i impedir (o disminuir) l’acció de les RNases usant inhibidors específics i treballant amb rapidesa i precisió (de vegades en fred). Treballar amb material comercial que és RNAsa free.
2. Aïllament d’àcids nucleics de contaminants que no ens interessen a. Cromatografia de penetrabilitat: el component bàsic és una columna empaquetada amb una matriu en gel especial, aquest gel consisteix en partícules d’un polímer orgànic d’estructura tridimensional, les quals originen una xarxa de porus hidrofílics equilibrats amb un tampó aquós.
La tècnica consisteix en que les molècules de gran tamany no penetren pels porus de polímer, de forma que migren més ràpidament que les de menor tamany, que sí són capaces de penetrar pels porus de la matriu.
b. Cromatografia de bescanvi iònic: és el mètode més usat El mecanisme bàsic és l’intercanvi reversible dels ions en solució amb els grups funcionals units covalentment a una fase estacionària insoluble anomenada resina. Per exemple, un àcid nucleic amb càrrega negativa, a pH 7 s’unirà a un intercanviador iònic amb grups carregats positivament, però eluirà de la columna al canviar el pH amb el tampó d’elució, ja que els ions d’aquest tampó interaccionen amb els grups carregats de l’àcid nucleic o de l’intercanviador iònic, de forma que primer eluiran de la columna les molècules amb càrrega positiva que no s’uneixen a la fase estacionària i posteriorment, al afegir el tampó d’elució, eluiran les molècules amb poca càrrega negativa neta i després les de major càrrega negativa neta.
c. Ultrafiltració: és una cromatografia per exclusió de mida en una membrana d’una determina mida de porus i s’acostuma a usar per la purificació d’àcids nucleics desprès de la PCR. NucleoFast Filter. Es basa en filtre amb porus específics de RNA o DNA, on obtenim la nostra mostra pura a partir de rentats i centrifugacions.
En aquesta tecnologia, la mostra es carrega directament sobre la membrana d’ultrafiltració i mitjançant buit o centrifugació s’eliminen tots els contaminants mentre que la mostra amb els àcids nucleics (d’una mida superior normalment a 150 pb) roman en la superfície de la membrana. Desprès d’un pas de rentat opcional per eliminar les impureses de la mostra, es recuperen els àcids nucleics afegint aigua o un tampó adequat. Mètode més específic! d. Precipitació amb etanol, isopropanol o cloroform 3. Quantificació d’àcids nucleics: el més normal és espectrofotometria a 260 nm a. Espectrofotometria: font lluminosa (260 nm)  prisma  mostra (DNA, RNA o oligonucleòtids en solució aquosa)  cèl·lula fotoelèctrica. La cubeta pot influir en els resultats i necessitem un mínim de mostra.
i. NanoDrop: no necessita cubeta, usa tensió superficial, el volum de la mostra és d’1 µL (1 gota).
Es tracta d’un espectrofotòmetre d’espectre total (220-750 nm) que, com ja he esmentat, mesura la concentració amb 1 µL de mostra amb gran exactitud i reproductibilitat. Usa la tensió superficial per mantenir la mostra en el seu lloc (per això no usem cubetes), a més, el ND-1000 té la capacitat de mesurar mostres molt concentrades sense necessitat de diluir-les  accepta 50X més de concentració que les mesures estàndard amb cubetes.
Totes aquestes característiques el fan idoni per mesurar la concentració d’àcids nucleics i per determinar la seva qualitat, el software calcula automàticament la concentració d’àcids nucleics seguint una reacció. Costa uns 12.000 €, és eficient de temps (gran avantatge, si són moltres mostres ho farà un becari). Si tenim poca quantitat d’àcids nucleics passen a la fluorimetria.
b. Fluorometria: es genera una emissió de fluorescència de molècules (fluorocroms) quan s’uneixen a dianes específiques com ara el DNA, la senyal és proporcional a la unió. Aquests fluorocroms presenten baixa afinitat pel DNA/RNA de cadena simple, ja que s’enllaça en el solc menor entre A-T.
i. Qubit: usa fluorocroms específics per proteïnes i àcids nucleics, duent a terme una quantificació específica de DNA de cadena simple i doble en un volum de mostra d’entre 1 i 20 µL, la concentració d’aquesta mostra serà proporcional a la fluorescència emesa.
A diferència del Nanodrop, permet la quantificació de cadena simple o de doble cadena, fet que produeix una mesura més precisa. És necessària una preparació prèvia de la mostra i l’elaboració d’una recta patró. S’ha de tenir en compte que en els assaigs de DNA de doble cadena la concentració mesurada en NanoDrop pot ser fins a 10 cops superiors a la mesurada en Qubit. Té un preu de 2.000 €, tot i ser més barat que NanoDrop, és menys eficient de temps.
c. Bioanalyzer Agilent 2100: Determina la qualitat i quantitat de RNA de forma més fiable que els sistemes tradicionals. Consisteix en un sistema de micro-electroforesi per nano-capil·lars (electroforesi capil·lar que separa per mida les molècules) , de forma que minimitza la quantitat de RNA necessari i el temps del procés. Ens permet obtenir un algoritme denominat RIN (RNA Integrity Number) que determina la qualitat de les mostres de RNA en un rang numèric del 1 al 10, on 1 ens indica que la mostra està totalment degradada i 10 que està intacta, en realitat ens està parlant de la puresa del RNA, si no obtenim valors majors o iguals a 8, es repeteix el procediment. Ens permet analitzar 12 mostres a la vegada. Únic dispositiu que ens dóna el valor RIN és el BioAnalizer. S’usa aquesta tècnica quan extraiem RNA i volem detectar un gen amb una sonda, on necessitem que el RNA sigui molt pur.
Seminari 3. Tècniques immunohistoquímiques 1. Introducció: aquestes tècniques tenen com a objectiu la detecció d’antígens específics en un teixit mitjançant anticossos marcats amb enzims o fluorescència. Ens permet veure si una proteïna s’expressa més o menys i en quina de les cèl·lules. Immunocitoquímica vindria a ser el mateix però amb cèl·lules en cultiu. Dura unes 48 hores, en hospitals hi ha equipaments automàtics (manualment es poden fer com a màxim 15 mostres a la vegada) que fan 200 portaobjectes en 2-3 hores.
2. Fixació: aquesta dependrà de la mostra i de l’anàlisi posterior (el que volem marcar). Pas molt important que mantindrà l’estructura del teixit i mantindrà l’antigenicitat (capacitat dels antígens per ser detectats pels anticossos).
a. Física: congelació de la mostra  microestat: tall de 5-10 µm  assecar a temperatura ambient (124 h)  fixació amb etanol o metanol (10-15 min)  segellat de les mostres amb un retolador hidrofòbic  congelació de les seccions fins al seu ús a -20ºC b. Química: i. Alcohol i cetona: fixació  assecat (1-24 h)  neteja amb solució salina  anàlisi ii. Formaldehid: aquest preserva la morfologia cel·lular de teixits tous. Es posa el teixit amb formaldehid (1 – 24 h)  Rentat 3 cops amb solució salina  Deshidratació  Inclusió amb parafina: tallar teixit en blocs de 5-10 mm  Rentats amb alcohol ascendent  Toluè o xilè  Posar en parafina el teixit durant 1 h a 58ºC, en aquesta temperatura és quan es troba líquida, ens servirà per tenir la mostra en un bloc. Les mostres amb parafina s’han de tallar amb un micròtom i les seccions es munten sobre portaobjectes adhesius i han d’estar molt seques (estufa 56ºC o 37ºC). Formaldehid manté l’antigenicitat (protegeix l’antigen amb cross-linkers) però altera la conformació de les macromolècules proteiques.
3. Eliminació de parafina: és important que l’antigen quedi lliure perquè es pugui unir l’anticòs. Per eliminar la parafina primer es posa el bloc en cubetes verticals amb solució de xilè, la qual torna soluble la parafina per facilitar la seva extracció, després es fa una rehidratació amb una concentració d’alcohol decreixent.
En cas que no es poguessin detectar els antígens per l’emmascarament amb cross-linkers, s’hauria de treballar amb crio-seccions. Quan es congela una mostra, es posen crio-protectors, el criòstat permet mantenir la mostra congelada a -20ºC, la qual serà tallada amb un micròtom, el qual necessita que el teixit estigui dur per poder tallar-lo bé.
4. Recuperació d’antígens: la fixació amb formaldehid altera l’estructura tridimensional de l’antigen, ja que es formen ponts d’unió que emmascaren l’antigen/epítop (cross-linkers). 2 mètodes de recuperació: a. Hier (recuperació per inducció de calor): s’indueix calor (92-95ºC), fent bullir la mostra en una solució que pot contenir diferents reactius en funció del pH òptim per recuperar l’epítop de l’antigen (Glicina-HCl, Citrat, EDTA), no es fa en alcohols o cetones perquè són susceptibles a altes temperatures.
b. Pier (recuperació per inducció proteolítica): una digestió enzimàtica amb proteases separa/escindeix els cross-linkers que s’havien format amb el formaldehid. S’usa únicament en teixits recoberts amb parafina. No s’assegura que no es danyi la resta del teixit, per això Hier és més usat. S’incuba la solució de l’enzim amb la mostra a 37ºC i es renta amb TBS.
5. Blocking: es bloquegen els epítops del teixit que no són específics per l’anticòs que no són específics per l’anticòs que usem com a marcador i de regions inespecífiques. Millora l’antigenicitat i el fet de fer una unió més específica. Si es fa un mal blocking s’obté un resultat molt pobre en la tinció. S’incuba la solució de bloqueig (qualsevol proteïna que no tingui afinitat per l’antigen diana) amb la nostra mostra 30 minuts a temperatura ambient. Aquest pas millora la sensibilitat de l’assaig immunohistoquímic eliminant la interferència que poden causar diferents elements del teixit en la unió específica Ac-Ag. Pas previ a la incubació del teixit amb l’anticòs.
6. Marcatge i visualització a. Mètode directe: reacció antigen-anticòs única i directa, on l’anticòs està marcat amb fluorescència, biotina o enzims.
Preparació del teixit  Blocking  Eliminació excés solució bloquejadora  Addició anticòs marcat  Esperar fins obtenir coloració  Muntatge per observar al microscopi.
b. Mètode indirecte: es poden usar anticossos monoclonals o policlonals (aquests presenten més afinitat per l’antigen). A banda d’això, s’han de seleccionat anticossos primaris (han de ser extrets d’espècies diferents a les que estudiem per evitar unions endògenes) i els secundaris (una IgG que la seva part variable reconeix la part constant d’una altra Ig, i que estarà marcada). És més sensible que el mètode directe, ja que s’ha de tenir en compte l’amplificació dels anticossos secundaris. Protocol més complex que mètode directe (espero que no el pregunti).
c. Procés de marcatge: i. Marcatge per biotina: complex Avidin-Biotina (ABC): aquestes tècniques es basen en l’elevada afinitat de la streptavidina i la avidina per la biotina. Primer s’uneix l’anticòs primari, posteriorment el secundari s’unirà en aquest, i l’enzim que carrega (HRP) catalitza la conversió de DAB en un producte de color marró que es quedarà en la superfície del teixit i es podrà observar per microscòpia òptica, de fluorescència o electrònica.
ii. Marcatge enzimàtic: l’enzim marcador ha de ser visualitzat a través d’un sistema cromogènic enzimàtic. Partim d’un substrat soluble incolor que mitjançant la reacció enzimàtica es convertirà en un producte insoluble amb color (formació de precipitat). HRP i AP (+ típics) iii. Marcatge amb fluorocroms: ens permet observar la distribució de dos o més antígens dins de la porció de teixit, de la pròpia cèl·lula i les estructures cel·lulars.
d. Tinció al microscopi: necessària per saber en quin lloc es troba el nostre antigen  contra-tinció.
i. Tinció amb hematoxilina-eosina: les zones àcides (nucli cel·lular) queden de color blau i les bàsiques (citoplasma) rosa clar. El procediment consisteix en una hidratació, una tinció i per últim una deshidratació. Aquesta tinció ens permet saber la posició on es troba el nostre antigen d’interès, ja que ens permet diferenciar les diferents parts del teixit ii. Tinció fluorescent: amb DAPI Si l’anticòs primari està molt concentrat, es crea un impediment tridimensional que no permet una correcta unió anticòs-antigen, aquest és l’anomenat efecte pro-zona.
Seminari 4. ChIP-on-chip Aquesta tècnica combina l’ús d’immunoprecipitació de cromatina (ChIP) amb l’ús de chips o micro-arrays. L’objectiu és l’estudi de proteïnes d’unió al DNA, com ara factors de transcripció, reguladors i histones.
1. ChIP: és la precipitació de la cromatina mitjançant l’ús d’anticossos. Primer es fa una fixació de les interaccions proteïna-proteïna i les proteïna-DNA, posteriorment es duu a terme la immunoprecipitació dels complexos DNA-proteïna amb anticossos específics. Aquesta precipitació ve donada perquè els anticossos s’hauran unit en llocs del DNA, aquesta unió augmentarà el pes del complex DNA-anticòs i per aquest motiu precipita. Aquesta precipitació ocorre en proporcions equimolars, de forma que la quantitat d’anticòs que necessitem per a que es doni la precipitació ens donarà una referència de la quantitat de proteïna que tenim interaccionant en aquell moment en el DNA. Gràcies en aquesta precipitació, podrem fragmentar la cromatina i les seqüències de DNA immunoprecipitades seran aleshores amplificades per PCR, de forma que sabrem la seqüència de DNA a la que estava unida la proteïna d’unió al DNA que feia d’antigen per al nostre anticòs.
Per a que tingui lloc la precipitació, anticòs i proteïna d’unió al DNA han d’estar en proporcions equimolars (zona d’equivalència).
La finalitat d’aquesta tècnica és l’estudi de la interacció DNA-proteïna així com la seva localització en el genoma, sobretot en factors de transcripció i histones. També s’usa en anàlisis epigenètics. Aquests estudis, ens permeten un major coneixement de la regulació genètica, la proliferació cel·lular i la progressió de malalties. Però hi ha un inconvenient, i és que hi ha molts punts d’interacció i potser aquests tenen interaccions més complexes del que pensem., a més, es requereix molt de temps i material. Què s’ha fet per solucionar aquest problema? 2. Micro-array: quins canvis comporta? La tècnica passa a denominar-se ChIP-on-chip, això ens dóna un avantatge ja que es poden usar centenars d’anticossos diferents i marcats amb els seus respectius fluorocroms, que un cop introduïts en un lector ens donaran gran quantitat d’informació que és directament digitalitzada  era de les òmiques.
3. Fase experimental: a. Wet-lab: es provoca la unió de la proteïna amb el DNA, hi ha cops que ho fa la mateixa cèl·lula, però altres ho hem d’induir nosaltres aplicant condicions d’estrès.  la unió es fixa amb formaldehid per evitar que es separin  lisem les cèl·lules  ultrasons (tallen a l’atzar) o nucleases per generar fragments de 0,2-1 kb  addició d’anticossos específics per a la nostra proteïna d’interès  separació (mitjançant centrifugació, per exemple) per separar les zones unides a l’anticòs de les que no  trenquem la fixació amb formaldehid mitjançant calor (ja que sol ens interessa el fragment de DNA, no la proteïna)  fragments de DNA s’amplifiquen per PCR  un cop amplificat, es desnaturalitzen les cadenes de DNA i a les cadenes simples resultants se’ls acobla un marcador fluorescent (Cy5 o Alexa 647)  inserim mostra en un micro-array de DNA (conté petites seqüències de DNA i quan un fragment marcat troba una seqüència complementària hibriden i s’emet fluorescència b. Dry-lab: hem d’esperar a que la mostra s’uneixi al micro-array i emeti fluorescència, el que indicarà que la nostra mostra ha hibridat correctament  informació fluorescent es converteix en dades informàtiques, l’extracció de dades acostuma a ser el pas més difícil degut al soroll de fons i a l’ús d’algoritmes adequats per normalitzar les dades. Els dos pics fan referència a les seccions del gen on probablement estigui la nostra proteïna i les zones on no s’observen es pics són absents de la proteïna.
4. Avantatges i inconvenients: Permet una alta resolució del mapa de tot el genoma: podem determinat els punts d’unió de moltes proteïnes d’unió al DNA com factors de transcripció La combinació d’aquestes dues tècniques permet l’estudi a gran escala de les modificacions d’histones, factors associats a la cromatina o enzims modificadors.
Es poden estudiar un nombre molt elevat de locus a la vegada, i aquests poden arribar a ser d’una regió genòmica, tots els promotors o inclús tot el genoma.
Elevat cost, a més, cal tenir en compte que la majoria d’estudis s’han de realitzar com a mínim 3 cops per poder assegurar-se que el mapa del genoma és el correcte Mida dels fragments de DNA, en la majoria de ChIPon-chip s’usen ultrasons per trencar el DNA en petits trossos i això provoca que els fragments com a mínim siguin de 200 pb, i els mapes de resolució necessiten fragments més petits.
5. Conclusió: al igual que un chip típic, aquesta tècnica s’usa per estudiar les interaccions proteïna-DNA in vivo.
El principal objectiu d’aquesta tècnica és localitzar els llocs d’unió a proteïnes que poden ajudar a la identificació d’elements funcionals en el genoma. A més, aquesta combinació és una eina molt potent per als investigadors d’epigenètica, a mesura que es rebel·lin més estudis sobre la fluïdesa de les modificacions postgenètiques en resposta als canvis en els estímuls externs i el tipus de cèl·lules, la utilitat de ChIP-on-chip incrementarà.
Proteïna-DNA  fragmentes  afegeixes antiucòs  precipites  treus anticòs i proteïna  et quedes només amb les zones de DNA que analitzes usant el segon chip (micro-array de DNA), el qual conté oligonucleòtids representatius de tot el genoma, el DNA precipitat s’unirà al seu complementari en cas que el trobi i sabrem en quina zona del genoma se’ns està unint la proteïna d’interès.
De vegades la tècnica es fa a l’inrevés, vols saber quina proteïna s’uneix a una determinada seqüència de DNA, en comptes de quedar-te amb el fragment de DNA et quedes amb la proteïna (que no saps quina és) i la sotmets a un espectròmetre de masses.
Seminari 5. ELISA (Enzyme-Linked Inmunosobent Assay) 1. Fonament: Es tracta d’una tècnica colorimètrica que ens permet detectar la presència d’anticossos (que s’han produït en un passat) i/o antígens (que es troben presents en la nostra mostra). Es tracta d’una prova serològica per saber si s’ha produït la infecció. Pot fer-se servir com a prova qualitativa (presència i absència de color) o quantitativa (espectrofotòmetre) En què es basa? En la interacció antigen-anticòs, en una coloració visible degut a que l’antigen (en el cas que estudiem la presència d’un anticòs) portarà unit un enzim que en presència del seu substrat emetrà color, el qual serà detectat per espectrofotometria.
2. Tipus:  De sandvitx: detecció de la presència/absència de l’antigen, ja que l’anticòs de captura va afegit en tots els pous  Marcatge de l’anticòs: tenim un antigen que és detectat per l’anticòs d’interès, al qual se li unirà un anticòs secundari que portarà unit un enzim..
 Assaig múltiple: estudi de diferents antígens simultàniament En aquesta imatge es poden observar molt bé els tipus d’assaig.
En la primera fila trobem els assaigs de detecció d’anticossos i en la segona els de detecció d’antígens. Es pot produir una amplificació de la senyal pel complex avidin-biotin (últim de la primera fila).
Un assaig competitiu és aquell en el que tenim l’antigen marcat.
Complex avidina-biotina: l’anticòs està conjugat amb biotina, la qual presenta molta afinitat per la streptavidina, això pot ser conjugat amb un enzim reporter com ara la fosfatasa alcalina, el qual produirà un canvi de color al reaccionar amb el substrat i produir el producte i aquest color serà amplificat pel complex avidina-biotina (AB).
A banda d’enzims com a marcadors, també es poden usar marcadors fluorescents (l’anticòs secundari estarà conjugat amb un fluorocrom).
3. Protocol i equipament: a. Equipament: i. Placa multitulada: amb una gran quantitat de pouets, on cadascun tindrà la funció de petits tubs d’assaig (acostumen a ser de poliestirè: te gran afinitat per proteïnes). Poden ser transparents (per mesurar absorbàncies, no caldrà extreure res per mesurar) o negres pels assaigs amb fluorescència.
ii. Pipetes multicanal: per carregar les plaques multititulades, optimitzen el temps.
b. Protocol: i. Incubació de la sang: a 37ºC durant 16-24 hores per a que el procés funcioni correctament, els tubs seran estables durant un període de 3 dies, després s’hauran de centrifugar durant 15 minuts.
ii. ELISA: es repeteix el procediment carregar cada pou  retirar líquid dels pous  rentat dels pous  50-100 µL mostra  cobrim la placa i deixem incubar en agitació durant 2h  retirem el líquid  rentem la placa 4 cops amb tampó i retirem l’excés d’aquest.
 100 µL anticòs primari  incubació 1 h  retirem el líquid  rentem 4 cops  Afegim anticòs secundari conjugat amb peroxidasa  incubació 1 h  retirem el líquid  rentem 4 cops  Afegim substrat cromogènic  donarà coloració als pouets  incubem a les fosques (ja que la llum pot interferir) fins la zona lineal, per tal d’evitar la saturació, la qual es produirà quan tots els pouets siguin del mateix color  100 µL substància STOP  pouets pasaran de color blau a groc  tindrem 30 minuts per mesurar l’absorbànciaa 450 nm.
4. Interpretació de resultats: les dues columnes verdes corresponen a la recta patró, en aquest cas es tracta d’un anticòs competitiu, ja que l’absorbància disminueix quan augmenta la concentració (en cas que passés el contrari, es tractaria d’un anticòs no competitiu). A partir de cada mostra obtindrem 1 determinat valor d’absorbància que extrapolarem sempre que es trobi dins de la línia de tendència, sinó caldrà diluir o concentrar la mostra.
5. Avantatges i inconvenients: és una tècnica que pot detectar substàncies en l’ordre dels nanograms i picograms per mililitre, però es tracta d’una tècnica cara a menys que haguem de fer molts anàlisis i l’amortitzem.
Seminari 6. Multiplez Bead Array Assays (Luminex) 1. Fonament i protocol: anàlisi de molts antígens a la vegada (mitjançant la tècnica del sandvitx explicada anteriorment en la tècnica ELISA).
1- Les plaques venen integrades amb unes boles que tenen en la seva superfície anticossos de càrrega. Es poden posar fins a 100 boletes diferents (però s’acostumen a posar entre 20 i 30) 2- Afegim la nostra mostra, on l’antigen d’interès s’unirà als anticossos de captura 3- Afegim anticòs de detecció conjugat amb biotina 4- Afegim l’enzim reporter 5- Ens quedem únicament amb les boles i aquestes passaran per dos tipus de làsers, el vermell detectarà les boletes tenyides (és a dir, quin tipus de proteïna se’ns ha unit) i el verd detectarà l’anticòs secundari (la concentració de proteïna) 2. Multiplex assay beads a. Boles no magnètiques: més petites que les magnètiques (5,6 mu), treballen al buit per a que no s’escapin. No són compatibles amb instruments que usen imants per prendre fotografies. Per a la separació s’usen membranes que deixen passar la solució però no les boles.
b. Boles magnètiques: inclouen una capa de magnetita que les fa més grans (6,5 mu), el rentat es fa de la següent forma: apliques magnetisme (usant un imant) sota els pouets, les boles magnètiques quedaran retingudes i s’eliminarà el que no ens interessa per aspiració, la magnetita permet rentats automatitzats. Són les que són compatibles amb tots els instruments de Luminez.
Ús d’esferes en assaigs xMAP: en la seva majoria, s’usen esferes COOH magnètiques, les quals aporten fluorescència i propietats magnètiques. Cada una de les boletes emet una fluorescència diferent segons l’anticòs conjugat. Les avantatges d’assaigs amb esferes magnètiques són les ja esmentades (facilitat de separació i possible automatització) i que permeten una detecció sensible dels objectes a analitzar.
3. Assaig de qualitat: es tracta d’experiments que estableixen les característiques del rendiment de l’assaig (exactitud, precisió, especificitat i sensibilitat) 4. Equipament a. Microesferes de poliestirè b. Instrument basat en la citometria de flux: que ens permet mesurar la concentració d’anticòs i determinar quina proteïna és. Hi ha 1 làser per detectar cadascun d’aquests paràmetres, un que detecta la concentració de proteïna i un altre que detecta la bola.
c. Software IS 5. Avantatges i desavantatges Al ser una tècnica relativament nova, el protocol és difícil de trobar. Les possibles interaccions entre anticossos i antígens de la mateixa solució pot ser deguda a que cada població de boletes té una intensitat de fluorescència diferent.
6. Comparació amb ELISA S’obtenen resultats menys contundents que en ELISA, però també s’ha de tenir en compte l’estalvi de mostra ja que Luminex és una tècnica múltiplex. Degut al nombre d’analits que es poden analitzar simultàniament en Luminex, aquesta tècnica requereix volums de mostra molt menors que ELISA.
Seminari 7. Difference in Gel Electroforesi (DIGE) 1. Electroforesi bidimensional: es duu a terme des de 1975 en el camp de la proteòmica (per veure totes les proteïnes que hi ha en una mostra), es tracta de la unió de dues tècniques de separació unides: un isoelectronfoc i una electroforesi en SDS-page, ambdues en gels de poliacrilamida. De forma que consisteix en una separació en funció del punt isoelèctric i la massa. El problema està en la reproductibilitat dels gels, és la base de la tècnica DIGE a. Gel poliacrilamida: és un gel sintètic, termoestable, transparent i inert, a part és resistent a gradients d’alt voltatge. Un avantatge d’aquest gels és que es pot regular la mida dels porus depenent de la concentració de poliacrilamida (%T) i de reticulador (%C) b. Isoelectronfoc: electroforesi que separa proteïnes segons el seu punt isoelèctric mitjançant l’aplicació d’un gradient de pH al qual se li aplica un potencial elèctric major a 1000 V. Com es crea el gradient de pH? Injectant poliamfòlits, que són molècules petits amb grups àcids o bàsics)en el gel. Després s’aplica un voltatge per a que els amfòlits es separin en funció del seu pH i després es duu a terme el isoelectronfoc, això pot portar un desavantatge, i és que aquests amfòlits poden no quedar fixats en el gel. Per evitar aquest problema, podem comprar el gel amb el pH ja fixat, com està fixat? Els grups àcids i bàsics venen units covalentment en el propi gel. El procés del isoelectronfoc consisteix en injectar la mostra amb proteïnes que volem separar en el gel i aplicar un camp elèctric, el qual permetrà la separació de les proteïnes que formen part de la mostra segons el seu punt isoelèctric, per últim apliquem una tinció per veure com estan distribuïdes les proteïnes al llarg del gel.
Com es mouran les proteïnes? - - - Si el pH > pI: les proteïnes es trobaran carregades negativament i es mouran cap a l’ànode Si el pH < pI: les proteïnes es trobaran carregades positivament i es mouran cap al càtode Si el pH = pI: les proteïnes no tindran càrrega neta, de forma que quedaran quietes.
c. SDS-Page: electroforesi en la que s’afegeix un detergent (SDS) i separa proteïnes en funció de la seva massa. El SDS desnaturalitza les proteïnes i els hi confereix a totes una càrrega negativa unint-se una molècula de SDS cada dos residus, de forma que totes les proteïnes tindran la mateixa relació massa/càrrega i es separaran únicament en funció de la massa. Per carregar el gel, usarem el producte que obtenim del gel de isoelectronfoc, com? Com podem veure en la imatge de la dreta, s’agafa el resultat del isoelectronfoc (proteïnes separades per el seu punt isoelèctric) i es carrega en el gel de poliacrilamida del SDS-Page per separar les proteïnes en funció de la massa, el resultat que observem són uns punts anomenats spots que corresponen a les diferents proteïnes separades.
2. Marcatge: poden haver dos tipus d’electroforesi diferencial en funció del tipus de mostra del que partim.
a. Partim d’una mostra abundant: podem obtenir mostra de forma il·limitada a partir d’una línia cel·lular, en aquest cas s’usarà un marcatge DIGEmin, on el colorant s’unirà únicament al 5% dels residus de lisina.
b. Partim d’una mostra escassa: es durà a terme el marcatge DIGEsat, on el colorant s’unirà a tots els residus de cisteïna i s’obtindrà una senyal més sensible en el posterior anàlisis de resultats que en DIGEmin.
3. 2D-DIGE: el procediment a realitzar en una DIGE difereix en el d’una electroforesi normal que s’usen tres mostres diferents en cada gel, això és degut a que es pot tractar cada mostra amb diferents colorants per diferenciar cada mostra al final de l’electroforesi. Aquests colorant s’anomenen CyDye perquè tenen cianina i quan se’ls irradia certa radiació d’una determina longitud d’ona emeten un llum fluorescent que pot ser groc, verd o vermell, que ofereix major sensibilitat que altres marcadors Procediment general de DIGE: preparació de les tres mostres amb cadascun dels colorants: es fa una comparació de dues mostres, de forma que cadascuna es marca amb una fluorescència diferent, la tercera mostra és una mescla estàndard de les altres dues que serveix com a control (s’usa el colorant Cy3 generalment per marcar el control), això permetrà dur a terme comparacions entre els resultats dels diferents gels ja que cadascun tindrà diferents mostres però el mateix control  mescla de les 2 mostres i el control  mateix procediment que en una electroforesi: isoelectronfoc i SDS-Page 4. Anàlisi de resultats: s’irradia el gel amb cada longitud d’ona corresponent a cada colorant, s’observa la fluorescència mitjançant el software especialitzat que analitza les taques corresponents a cada porció de proteïna (spots) i es pot quantificar la quantitat de proteïna en funció de la intensitat de fluorescència emesa. Això permet fer anàlisis semi-quantitatius entre mostres ja que es poden fer comparacions. En general, aquesta tècnica s’usa per comparar la quantitat de proteïna de diferent origen (en diferents teixits d’un mateix organisme, per exemple).
A més, si es requereix identificar la proteïna de cada spot del gel es retalla la porció del gel on es troba aquesta, es digereix amb tripsina i s’introdueix en un espectrofotòmetre de masses (s’acostuma a usar MALDI-TOF amb un software associat que té una base de dades que conté tota la informació de les proteïnes en funció de la seva relació massa/càrrega i permet la seva identificació).
5. Avantatges i conclusions: facilita la comparació entre proteomes mitjanant l’estalvi en recursos (temps i gels), el patró intern (mescla de les dues mostres) permet la normalització dels resultats. Un dels usos que se li pot donar és la detecció de modificacions post-translacionals (ubiquitinació, metilació). Un dels inconvenients és que en una mostra hi ha proteïnes que estan molt concentrades, i pot ser que ens interessin les que estan en baixa concentració, de forma que hauríem de fer un pre-tractament.
Seminari 8. PCR 1. Introducció: la PCR és la reacció en cadena de la polimerasa, consisteix en una tècnica d’amplificació de seqüències de DNA in vitro.
2. PCR Requereix una preparació prèvia de la mostra per obtenir el DNA amb una elevada puresa i qualitat. Avui en dia, hi ha instruments que fan que aquesta fase sigui automatitzada com és el cas dels Eppendorf epMotion que contenen plaques de fins 360 pous per realitzar la purificació de diverses mostres.
a. Components: DNA motlle, encebadors específics que delimitin la zona d’amplificació, DNA polimerasa termoestable (Taq polimerasa és la més típica) amb el seu substrat: dNTP i el seu cofactor: Mg2+. A més, un tampó que mantingui el pH i la concentració de cations monovalents i divalents adequada per a que actuï la DNA polimerasa. De vegades en el tampó s’afegeix DMSO al 10% per a disminuir la formació d’estructures secundàries del DNA.
b. Fases i. Desnaturalització de DNA: 94-98 ºC 30 segons ii. Alineament de l’encebador amb la cadena motlle: 55-60 ºC 30 segons iii. Extensió de la cadena:72 ºC iv. Elongació final: per igualar la mida de les cadenes Tot aquest procés es duu a terme en els termociclador: instruments que augmenten i disminueixen ràpidament la temperatura de forma automatitzada, això permet que l’amplificació sigui molt exacta, precisa i homogènia.
c. Optimització: s’ha d’evitar la contaminació del DNA i és necessita una concentració de 100-500 mg de DNA i els fragments de DNA no poden ser més petits que el que volem amplificar. És molt important el bon disseny dels encebadors: percentatge G+C, que no es formin estructures secundàries, temperatures de fusió alineament adequades en cada etapa. La concentració de MgCl2 s’aconsella que sigui major que la de dNTPs. El nombre de cicles ha de ser entre 20 i 30 i la duració de cadascun dependrà del contingut G+C de la mostra. Els temps de desnaturalització, alineament i extensió han de ser els adequats per a la mostra de DNA i els primers, es poden calcular mitjançant programes informàtics. La temperatura d’alineament dels encebadors acostuma a ser 2ºC menor que la seva temperatura de Melting.
I per últim, s’ha d’evitar contaminació de DNA diana amplificat en anteriors PCR, contaminació creuada, degradació de productes, de reactius, usant material estèril passat per l’autoclau, l’absència de contaminació es comprova amb controls negatius i positius i s’aconsegueix usant materials adequats (per exemple anar amb compte amb els guants, que poden tenir pols de talc i afecta a la PCR).
d. Multiplex PCR: amplificació simultània de diverses seqüències a la vegada mitjançant l’ús de múltiples encebadors, s’afegiran additius com ara DMSO i glicerol per evitar que es formin dímers d’encebadors i per detectar cada amplicó s’usaran sondes específiques 3. Comprovació: de que s’ha amplificat el fragment d’interès. Es fa mitjançant una electroforesi, en la qual comprovem que només hi ha una banda (amplificació específica) i que aquesta correspongui a la nostra segons el seu pes comparant-la amb un marcador de pes molecular. Es pot fer ús de dos tipus de gels: a. Gel d’agarosa (tradicional): els hem de preparar al laboratori i es necessiten eines com ara una cubeta d’electroforesi, un microones, un bany d’aigua, una font d’alimentació, pipetes i puntes. El temps total (inclou preparació i electroforesi) és de 90 minuts i té un preu de 6,30 € per ús.
b. E-gel EX agarosa: el gel ja està preparat, només cal muntar-lo i usar-lo. Únicament es necessiten pipetes i puntes.
El temps total és de 15 minuts i el preu és de 13€ per ús.
Per poder observar les bandes en un gel d’electroforesi s’acostuma a usar bromur d’etidi, un component que té efectes mutàgens i que per tant, és perillós treballar amb ell. Una alternativa en aquest agent alquilant del DNA és el SYBR (invitrogen), depenent dels usos que volem donar al DNA amplificat es poden usar diferents colors: SYBR Green I (DNA de doble cadena, evita contaminacions de cadena senzilla), SYBR gold (molt específic, detecta polimorfismes estructurals) i SYPRO Orange (per a proteïnes). A més, s’ha realitzat un estudi on es compara l’eficiència de clonació usant bromur d’etidi i SYBR i els resultats han demostrat que amb l’ús de bromur d’etidi es redueix l’eficiència de clonació 30 vegades. A més, per visualitzar les bandes de BrEt havíem d’irradiar raigs UV al gel, els quals podien danyar la mostra. Una alternativa és l’ús del transil·luminador de llum blava, el qual no ens danya a nosaltres i proporciona una excitació òptima en tinció SYBR.
4. Purificació de DNA: si en el resultat de l’electroforesi apareix més d’una banda i una d’elles correspon al nostre fragment d’interès, aquesta es pot aïllar i purificar per no haver de repetir el procés des del principi. Hi ha dos mètodes principals per purificar, els dos van a continuació de retallar la zona del gel que conté la nostra banda d’interès: a. Cromatografia d’adsorció: mètode basant en l’adsorció i desadsorció a unes sals caotròpies (s’usa una membrana de sílica)i l’elució amb un tampó d’elució o aigua. El resultats és DNA pur i llest per a usar, ja que els àcids nucleics no es veuen alterats. Per acabar de purificar el DNA hi ha dos kits, un per aïllar DNA i productes de PCR i un altre per aïllar DNA lineal.
b. Enzim agarasa: degrada l’agarosa del gel 5. Aplicacions: clonatge de gens, diagnòstic, evolució molecular, quantificació de RNAm, seqüenciació, localització de RNA in situ i investigació forense entre altres.
Seminari 9. Real Time PCR (qPCR) 1. Descripció: molt similar a la PCR tradicional. La principal diferència és que amb qPCR es mesura la quantitat de producte de PCR desprès de cada ronda d’amplificació, mentre que amb la PCR tradicional es mesura la quantitat de producte únicament en la ronda final d’amplificació. En aquesta tècnica s’elimina la necessitat de comprovació mitjançant electroforesi.
2. Fonament: la PCR consta de 3 fases a. Exponencial: en cada cicle, s’acumula exactament el doble de producte (assumint una eficiència del 100%!) ja que els reactius estan frescs. Aquesta és la fase en que és centra la qPCR perquè ens dona dades de quantificació més precises que les posteriors.
D’aquesta fase s’extrauen dos valors: i. Threshold Line: valor límit del nivell de detecció en el qual la reacció arriba a un valor d’intesitat de fluorescència significatiu, a partir del qual hem superat el soroll de fons.
ii. Valor Ct: cicle Umbral, marca el cicle en el qual s’arriba en aquest límit.
b. Lineal: parts dels reactius s’han consumit, de forma que comença a disminuir la velocitat de reacció i no s’acumula el doble de producte en cada cicle, s’acumula menys.
c. Plateau: la reacció s’atura, ja que els reactius s’han esgotat. Aquí és on mesura la PCR tradicional.
3. Procediment: s’usen els mateixos components que en la PCR tradicional i a més s’usen marcadors fluorescents. La PCR es durà a terme en un termociclador capaç d’incidir sobre la mostra amb un feix de llum d’una longitud d’ona determinada per excitar el fluorocrom i després poden detectar la quantitat de fluorescència emesa. Hi ha dos tipus de sondes: a. Específiques: un exemple serien les sondes TaqMan (s’expliquen en un altre seminari) b. Inespecífiques: s’uneix al producte generat, un exemple és SYBR Green, que s’uneix a qualsevol DNA de doble cadena.
4. Quantificació: s’usen etiquetes fluorescents de forma directa o indirecta a través de sondes d’hibridació que s’uniran a les molècules de DNA que es van acumulant. Els instruments de qPCR van mesurant la senyal de fluorescència, la qual és directament proporcional a la concentració de DNA.
a. Absoluta: permet determinar el nombre exacte de molècules de DNA en una mostra. Es requereix una mostra amb una quantitat exacte com estàndard absolut extern. Ens dona el nombre de còpies fix d’una seqüència estàndard usant una corba de calibratge, aquesta ha de ser validada amb absoluta exactitud perquè d’ella dependrà el nostre resultat final. L’estàndard conegut i la mostra desconeguda han de ser molt similars, sinó obtindríem resultats erronis.
Ens permet treballar en un interval de concentracions molt ampli.
b. Relativa: s’obté la magnitud dels canvis en els nivells d’expressió d’un gen en estudi en comparació amb altres gens de referència que serviran per estandarditzar els resultats. S’estudia l’expressió d’un gen en comparació amb gens housekeeping. Aquests gens de referència han d’estar an la mateixa mostra per normalitzar les possibles variacions de mostra a mostra. La limitació és que pot haver una diferència en l’expressió d’aquests gens housekeeping, de forma que s’usen diversos gens de referència. Els resultats s’expressen com diferències de valors Ct (imatge del costat).
5. Resultats: en l’eix de les x es representa el nombre de cicles i en l’eix de les y es representa, en el gràfic de l’esquerra el Rn (senyal de fluorescència) i en el gràfic de la dreta el ΔRn (Rn-soroll de fons).
També es pot fer un anàlisi de la corba de Temperatura de Melting, el qual ens permet identificar SNPs, ja que la Tm és específica de cada fragment.
Podrem saber si la mostra prové d’un organisme homozigot per el SNP, homozigot sense el SNP o heterozigot.
6. Aplicacions a. Anàlisi de l’expressió de gens: és la principal aplicació. Es mesura la quantitat de fluorescència d’una mostra de cDNA. RNAm – retrotranscripció  cDNA b. Anàlisi de microRNA i RNA no codificant: mitjançant la regulació positiva o negativa de l’expressió del RNAm d’interès. Sabem quin RNAm regula el fragment que analitzem si veiem que al aplicar els miRNA o RNAi s’obtenen resultats que no esperàvem.
c. Genotipat de SNPs: s’usa una sonda específica per cada al·lel i segons la fluorescència emesa sabrem si es tracta d’un SNP homozigot o heterozigot.
d. Quantificació vírica e. Anàlisi de la variació del nombre de còpies (CNV) f. Detecció de patògens 7. Àrees d’investigació: investigació de cèl·lules mare, estudis en malalties genètiques i oncologia, detecció de patògens, investigació de malalties infeccioses, anàlisis farmacèutics i farmacogenòmica entre altres.
8. Avantatges i desavantatges: Estalvi de temps: amplificació i detecció de DNA simultània No requereix electroforesi: es disminueix el risc de contaminació, no s’han d’interpretar bandes en el gel sinó que obtenim resultats numèrics i més segur perquè no fem ús de bromur d’etidi Alta sensibilitat i especificitat: rang ampli de detecció Quantificació del DNA Els components òptics per a la detecció de fluorescència són cars (300.000 €) El disseny de sondes és molt més difícil, degut que és un mètode molt sensible el disseny ha de ser molt precís per obtenir bons resultats Solapament d’espectres d’emissió quan treballem en l’amplificació de diferents seqüències.
9. Comparació amb PCR tradicional Mesura quantitat amplicó Quantificació Processament posterior Resolució Rang de detecció qPCR Després de cada cicle (diversos cops) Sí No Elevada Elevada PCR tradicional En el producte final (un sol cop) Semi-quantitativa Sí (electroforesi) Baixa Baixa 10. Conclusions: amb un bon disseny experimental, la qPCR és un dels mètodes més sensibles, eficients i ràpids per mesurar l’expressió de gens.
Seminari 10. Detecció de SNPs mitjançant sondes TaQman 1. Introducció SNPs: un SNP és una variació den la seqüència de DNA que afecta a una sola base d’una seqüència del genoma i afecta al 1% de la població. Conforma el 90% de variacions genòmiques humanes i dins del genoma es troba 1 cop cada 1.300 bases, dos de cada tres SNPs és una substitució d’una citosina per una timina.
SNP i estudi d’associació a malalties: - Mètode indirecte: anàlisi de lligament  ha d’haver dues generacions de la família afectades, es fa un genotip del SNP i es mira si els marcadors són heretats amb la malaltia.
Mètode directe: estudis d’associació genètica a nivell de població  s’identifica un gen candidat i els SNPs que influeixen en la seva funció, es fa un examen i comparació de resultats, es a dir, una comparació fenotip-genotip Tècniques per a la detecció de SNPs: SNP-RFLP, seqüenciació, sondes específiques (Sondes TaQman), espectrometria de masses MALDI-TOF, electroforesi capil·lar i cromatografia líquida 2. Reactius: a. Mostra amb genotip desconegut b. DNA polimerasa termoestable: Taq polimerasa c. Encebadors Rev i Fw específics per a les seqüències flanquejants del SNP d. Sondes TaQman que són específiques als diferents al·lels S’ha de fer un control negatiu (on no hi ha DNA i per tant no es produeix amplificació) i és opcional fer un control positiu (ja se sap el resultat que donarà) i rèpliques. És necessari un termociclador amb lector de fluorescència (les sondes TaQman s’acostuma a usar en PCR a temps real, no obstant, degu t ala discriminació al·lèlica, no és necessari) 3. Sonda TaQman: petit fragment de DNA complementari al centre de l’amplicó, on es troba el SNP que s’estudia. En l’extrem 5’ trobem la molècula Reporter (R), aquesta emet fluorescència. I en l’extrem 3’ trobem la molècula Quencher (Q) la qual actua d’apantallador, absorbent la fluorescència emesa per la molècula R.
4. Mecanisme; a. Desnaturalització del DNA b. Hibridació sonda TaQman-DNA  fluorescència inicial: la del Quencher (es a dir, cap) c. Hibridació encebadors Rev i Fw d. Inici de l’amplificació e. La Taq polimerasa, quan arriba al centre de l’amplicó, es troba la sonda i la hidrolitza (activitat 5’ exonucleasa), és en aquest moment en el que obtenim la fluorescència final: la del Reporter, això passa perquè al hidrolitzar-se el Quencher i el Reporter es separen i per tant, el Quencer no pot apantallar al reporter. La polimerasa hidrolitza la sonda per continuar la seva funció de polimerització 5. Resultats: podem saber si un SNP és homozigòtic o heterozigòtic segons el nombre de tipus de fluorescències emeses, els SNPs acostumen a tenir 2 únics al·lels, de forma que un SNP homozigot presentarà un tipus de fluorescència i un d’heterozigot en presentarà dos. En el cas dels SNPs, cada sonda té un Reporter diferent Una bona forma de visualitzar els resultats és mitjançant un DOT-PLOT, s’observen diferents colors segons els resultats.
6. Avantatges i inconvenients: es poden analitzar 1.500 mostres en 2 h, és una tècnica que s’usa quan volem detectar pocs SNPs en moltes mostres, ja que és quan ens surt rentable. Per analitzar, per exemple, menys de 20 mostres, el preu per mostra és de 18€ cap amunt.
Anàlisi de pocs SNPs simultanis (1-2) degut al termociclador, que sol són capaços de mesurar 4 fluorescències Detecció de les variants d’un SNP en Ha d’haver una distància mínima per a la concret detecció de diversos SNPs al mateix temps Anàlisi de moltes mostres a la vegada Per a que sigui rentable, és necessari fer Resultats reproduïbles anàlisis d’un gran nombre de mostres, ja que el kit comercial únicament serveix per a un SNP concret 7. Conclusions: mètode ràpid i eficaç per l’estudi de SNPs, assaig molt específic amb una rendibilitat dependent del nombre de mostres.
Temps: tècnica ràpida i senzilla Seminari 11. Seqüenciació Sanger per electroforesi capil·lar 1. Fonament teòric: es basa en la interrupció controlada de la síntesi d’una cadena complementària durant una replicació in vitro mitjançant didesoxinucleòtids, anàlegs estructuralment dels desoxinucleòtids, que provoquen la detenció de la reacció de síntesi de DNA. Com provoquen aquesta detenció? Els didesoxinucleòtids en l’extrem 3’, en comptes de tenir un OH, tenen un H. Sabent que la DNA polimerasa necessita un extrem 3’ OH i un 5’ P per dur a terme la replicació, aquesta acabarà quan no trobi el OH en l’extrem 3’ degut a la incapacitat de l’enzim.
La mescla de reacció per a la PCR conté molècules de cadena simple de DNA que es desitja seqüenciar, un encebador (de seqüència coneguda), l’enzim DNA polimerasa, els quatre desoxinucleòtids (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) i els didesoxinucleòtids. La concentració de didesoxinucleòtids en la mescla és molt menor que la de desoxinucleòtids per evitar competència entre els dos tipus de nucleòtids i per donar pas a l’aleatorietat, es a dir, a la incorporació a l’atzar els nucleòtids que faran que s’acabi la reacció d’elongació. El producte que obtindrem d’aquesta PCR seran nombrosos fragments de DNA que es diferencien en la mida per únicament un nucleòtid.
2. Seqüenciació manual: Primer es separa el DNA de doble cadena en 2 cadenes simples i una d’elles farà de motlle per a la seqüenciació. Es fan 4 reaccions, cadascuna amb un ddNTP diferent i es fa una electroforesi en gel d’agarosa de cadascuna de les 4 reaccions. Com ja sabem, els fragments més llargs tardaran més en desplaçar-se i els més curts trigaran menys. De forma que comencem a llegir la seqüència a partir del fragment més curt, que serà el que està en l’extrem 5’, fins al més llarg, que és el que trobarem en 3’. Cal tenir en compte que la cadena que llegim és la complementària a la que estem seqüenciant. Com visualitzarem les bandes? Els didesoxinucleòtids estan marcats radioactivament, podrem observar les bandes en una autoradiografia del gel d’electroforesi.
3. Seqüenciació automàtica: es tracta de l’automatització de la manual, ja que sense aquests canvis seria gairebé impossible la seqüenciació d’un genoma gran. Què inclou aquesta nova tècnica? a. Quatre tints de colors fluorescents que substitueixen el marcador radioactiu: la lligació d’aquests tints als ddNTPs produeix una fluorescència que marca directament la molècula de DNA determinada, de forma que únicament es necessitarà 1 reacció enriquida amb els 4 ddNTPs.
b. En comptes de parar l’electroforesi en un moment determinat, els productes són escanejats amb fluorescència induïda per làser just abans de que es desplacin cap al final del gel d’electroforesi: la seqüència és recollida com un conjunt de quatre “arxius de rastreig” que indiquen la intesistat dels quatre color.
c. Millores en la química de purificació de motlles i l’ús de polimerases termostables ha estès el rang d’una seqüència d’alta qualitat: actualment són possibles lectures de 1.200 bp, tot i que el rang més comú és 500-900 bp.
Electroforesi capil·lar: tècnica que permet la separació i quantificació d’una amplia gamma d’analits. La separació es porta a terme en un tub de diàmetre molt petit (d’aquí el nom de capil·lar). Dins del capil·lar de separació es troba la dissolució que conté les molècules a separar i el tampó o medi electrolític que és encarregat de conduir el corrent. La separació es duu a terme segons la relació massa/càrrega de les distintes molècules, per a que això sigui possible és necessari aplicar una diferència de potencial entre els dos extrems del capil·lar, el que farà que les molècules es moguin cap a un extrem o un altre del capil·lar.
Dins del capil·lar existeix el fenomen anomenat flux electrosòtic que és degut a que la superfície interna del capil·lar està carregada, aquest flux és el mateix dins de tot el capil·lar i afecta per igual a totes les molècules arrastrant-les cap a un dels extrems. Per controlar aquest efecte, es requereix l’ús de polímers que recobreixen el capil·lar, actualment s’usen els POP Polymers de Thermofisher, els quals separen fragments de DNA de mida i resolució desitjats depenent del genoma que es vol seqüenciar.
Procediment: es col·loca l’adaptador de placa i la placa en aquest i es sella, després afegim la base i la coberta. Un cop montades les plaques, s’insereixen dins de la maquinària i l’encenem.
Primer carreguem els polímers del capil·lar i desprès fem passar la nostra mostra i fem electroforesi. El detector cromàtic ens donarà una resposta de cada molècula i aquesta serà analitzada en el ordenador, obtenint així el cromatograma 4. Equipament necessari: existeixen diversos tipus d’analitzadors que presenten una gran varietat de modificacions i preus per ser accessibles a qualsevol tipus d’organització o personal. El nombre de capil·lars pot oscil·lar des d’un únic capil·lar fins un màxim de 48. També pot variar el nombre de plaques que es poden inserir dins de la màquina: des d’una placa de 96 pous fins 16 plaques. També és important el nivell d’automatització de la màquina.
a. ABI Prism 3730 DNA Genetic Analizer: usa plaques de 96 pous que carreguen les mostres de forma automàtica. Conté 48 capil·lars, de forma que pot analitzar la meitat d’una placa a la vegada. Pot arribar a seqüenciar fins a 1,5·106 bases al dia.
5. Lectura de resultats: el resultat que ens dóna l’ordinador és un electroferograma, es tracta d’un fitxer binari.
Aquest fitxer consta d’una representació de pics, on cadascun d’ells correspon a un nucleòtid, sabem a quin nucleòtid corresponen pel color del pic. Alguns seqüenciadors automàtics ens donen la seqüència de nucleòtids i la qualitat de cadascun d’aquests.
a. Base-calling: pas de la informació que ens dóna l’electroferograma a una seqüència de nucleòtids. La seqüència proposada pel software del seqüenciador automàtic conté molts errors, per aquest motiu fa falta una posterior revisió manual, de forma que, el base-calling és un procediment dut a terme per programes però que ha de ser revisat manualment. Un dels algoritmes que fa el software, en concret l’últim, és l’assignació d’un valor de probabilitat d’error a cada pic, aquest valor fa referència a la probabilitat de que els nucleòtids assignats siguin erronis, és un paràmetre de qualitat. L’escala normalitzada de qualitat és l’escala phred, a partir d’un valor de 20 es considera que una base és d’alta confiança.
Què ens podem trobar durant la revisió manual? En la figura de la següent pàgina podem veure el següent (la seqüència de baix és la que ens proposa l’ordenador i la de dalt la que hem corregit nosaltres): en la primera fila, es pot observar que durant les primeres 50 bases la lectura és sorollosa, això és degut a la migració anòmala de fragments curts de DNA que contenen colorants voluminosos en els seus extrems. En la segona fila es pot veure com, conforme l’assaig avança s’amplifiquen els efectes de la difusió i la diferència de massa relativa entre fragments successius disminueix. I en la tercera figura es veu una alineació de seqüències de dues mostres, es poden rebel·lar polimorfismes d’un sol nucleòtid (SNPs) o polimorfismes indel (inserció-deleció).
En l’altre figura, podem veure dos exemples de cromatogrames que presenten errors. En el primer, trobem que en cada posició trobem dos pics, això pot ser degut a que s’han seqüenciat dues mostres. Una possible solució seria elaborar un primer més específic per la seqüència que realment ens interessa. En la segona, podem veure que en la primera meitat del cromatograma els pics són molt més intensos que en la segona, un motiu d’això podria ser la formació d’estructures secundàries en la cadena motlle, on la DNA polimerasa té dificultats per accedir. Una possible solució seria dissenyar un primer que sigui complementari a la meitat de la zona on es forma l’estructura secundària, impedint que aquesta es formi.
b. Alineament: la principal limitació de Sanger es que podem seqüenciar fragments de fins a 800 bp aproximadament. Si volem seqüenciar fragments més llargs, aquests s’hauran de tractar prèviament amb enzims de restricció en condicions sub-òptimes per poder obtenir fragments que es solapen entre ells.
Un dels programes més usats per a l’alineament és el phrap, aquest, a partir de fragments acoblats forma una consens (tenint en compte la qualitat de cada base).
6. Avantatges i inconvenients Seminari 12. Detecció de SNPs mitjançant SNaPshot 1. Fonaments: tècnica usada per detectar SNPs mitjançant l’extensió de primers i l’ús d’altres tècniques auxiliars. L’avantatge respecte les sondes TaqMan és que es poden detectar una gran quantitat de SNPs simultàniament. Com major sigui el nombre de capil·lars, més SNPs es podran detectar simultàniament.
2. Protocol: a. Identificació del SNP i de la seqüència que el flanqueja: mitjançant bases de dades si tenim dades prèvies o mitjançant un experiment de seqüenciació en el cas que no en tinguem.
b. Amplificació del fragment de DNA que conté el SNP: mitjançant una PCR. Purifiquem la mostra desprès de la PCR amb la tècnica Exo-Sap (exonucleasa i fosfatasa alcalina de camaró) c. Disseny del primer per a la miniseqüènciació per extensió del primer: complementari a una de les dues cadenes i l’extrem 3’ d’aquest finalitza just abans del nucleòtid polimòrfic d. Miniseqüenciació: amb el primer que hem dissenyat, ddNTPs, polimersasa i tampó. Es tracta d’una reacció d’extensió del primer en un únic nucleòtid, ja que els ddNTPs fan que la reacció finalitzi.
e. Detecció per fluorescència: mitjançant electroforesi capil·lar es fa un anàlisi del fragment. Es pot fer un anàlisi de diversos SNPs en una sola reacció, ja que cada primer de la miniseqüenciació tindrà diferent mida (la mida s’ajusta afegint cues de poliadenina), a més, cada ddNTP estarà marcat amb una fluorescència diferent.
3. Equipament: kit ABI Prism SNaPshot múltiplex, GeneScan 120 LIZ size Standard i Exo/Sap per rentats 4. Avantatges i inconvenients Tècnica molt eficaç Interferències provocades per un mal rentat Ràpida desprès de la PCR Simple Possibilitat de senyal baixa La metodologia multiplexing permet Falsos positius l’anàlisi de gran quantitat de SNPs de Fallo per mal disseny de primers forma simultània SNPs molt propers Seminari 13. Next Generation Sequencing (NGS). Plataforma Ion Torrent 1. NGS (Next Generations Sequencing): són tecnologies de seqüenciació massiva en paral·lel, es basen en milions de reaccions de seqüenciació de petits fragments simultànies, on cadascuna d’aquestes reaccions es troba separada espacialment. Es tracta de mètodes d’alt rendiment de seqüenciació que permeten seqüenciar DNA o RNA de forma ràpida, econòmica i eficient. La seqüenciació es fa a mesura que es va sintetitzant una nova cadena a partir de la motlle (SBS: Sequencing by synthesis). Exemples de NGS són els següents, es diferencien en el tipus d’estratègia: a. illumina: generació de clústers  amplificació per ponts  flow cells  seqüenciació o imatge  MiSeq  bases marcades amb fluorescència b. Roche: amplificació llibreria  emPCR (beads) + enzim PicoTiter Plate  seqüenciació o imatge  GS20sequencer  entrada d’una base provoca l’alliberació d’un pirofosfat, que donarà una molècula d’ATP, aquesta molècula serà utilitzada per l’enzim per produir llum de forma proporcional a la quantitat de pirofosfat eliminat c. Ion Torrent: amplificació llibreria  emPCR (microbeads)  chips  seqüenciació i imatge  Ion torrent PGM (entre altres)  canvi pH 2. Conceptes bàsics Ion Torrent: el seu fonament es basa en mesurar el canvi de pH que provoquen els protons alliberats durant la polimerització del DNA per saber quina base s’ha afegit a la seqüència i així construir-la. Va sortir al mercat el 2010 per Live Technologies però actualment és a les mans de Thermo Fisher.
3. Workflow En la preparació del template els dos equipaments són necessaris  el primer serveix per enriquir la mostra i el segon per la preparació pròpiament dita. En tots els altres apartats, sol s’usa un dels equipaments.
 a. Procediment: i.
Construcció d’una llibreria genòmica: 2 mètodes amb diferents finalitats. L’objectiu d’aquesta construcció és generar fragments flanquejats per adaptadors de IonTorrent Mètode de fragmentació o shotgun: es parteix una mostra de DNA. Té aplicacions en l’estudi de tot el genoma, en la predicció i anotació de gens, identificació i classificació taxonòmica dels microorganismes presents i la comparació de múltiples mostres. Per l’anàlisi de múltiples mostres el nostre amplicó haurà d’estar marcat amb un codi de barres que identifiqui de quina mostra procedeix la seqüència, el que s’anomena “multiplexació”. Aquest mètode no implica una PCR per obtenir els amplicons desitjats, sinó que es trien els amplicons segons la seva mida. Això és possible gràcies a diferents mètodes d’electroforesi capil·lar. El millor mètode actualment és el “EGel Size Select”, que permet recuperar els fragments de la mida que ens interessa (aproximadament 200 pb) en tan sols 15 minuts.
Fragmentació shotgun d’una mostra de DNA curta (virus, bacteris) que es tractarà amb enzims de restricció  lligació dels adaptadors i primers en tots els fragments  els fragments es separen per mida  amplificació  quantificació  Mètode de la llibreria d’amplicons: parteix dels productes de PCR, de forma que no caldrà fragmentar el genoma.
El mètode es basa en que ja sabem la seqüència que ens interessa estudiar, i es dissenyem primeres específics de PCR per aquella seqüència. És el millor mètode per a la seqüenciació dirigida: per a la identificació de mutacions germinals, somàtiques, anàlisi de l’exoma, etc. També podem saber si un microorganisme està presenta a la nostra mostra si s’ha amplificat la regió marcada de la PCR, els gens que s’utilitzen més per aquest mètode són els de ARNr 16S, que presenten regions altament conservades entre microorganismes.
PCR de la mostra, on els primers en el seu extrem 5’ tindran l’adaptador  neteja  quantificació Un fragment bo seria aquest, la nostra seqüència d’interès flanquejada amb l’adaptador en l’extrem 5’ i el codi de barres i el primer en l’extrem 3.
ii. Preparació del motlle amb PCR d’emulsió: per una bona seqüenciació és necessari tenir múltiples cadenes simples de DNA. Per a fer-ho, s’usa aquesta PCR, amb un mètode molt similar al que fa la tècnica de seqüenciació Roche. Aquest tipus de PCR la fot fer un equip Ion Chef System, però l’equip One Touch està dissenyat especialment per aquesta PCR, aquest equip crea una emulsió, on a cada bombolla hi hauria d’haver una sola bola i un sol fragment de la llibreria perquè la reacció tingui el màxim èxit possible.
1. Desnaturalització del fragment de la llibreria 2. Anellament d’una de les cadenes (en aquest cas la reverse) al lloc de l’adaptador de la bola per complementarietat 3. Extensió adaptador de la bola: la polimerasa crea la cadena forward usant com a primer l’adaptador de la bola.
4. Desnaturalització: es separa la cadena reverse original de la bola, la cadena forward no ho fa, ja que és la continuació de l’adaptador de la bola i està unit per un enllaç fosfodièster en aquesta.
5. Anellament: es torna a unir la cadena reverse per complementarietat al lloc de l’adaptador de la bola, i un primer s’enllaça a la cadena forward 6. Extensió de les dues cadenes en diferents direccions: la cadena reverse en direcció adaptador cap a la zona del primer i la forward de la zona del primer cap a la bola.
 Es repeteixen els passos 4, 5 i 6 entre 30-60 cicles per obtenir com a resultat boles amb múltiples seqüències.
Les boles fan de micro-reactors i de forma ideal contenen una cadena de la llibreria de DNA, primers, una bola i el mix per a la PCR, aquestes en la seva superfície tenen units múltiples adaptadors. El mètode representat és per a una seqüenciació unidireccional de la cadena reverse original. Per dur a terme una seqüenciació bidireccional, s’ha d’afegir el doble de primers i d’adaptadors (1 per cadascuna de les dues cadenes) i els resultats obtinguts serien més bons.
iii. Enriquiment (únicament amb l’aparell Ion OneTouch): l’objectiu d’aquest pas és seleccionar únicament les boles que tenen DNA adherit, maximitzant així el procés posterior de seqüenciació. El procediment consisteix en la unió de biotina al primer, on s’unirà una segona bola que és magnètica de streptavidina que s’unirà a la biotina. Aquesta bola magnètica i tot el que estigui unit a ella quedarà immòbil en un imant, de forma que es retindran les boles que tenen DNA i s’eluiran les que no. Posteriorment, es durà a terme una desnaturalització amb NaOH on obtindrem la bola inicial amb el ssDNA que no estava unit a la bola magnètica.
     iv. Sequenciació: dins de cada pou hi ha un chip. El procediment és el següent: 1. Tenim en cada pou un micro-beat amb múltiples cadenes de DNA simple unides 2. Es posa un dels nucleòtids, si hi ha complementarietat es produirà una unió i s’alliberarà un protó que provocarà un canvi de pH que serà detectat pel chip i donarà una senyal determinada 3. Es fa un rentat, i cada 15 s es fa un nou bany amb un nou nucleòtid (cada nucleòtid estarà marcat d’una forma diferent per poder distingir-los posteriorment)  És un procés que té lloc simultàniament en milions o bilions de micropouets segons el chip.
v. Anàlisi de resultats: l’output que s’obté de l’instrument rep el nom d’ionograma i mostra la intensitat de senyal de cada ronda de nucleòtids que s’ha fet. Les dades les processa el software automàticament i hi ha diversos worklofws predissenyats. De cada pou present en el chip s’obté el seu ionograma i només se seleccionen els pous correctes: els que tenen un sol bead i un sol tipus de seqüència acoblada.
 Resultats al seqüenciar: Addició d’una base complementària  alliberament d’un protó: senyal amb una determinada alçada Addició d’una base no complementària  no s’allibera un protó: no hi ha senyal Addició d’una base complementària que es troba repetida (homopolímers)  alliberament de tants protons com bases complementàries seguides hi hagi: senyal més pronunciat. PROBLEMA: si es troben més de 7 o 8 bases iguals, és difícil detectar el nombre exacte de repeticions que pot haver.
 Elements clau de la seqüenciació: El chip és semiconductor i està format per milions de micropouets (varia el nombre segons el tipus de chip i el model), en el fons de cada pouet hi ha una capa sensible que està en contacte amb el sensor. En cada micropou hi ha una microbeat.
El senyal químic (canvi de pH) passa directament mitjançant aquests sensors a un senyal digital. Per tant, la detecció és directa, sense càmeres ni làsers, cada incorporació de nucleòtids és mesurada en segons.
4. Avantatges i inconvenients Escalabilitat: els sensors cada vegada són més petits, de forma que cada poc es poden posar en un chip més quantitat de pous Simplicitat: cost reduït, no hi ha necessitat d’elements especials (s’usen molècules naturals que no estan modificades ni marcades), tampoc s’usa instrumental car Rapidesa: una ronda dura aproximadament dues hores Homopolímers (ja explicat), fan perdre sensibilitat Longitud dels fragments: a partir de 400 bp disminueix l’exactitud La mitjana de seqüenciació d’una base (coverage) ha de ser molt elevada. Per detectar mutacions especialment escasses, en el cas de teixits normals/cèl·lules germinals, s’han de dur a terme de 100 a 200 repeticions i en cas de teixits tumorals de 1.000 a 2.000. Coverages de 100-200 i 1.000-2.000 5. Conclusions: tècnica de seqüenciació barata i efectiva que es desenvolupa tan ràpidament com la tecnologia, de forma que les seves limitacions en breus seran eliminades. A més, presenta un procediment de seqüenciació diferent als mètodes estàndard.
Seminari 14. Next-generation sequencing (NGS): Plataforma Illumina 1. Què és Illumina?: és una NGS (explicat en el seminari anterior). El que diferencia Illumina de Ion Torrent és la forma d’identificar les bases, en aquest cas es fa mitjançant fluorescència dels nucleòtids, i la separació dels fragments, que en aquest cas es fa mitjançant clústers.
2. Metolodogia:  Generació d’una llibreria: - Es talla el DNA mostra en fragments petits amb transposons, els fragments generats tindran extrems roms.
- Hibridació dels marcadors/adaptadors a cada extrem dels fragments. L’adaptador, amb forma de Y per unir-se a la placa, té colors diferents per a la cadena forward i reverse.
- Amplificació per PDR amb el marcador  -  - Generació del clúster: regions on trobem moltes repeticions d’un determinat fragment Hibridació del marcador dels fragments de la llibreria genètica amb el marcador de la placa chip (se’ls anomena pèls) Formació del pont amb l’altre extrem del DNA amb un altre marcador del chip Replicació del DNA, on els pèls del chip actuen com a primers. Ens queda una estructura de doble cadena entre els 2 ponts.
Es fa una separació d’una de les cadenes usant una solució de lisi (en aquest cas la reverse) i un rentat Seqüenciació mitjançant síntesi: s’observa la seqüència mitjançant color. Durant la seqüenciació es bloqueja la formació del pont S’afegeix una solució d’un únic nucleòtid marcat de forma fluorescent si aquest nucleòtid és complementari a la cadena mostra, s’unirà al primer (pèl del chip) i emetrà una coloració que serà detectada.
S’escindeix el nucleòtid marcat i es posa la mostra en una solució amb aquell mateix nucleòtid en estat normal.
Aquest procediment es repeteix fins finalitzar el fragment, que serà quan trobem el marcador.
Es forma novament el pont (eliminem les condicions que no permetien la formació) i es fa una replicació de tots els fragments.
Separació de la cadena que hem seqüenciat usant una solució de lisi (en aquest cas la forward) i un rentat Es duu a terme el mateix procediment: solucions d’un nucleòtid marcat de forma fluorescent, eliminació d’aquest nucleòtid i addició d’un en estat normal fins que finalitza el fragment.
Com es fa la detecció de nucleòtids? Hi ha dues formes A. S’afegeixen els 4 nucleòtids, cadascun marcat amb una fluorescència, el que sigui complementari a la cadena s’unirà, es detectarà la fluorescència, s’eliminarà, i s’afegirà el nucleòtid sense fluorescència.
Es tornarà a dur a terme el mateix procediment amb el següent nucleòtid i així successivament B. Afegim una solució amb un únic nucleòtid i la polimerasa, si aquest nucleòtid és complementari a la nostra mostra de DNA, s’unirà a continuació del primer i s’emetrà una fluorescència que serà detectada. El nucleòtid marcat de forma fluorescent serà substituït per un que no estigui marcat i s’afegirà la següent solució amb un únic nucleòtid. En aquest cas, tots els nucleòtids estan marcats amb el mateix fluorocrom.
 Anàlisi dels resultats: es fa un alineament de cadascuna de les seqüències obtingudes en un clúster mitjançant un software bioinformàtic. Es poden identificar les diferències entre el genoma de referència i les noves seqüències.
3. Material: el principal proveïdor dels diferents kits i màquines és l’empresa Illumina. Hi ha diferents tipus de màquines: a. HiSeq: rendiments alts, la lectura màxima és de 100 bp pels dos extrems (tant per forward com per reverse) i es poden seqüenciar fins a 8 mostres en 11 dies. Aquest equip permet la seqüenciació de genomes complerts b. MiSeq: més simple, no es poden seqüenciar mostres simultànies, únicament una. Té una lectura màxima de 150 bp pels dos extrems i la seqüenciació pot tenir una durada de 4 a 24 h depenent de la complexitat de la mostra. Aquest equip permet la seqüenciació de petits fragments del genoma o una seqüenciació dirigida.
Tota màquina consta de tres parts: pantalla (on es programen tots els passos que s’han de dur a terme), lloc d’introducció de les mostres, mòduls òptics de doble superfície que fan un escombrat de la mostrat i seguidament ens donen imatges per fer la seqüenciació (aquests permeten que la màquina sigui més ràpida) i el lloc on es depositen els diferents reactius.
4. Comparació amb Sanger En els avantatges de Illumina trobem un alt rendiment degut a que es produeixen milions de còpies en un dia.
En quant als inconvenients de Illumina, cal destacar que es produeixen molts errors, però aquests no són greus ja que disposem d’una gran quantitat de còpies de cada fragment. L’inconvenient de Sanger respecte Illumina és el preu, mentre que en el primer mètode seqüenciar una mostra ens costa 7 €, en Illumina té un preu de 1,5 € 6. Comparació amb Ion Torrent Característiques que els diferencien Tipus de PCR Illumina PCR amb pont Ion Torrent PCR d’emulsió Nucleòtids Marcats de forma fluorescent i no marcats Naturals Polimerasa Dissenyada per l’empresa Tipus de mesura Fluorescent Naturals: reacció ocorre a temps real Elèctrica (canvi de pH per alliberament de protons) Seminari 15. Detecció de la Metilació mitjançant conversió amb Bisulfit 1. Introducció a. Per a què serveix la metilació? En el cas dels procariotes, per a la protecció enfront fags i en el cas d’eucariotes, forma part de la regulació de l’expressió gènica b. Aplicacions: importància en l’organisme  patró de metilació característic en el càncer, intervé en la impremta genètica, regulació cel·lular i desenvolupament embrionari. Mitjançant aquest mètode, es distingeixen citosines no metilades de citosines metilades.
2. Etapes de la conversió amb Bisulfit a. Preparació i desnaturalització: la preparació es fa en un tampó de lisi i la desnaturalització mitjançant incubació amb NaOH o xoc tèrmic.
b. Desaminació amb bisulfit: c. Amplificació: amb primers específics. Aquests han de tenir una longitud d’entre 24 i 30 bp, una temperatura de Melting d’uns 50 ºC. L’extrem 3’ ha de ser una C convertida en T (mitjançant desaminació) i el 25% de les bases han de ser citosines desaminades a timines. S’han d’evitar dinucleòtids CpGs en els primers (són les principals zones de metilació del DNA).
3. Anàlisi de resultats: a. Anàlisi de restricció: en gel d’agar. Aquest anàlisi serveix per comparar metilacions concretes. S’ha vist que hi ha temperatures òptimes per observar les diferents bandes. En el cas de la imatge seria a 55,6 ºC. Els fragments s’han digerit amb enzims de restricció Taq1 (T) i HpaIII (H) que digereixen el DNA metilat i no el DNA que ha estat desaminat (C  T).
b. Desnaturalització: comparació de les temperatures de Melting. Podem detectar si una mostra està 50% metilada, 100% metilada o 100% no metilada segons la temperatura en que es desnaturalitza la doble cadena. En el cas d’un % de metilació del 50% s’observaran dos pics, un a cada Tm.
c. Visualització per electroforesi d’un gel d’agarosa: seqüenciació directa per Sanger. És molt clar en el cas que hi hagi un 0% o un 100% de metilació. En el cas que trobem dues bandes, el % de metilació es mesura per intensitat de fluorescència. Com es fa això? Es seqüencien els fragments de forma individual, els qual hauran estat clonats en cèl·lules hoste, de forma que tenim colònies específiques de cada fragment.
En la següent imatge podem veure l’electroferograma de tres línies cel·lulars diferents marcats en color groc. La línia cel·lular X mostra un 100% de metilació en els tres tipus de CpG, mentre que les línies cel·lulars Y i Z mostren diferents graus de metilació que es poden observar per superposició de senyals de G i A.
d. Mapa de Bisulfit: seqüenciació amb NGS. Es tracta d’un mapa que mostra la densitat de metilació mitjançant punts vermells en els respectius llocs CpG, segons el determinat per seqüenciació directa dels diversos clons.
e. Espectre: fragments de DNA poden mostrar espectres específics depenent de la quantitat present de metilació del DNA f. Epigrama: resumeix el % de metilació del DNA en cada lloc CpG de quatre línies cel·lulars diferents g. Methylation plot: es tracta d’un resum de la trama derivada del epigrama.
4. Problemes, causes i solucions a. Conversió incomplerta, hi ha dues possibles causes: i. Desnaturalització parcial del DNA: es soluciona fragmentant el DNA o prolongant el temps d’incubació.
ii. Re-alineament de les cadenes durant el tractament amb bisulfit: la solució és provocat increments periòdics de temperatura durant el tractament amb bisulfit o bé l’addició d’agent químics que trenquin aquests re-alineaments.
b. Ningun producte de la PCR, dues possibles causes: i. Degradació del DNA: es pot soluciona reduint el temps d’incubació amb bisulfit, evitant temperatures elevades, incloent molècules carrier i/o reduint la mida de l’amplicó.
ii. Condicions de la PCR: es soluciona avaluant i optimitzant la PCR c. Amplificació parcial dels amplicons, dues causes possibles: i. Condicions de la PCR: solució es variar la Tm i/o la concentració de Mg2+ ii. Primers: es soluciona avaluant els primers usats 5. Avantatges i inconvenients Reactius senzills i barats No es requereix equip específic No detecta altres formes de metilació com ara les 5hidroximetilcitosines El bisulfit és agressiu amb el DNA Temps d’incubació llargs No és del tot òptim, de forma que s’han de fer controls positius per assegurar-nos que s’ha produït una conversió total La conversió de bisulfit i el posterior anàlisi es basa en la premissa de que el DNA ha estat completament renovat amb cada citosina no metilada desaminada a uracil. Podria produir-se una conversió incomplerta, on poden sorgir problemes amb l’anàlisi ja que les citosines no desaminades es poden interpretar erròniament com citosines metilades. La conversió amb bisulfit pot optimitzar-se en diferents etapes per tal de maximitzar el percentatge de conversió.
Tot i les limitacions, aquesta tècnica és una eina per entendre l’epigenètica, que està relacionada amb malalties humanes com ara el càncer Seminari 16. Detecció de SNPs mitjançant Sequenom MassARRAY 1. Fonament: el procés s’inicia amb una PCR normal on s’amplifica la regió amb el SNP. Després d’un rentat, es duu a terme una iPLEX PCR, on únicament s’amplifica el SNP. Com es duu a terme aquesta iPLEX PCR? Un SNP acostuma a presentar dues variants al·lèliques, el que es fa en aquest cas és afegir un primer de PCR que hibridarà amb la seqüència anterior al SNP i es quedarà just en aquest, és a dir, la primera base que s’afegirà després del primer serà la del SNP, de forma que el que fem és afegir una mescla amb ddNTPs on un tindrà una massa normal i l’altre presentarà una massa modificada. Perquè fem això? Per després poder detectar quin dels dos didesoxinucleòtids s’ha unit, ja que la massa del amplicó serà diferent.
Després d’aquesta iPLEX PCR, es fa un rentat i una transferència a una matriu 2. Protocol: a. Multiplex PCR: s’usen primers diferents per cada variant al·lèlica, els quals es diferenciaran únicament en una base. Aquests primers estan dissenyats de tal forma que s’amplifica la regió que conté el SNP.
b.
c. SAP Reaction Cleanup: es fa un rentat de l’excés de primers i de l’excés de dNTPs d. iPLEX Reaction: es dissenyen primers que hibriden en la seqüència anterior al SNP i que acaben justament on es troba aquest SNP, de forma que el primer nucleòtid que s’afegirà serà el que correspon al SNP. El que es fa aleshores és, el que es fa en totes les PCR: es desnaturalitza la doble cadena, s’hibrida el primer i, en aquest pas és on hi ha el canvi. En comptes d’afegir dNTPs, s’afegeixen ddNTPs per a que la reacció acabi just en el moment d’inserció de la base a la qual correspon el SNP. Degut a que un SNP acostuma a presentar dues variants al·lèliques, el que es fa és afegir una mescla de ddNTPs on un presenta una modificació en la massa. De forma que, a mode de resum, el que es fa és una extensió en la zona del SNP que finalitza just en l’addició de la base del SNP.
e. Resin Reaction Cleanup: es fa un rentat amb una resina (Spectroclean Resin) que interacciona amb els ions. Inicialment tenim la nostra mostra amb àcids nucleics i cations, afegim la resina, es duu a terme una centrifugació i en el precipitat quedaran els cations units a la resina i en el sobrenedant la nostra mostra amb únicament àcids nucleics.
f. Nanodispensing: Es depositen les mostres en el Spectro CHIP array que conté una mescla amb àcid hidroxipicolínic que facilita l’evaporació.
g. MALDI-TOF (Matrix Assistent Lasert Desortion Ionization – Time of fly) / MS: tècnica de ionització suau usada en espectrometria de masses, és una tècnica molt precisa que ens permet mesurar fins a 40 SNPs simultàniament. El que succeeix és el següent: l’analit és ionitzat, un camp elèctric accelera els ions, les partícules es separen segons la seva relació m/q, degut a que la càrrega en tots els analits és la mateixa, es separen en funció de massa, els ions menys pesats arribaran abans al detector, on es mesura la col·lisió de l’ió i es construeix un gràfic o un espectre, un software agafarà les dades i les prepararà per al seu posterior anàlisi Com s’analitzen fins a 40 SNPs simultàniament? Mitjançant la modificació de la massa, el que s’analitza en MALDI-TOF és l’amplicó, de forma que el que fem és diferenciar en quina zona del genoma estem treballant per la longitud dels primers (aquesta és fàcilment modificable). Un cop es tenen diferenciats els diferents primers de cada SNP, es mira en aquests quina variant al·lèlica presenten segons la variació de la massa.
3. Resultats: a. Traffic Light: el color indica la validesa del resultat (verd: bon resultat, vermell: mal resultat, groc: resultat regulat) b. Espectre c. Gràfic de clúster (Cluster Plot): es mostren els al·lels segons la seva massa molecular 4. Equip: a. MassARRAY Compact Analyzer: espectròmetre de masses MALDI-TOF específicament dissenyat per aplicacions genòmiques. Pot analitzar més de 3.000 mostres al dia.
b. MassARRAY Nanodispenser: gràcies en aquest, s’aconsegueix transferir ràpidament la mostra als SpectroCHIPS c. MassARRAY Liquid Handler and Fusio Chip Module (OPCIONAL): robot amb 96 canals de pipeteig que proporciona esquemes pre-programats de pipeteig. L’opció de “Fusio Chip Module” proporciona una solució rentable per manipular els líquids dels SpectroChips i de les microplaques en un únic instrument 5. Avantatges: Versàtil i rentable Obtenció del resultat en menys de 8 hores Bon rendiment gràcies a l’elevada precisió de l’espectrometria de masses MALDI-TOF Capacitat d’analitzar fins a 40 SNPs al mateix temps Disponibilitat de SpectroChips de 24, 96 i 384 pouets ...