Tema 12 Receptores tirosina-kinasa EGFR y c-ERB-B2 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 16
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER TEMA 12 Principales vías de señalización en cáncer.
Receptor tirosina-kinasa GENERALIDADES Los receptores con actividad tirosina kinasa son proteínas transmembrana que tienen un dominio intracelular con actividad tirosina kinasa. Son generalmente receptores de factores de crecimiento. La interacción del receptor con su ligando activa vías de señalización intracelulares que suelen finalizar con la modificación de factores de transcripción.
Los factores de crecimiento que actúan frecuentemente como ligandos de estos receptores suelen ser factores proteicos que son secretados.
Si analizamos la estructura de los receptores con actividad tirosina kinasa o RTKs vemos que básicamente tienen: - Dominio extracelular - Región transmembrana - Dominio intracelular, que es el que contienen el dominio kinasa.
La parte más variable de los receptores es la parte extracelular que es la que da especificidad por el ligando.
La función de los RTKs está determinada por dónde, cuándo y cómo se expresan ya que, un mismo receptor puede llevar a cabo una función en un tipo celular y otra función diferente en otro tipo celular. Incluso la función de un mismo receptor puede ser distinta en una misma célula ya que, en función del momento en el que se exprese dicho receptor, el ambiente o el estado de la célula (que puede estar expresando proteínas distintas) pueden ser diferentes.
Estos receptores participan en fenómenos variados que regulan la homeostasis celular, la alteración de los cuales es frecuente en el cáncer. La estimulación de estos receptores induce proliferación, migración e inhibición de la apoptosis (entre otras cosas).
Podemos encontrar muchos RTKs diferentes, agrupados en varias familias por homología de secuencia y en función de cuál es el factor de crecimiento que actúa como ligando. Por ejemplo, podemos encontrar receptores que tienen un dominio tirosina kinasa, receptores que lo tienen "partido" en dos, … Todos los receptores con actividad tirosina kinasa han estado implicados directa o indirectamente en cáncer.
1 CÁNCER Curso 2015/2016 Mecanismo general de activación de los RTKs El ligando se une al receptor (a la parte extracelular), que dimeriza tras esta interacción. La dimerización provoca un cambio conformacional que activa la actividad enzimática del receptor, es decir, se activa la actividad kinasa. Los primeros residuos de tirosina que son fosforilados por el receptor son los propios, es decir, el receptor se autofosforila. El receptor queda con residuos de fosfotirosina que son reconocidos por proteínas adaptadoras que tienen dominios SH2 y PTB de reconocimiento de fosfotirosinas. Las proteínas adaptadoras transmiten las vías de señalización hacia el interior de la célula.
La activación de los RTKs provoca la activación de diversas vías de señalización. Las vías más importantes activadas por estos receptores son la vía PI3K/ATK y la vía RAS/MAPK.
Hay que recordar que entre las diferentes vías de señalización se produce el fenómeno de Crosstalk, es decir, las vías se encuentran interconectadas. En casos particulares, los RTKs pueden activar vías de señalización que no son canónicamente activadas por estos receptores. También ocurre que las vías activadas por los RTKs (PI3K/ATK y RAS/MAPK) no son exclusivas de estos receptores.
RTKs EN CÁNCER Normalmente, lo que ocurre es que se producen mutaciones en los receptores que hacen que estos funcionen constitutivamente y de manera independiente de ligando. En estos casos, la vía de señalización se encuentra siempre activa, por lo que se produce una respuesta desmesurada.
Teniendo en cuenta que se trata de vías de señalización que controlan fenómenos como la proliferación, la migración o la inhibición de la apoptosis, la actividad constitutiva de estos receptores puede provocar el desarrollo tumoral.
Se producen mutaciones muy variadas: amplificaciones, mutaciones puntuales, grandes deleciones del dominio extracelular o de dominios reguladores, pequeñas deleciones e inserciones, … 2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Las alteraciones en distintos receptores con actividad tirosina kinasa dan lugar a tumores determinados, como puede verse en la siguiente tabla. Es decir, cada tipo de alteración va preferencialmente asociada con el desarrollo de un tumor concreto (y no de otro).
Además, lo que también puede ocurrir es que haya activación constitutiva de la expresión del ligando. En este caso se activará el receptor se activará en exceso aunque no tenga ninguna alteración.
Esto es lo que ocurre típicamente en el caso del receptor Met, cuyo ligando es HGF. La sobreexpresión del factor de crecimiento de hepatocitos hace que el receptor se encuentre activado en exceso aunque no presente ninguna alteración.
Receptores de EGF Estos receptores son uno de los más frecuentemente alterados en cáncer. Dentro de la familia de los receptores de EGF podemos encontrar cuatro miembros para los que encontramos varias nomenclaturas: - HER1 - ErbB1 - EGFR. Es el receptor típico del EGF. Este receptor tiene actividad tirosina kinasa en su dominio intracelular y su parte extracelular puede activarse tras la unión de diversos ligandos con distinta afinidad. En cada contexto celular y momento se expresarán unos ligandos u otros.
- HER2/neu - ErbB-2. Se trata de un receptor que también está muy implicado en tumorogénesis.
También tiene dominio tirosina kinasa intracelular. Hoy en día no se conoce ligando para este receptor.
- HER3 - ErbB-3. El ligandos de este receptor son las heregulinas, muy implicadas en migración celular y desarrollo. No tienen dominio intracelular con actividad tirosina kinasa por lo que es un receptor defectivo  no es puede activar.
- HER4 - ErbB-4. Se trata del menos estudiado de los receptores de EGF (es el gran desconocido) aunque están comenzando a salir estudios en los que se demuestra su implicación en el desarrollo de tumores.
Tiene varios ligandos y actividad tirosina kinasa.
3 CÁNCER Curso 2015/2016 De manera general, todos los receptores de EGF funcionan como dímeros. Cuando los receptores se unen al ligando pueden formar homodímeros (formados por dos proteínas del mismo tipo) o heterodímeros (formados por un receptor de cada tipo). Se han descrito todas las combinaciones posibles entre los 4 tipos de receptores.
La formación de distintos dímeros afecta a la duración del estímulo, a la intensidad y a la respuesta.
Los dominios de dimerización de los receptores son esenciales para su funcionamiento ya que, si no se produce dimerización, no hay señalización hacia el interior celular. Se genera una gran combinatoria de vías de señalización ya que, cada receptor tiene unas tirosinas concretas que, al fosforilarse, atraen a unos adaptadores concretos que activan una vía determinada.
Además, cada tipo de receptor reconoce un ligando determinado.
Además, hay que tener en cuenta que en los casos en los que se forma un homodímero, el receptor reconoce el doble de ligandos y atrae al doble de adaptadores, por lo que se activa una sola vía de señalización con mayor intensidad. En el caso de los heterodímeros, el receptor tiene la posibilidad de activar dos vías diferentes pero con menos intensidad.
Los diferentes tipos de señalización controlan muchos procesos por lo que, encontramos muchos tipos celulares con muchas combinatorias que pueden generar muchos tipos de respuesta. Además, el contexto en el que encontramos el receptor determina el tipo de respuesta.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Principales alteraciones de los receptores de EGF A partir de aquí, nos vamos a centrar en las alteraciones que se producen en los receptores de EGF de tipo 1 y 2 ya, a pesar de que las alteraciones en HER 3 y HER 4 se están encontrando en tumores, no son tan frecuentes.
Mutaciones en EGFR (erbB1) Podemos encontrar diferentes tipos de mutaciones que se producen en el receptor de EGF de tipo 1 que constituyen mecanismos de activación oncogénica: - Sobreexpresión del receptor: hay más copias del receptor en la membrana de las que corresponde .
Puede ser consecuencia por ejemplo, de una amplificación.
- Activación autocrina. Es que la que ocurre en caso de que el ligando se encuentre sobreexpresado.
- Heterodimerización y Crosstalk. ErbB1 puede dimerizar por ejemplo con ErbB2 e, intracelularmente, el receptor ErbB2 puede activar a ErbB1. Cuando esto ocurre, el ErbB1 se activa en exceso.
Podemos encontrar otros estímulos, como la modulación que ejerce la matriz extracelular, que también regulan la señalización al alza. En el caso de la regulación por matriz, receptor y ligando están correctos (no están mutados) pero hay algo en la célula que hace que la vía se active más de la cuenta.
Ocurre por ejemplo con las integrinas. En este caso, el receptor sería un mediador de la oncogénesis.
- Fallo en la regulación negativa (downregulación) del receptor de EGF. En condiciones normales, el receptor se une a proteínas que lo endocitan o si no, puede degradarse.
- Mutaciones activadoras (de ganancia de función) del receptor de EGF 5 CÁNCER Curso 2015/2016 Como ya hemos dicho, cada alteración se relaciona preferencialmente un tipo concreto de tumor (aunque pueden encontrarse en otros). En el caso del receptor de EGF de tipo 1, las mutaciones se encuentran sobre todo en glioblastoma y cáncer de pulmón de células pequeñas.
Las mutaciones en el receptor que encontramos en ambos tipos de tumor son bastante diferentes ya que, en principio los dos tumores ya difieren en cuanto al dominio afectado.
 En el glioblastoma encontramos frecuentemente alteraciones en el dominio extracelular.
 En los casos de cáncer de pulmón encontramos generalmente alteraciones en el dominio tirosina kinasa.
En concreto, las mutaciones más frecuentes son: Dominio extracelular Mutación EGFR v III: es una deleción de la parte extracelular (exones 2-7) que se encuentra asociada a glioblastoma. Se trata de la mutación más frecuente del dominio extracelular.
Dominio intracelular Se trata del dominio que tiene la actividad tirosina kinasa, que se encuentra entre los exones 18 y 21.
En el dominio intracelular se producen más frecuentemente pequeñas deleciones y mutaciones puntuales: - Pequeña deleción en el exón 19 en el 61% de los casos que hace que el receptor tenga actividad constitutiva.
- Mutación puntual en el 24% de los casos, que también hace que el receptor tenga actividad constitutiva.
6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Mutaciones en el glioblastoma Como ya se ha comentado, la mutación más frecuente es la deleción de la parte extracelular del receptor de EGF, que genera formas truncadas del receptor con actividad constitutiva.
También se encuentran deleciones en la parte intracelular, pérdidas del dominio tirosina kinasa, duplicaciones del dominio tirosina kinasa, … La secuenciación masiva del genoma de los cánceres humanos ha proporcionado mucha información sobre los % en los que encontramos cada tipo de mutación.
A menudo, los receptores de EGF comparten estado mutacional con otros receptores con actividad tirosina kinasa. En frecuente encontrar en el glioblastoma mutaciones asociadas a otros receptores con actividad tirosina kinasa.
Además, existe una gran heterogeneidad de mutaciones dentro del mismo tumor. En el caso del glioblastoma se ha comprobado que, si cogemos un trozo de un tumor y lo secuenciamos, encontramos células con una mutación en el receptor de EGF y otras células que presentan otra alteración diferente en los mismos receptores.
Hay distintos grados de heterogeneidad.
Esto es muy relevante ya que puede tener implicaciones terapéuticas importantes.
También se ha observado que, dependiendo de la célula, dos receptores mutados pueden tener diferentes alteraciones epigenéticas. Es decir, dos células con la misma variante (mutada) del receptor lo expresan de forma distinta.
Las mutaciones en el receptor de EGF hacen que pierda su regulación: el receptor dimeriza constitutivamente y comienza a señalizar. Por ejemplo, la mutación V III caracterizada por la deleción de la parte extracelular que implica que el receptor no se puede unir al ligando, permite que el receptor dimerice en ausencia de ligando.
7 CÁNCER Curso 2015/2016 La variante V del receptor (EGFRvV5) tiene una deleción de la región C terminal (intracelular), donde se encuentra el lugar de unión a Cbl que permite la ubiquinización del receptor. En este caso, la actividad tirosina kinasa del receptor está intacta pero el receptor no se puede degradar, por lo que hay más receptor en la membrana  incrementa la actividad total.
También ocurre que, mutaciones en otras vías pueden transactivar al receptor.
Existen vías de señalización en las que se activan kinasas que pueden transfosforilar al receptor, tras lo que se forman los docking sites. Como es lógico, la sobreactivación de estas vías desencadena la sobreactivación de la vía activada por estos receptores.
EGFR como diana terapéutica - terapia dirigida Hoy en día se tiende a la medicina personalizada. En el momento en el que se sabe que el paciente tiene el receptor EGFR alterado, se aplican estrategias dirigidas contra esta señalización. Se han diseñado muchas estrategias diferentes, algunas de las cuales se han llevado a la clínica: los anticuerpos monoclonales y los inhibidores de la actividad tirosina kinasa del receptor (son las moléculas rodeados en rojo las que se aplican en clínica fundamentalmente).
Hay una gran investigación para estos fármacos ya que, las células tumorales acaban desarrollando resistencia.
8 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - Pequeñas moléculas inhibidoras de TK Son moléculas pequeñas permeables, que pueden atravesar las membranas, que se unen al dominio tirosina kinasa del receptor, impidiendo que se active. El nombre de este conjunto de fármacos finaliza con la terminación -ib (inihibidores).
Las diferentes fármacos que se han desarrollado tienen propiedades distintas.
De la primera generación de inhibidores TK destacan: Anilina-quinazolina o gefitinib, que inhibe reversible y específicamente EGF-R. Es un inhibidor competitivo del ATP e impide la autofosforilación del receptor y la activación de la kinasa.
Derivado quinazólico - erlotinib: inhibe reversible y específicamente la kinasa del EGF-R (también a EGFR v III).
Muchos de los inhibidores pueden servir para una isoforma mutante concreta del receptor. Lo importante antes de administrar un tratamiento a un paciente, es prever si el tratamiento funcionará para ese caso concreto ya que, si no sirven, pueden ser muy perjudiciales (estamos inhibiendo una vía de señalización). Es decir, es muy relevante el diagnóstico molecular.
Si en el tumor que vamos a tratar hay mutaciones sensibles a un determinado tratamiento, el paciente que las tiene puede ser tratado con estos inhibidores ya que el tumor responderá. El problema es que el tumor suele acabar desarrollando mutaciones secundarias que le confieren resistencia.
Continuamente se están descubriendo nuevas generaciones de inhibidores destinadas a superar las mutaciones que dan resistencia a las generaciones anteriores.
9 CÁNCER Curso 2015/2016 - Anticuerpos monoclonales bloqueantes dirigidos contra el dominio extracelular del EGFR Los nombres de los fármacos que son anticuerpos monoclonales tienen la terminación - ab (antibody).
Los anticuerpos normalmente inhiben la unión con el ligando.
Todos los anticuerpos que se emplean como fármacos son humanizados.
Ejemplos de anticuerpos monoclonales: Cetuximab: anticuerpo dimerizado (humano-ratón) de la subclase IgG2.
Panitumunab: humano. Subclase IgG1, Son altamente específicos para EGFR (erb1) y sus heterodímeros.
Impiden la unión del ligando, Se administran solos o en combinación - en cáncer colorectal, de pulmón y en cánceres de cabeza y cuello.
Se pueden administrar los anticuerpos en caso de que el tumor desarrolle mutaciones que le aporten resistencia a los inhibidores de TK. Al final el tumor acaba desarrollando mutaciones secundarias en el dominio extracelular adquiridas durante el tratamiento que dan resistencia al anticuerpo. En estos casos, es necesario administrar otro anticuerpo distinto.
A menudo, en los casos de resistencias a los fármacos, no debemos buscar la resistencia en alteraciones secundarias en el propio receptor, ya que puede haber mutaciones en elementos downstream del inhibidor que activan de nuevo la señalización.
Se están desarrollando nuevas estrategias terapéuticas para aumentar la efectividad de los fármacos, como la combinación de anticuerpos. Cuando se combinan anticuerpos, se acaban formando agregados de anticuerpo y receptor que se endocitan  la downregulación es más eficiente.
10 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV También se pueden combinar anticuerpos con inhibidores TK para intentar asegurar la inhibición.
También se conjugan los anticuerpos con células del sistema inmune (por ejemplo, con células Natural killer), para dirigir la respuesta inmune hacia la célula tumoral.
Medicina personalizada Tenemos un paciente que tiene un tumor con unas mutaciones en el receptor de EGF. Administramos un tratamiento específico para estas mutaciones y el tumor remite. Al cabo de un tiempo, se desarrollan nuevas mutaciones que hacen que se desarrolle de nuevo el tumor. Extraemos estas células y las cultivamos y realizamos con ellas un ensayo clínico de drogas: las colocamos en placas multipocillo y probamos varios tratamientos y combinaciones de fármacos para ver qué funciona mejor para estas células. Este ensayo se realiza de manera conjunta a la secuenciación. No basta solo con secuenciar porque hay que tener en cuenta la heterogeneidad tumoral  puede haber células resistentes a un tratamiento y otras células sensibles. Es necesario contar con la prueba empírica para asegurar el resultado.
Las ayudas diagnósticas son muy importantes para poder emplear medicina personalizada. Aparte de los sistemas de secuenciación, se usa inmunohistoquímica con anticuerpos que reconoce de manera específica una forma mutada del receptor. En la imagen de la derecha vemos una muestra de un tumor en el que hay una mutación puntual.
Actualmente se combinan técnicas de inmunohistoquímicas con técnicas de ácidos nucleicos.
11 CÁNCER Curso 2015/2016 A continuación se muestra una lista de los diferentes tipos de fármacos contra EGFR que se están desarrollando, aunque como ya se ha dicho, solo los dos primeros se aplican en clínica (los demás están en fase de ensayo clínico).
Mutaciones en HER2 (erbB2) HER2/neu juega un importante papel en el desarrollo y la progresión del cáncer de mama. También se encuentra mutado en otros cánceres como el cáncer de colon, el cáncer de páncreas, de esófago, cáncer de endometrio y cáncer gástrico - son tumores de origen epitelial.
Se encuentra sobreexpresado en un 25-30% de los cánceres de mama, generalmente consecuencia de la amplificación génica.
Las mutaciones en HER2 se asocian con un mal pronóstico y con la resistencia a la terapia hormonal.
En las siguientes imágenes podemos ver una inmunohistoquímica para HER2. En la mama normal la presencia de este receptor es prácticamente indetectable ya que no se expresa o se expresa muy poco. En el caso del tumor, el marcaje aparece en la membrana (se trata de un receptor).
Podemos encontrar mutaciones puntuales y alteraciones en el número de copia. Las mutaciones se producen generalmente en los dominios tirosina kinasa.
Como ya se ha comentado, la alteración principal de HER2 es la amplificación génica, que da lugar al incremento de la expresión de la proteína, que puede formar homo o heterodímeros.
Parece ser que Erb2 heterodimeriza preferencialmente con EbrB3.
En la siguiente imagen vemos la distribución de las mutaciones que podemos encontrar en ErbB2.
12 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Al igual que ocurre con el receptor EGFR, la activación del receptor desencadena diversas vías de señalización.
HER2 como diana terapéutica - terapia dirigida Básicamente, se han desarrollado anticuerpos monoclonales bloqueantes dirigidos contra el dominio extracelular del receptor (-ab) y pequeñas moléculas inhibidoras de su actividad tirosina kinasa (- ib).
En el cuadro podemos ver los fármacos más comunes dirigidos a HER2 que se emplean en clínica.
Anticuerpos monoclonales Hay ligeras diferencias en los mecanismos de actuación de estos fármacos. Por ejemplo, Trastuzutumab impide solamente la formación de homodímeros HER2, en cambio, Pertuzumab impide la formación de homodímeros , de heterodímeros de HER2 con HER1 y HER3 (este anticuerpo tiene una acción más completa).
13 CÁNCER Curso 2015/2016 Estos anticuerpos interaccionan con el receptor e impiden su unión con el ligando.
Se han desarrollado variantes de estos anticuerpos que acoplan el anticuerpo con agentes quimioterápicos (c), creando complejos que se internalizan en el interior de la célula. Estos no se encuentran todavía en fase clínica.
También se están desarrollando anticuerpos monoclonales destinados a atraer a las células del sistema inmune del huésped (d) hacia la célula tumoral para que estas ataquen al receptor.
Como los mecanismos de acción de los distintos anticuerpos son diferentes, consecuentemente, encontramos diferencias a la hora de hablar de su eficacia. Si tenemos una alteración de HER2, tenemos varias opciones de tratamiento con anticuerpos cualquiera de los cuales inhibirá la señalización.
En caso de tener una niveles muy elevados de HER2 (por amlificaicón por ejemplo) es más probable que se forme el homodímero de HER2 por lo que el tratamiento más eficaz será el Trastuzutumab (específico para los homodímeros).
En cambio, si los niveles de HER2 son bajos, el Trastuzutumab no tendrá efecto ya que solo inhibe la homodimeriación y el receptor puede formar heterodímeros más probablemente (los niveles son bajos por lo que es más probable que antes encuentre otro de los tipos de receptor para dimerizar con él).
En este caso, sería necesario tratar con Pertuzumab.
Inhibidores de TK e inhbidores de HSP90 Los inhibidores de la actividad tirosina kinasa del receptor también resultan eficaces para paliar la actividad constitutiva del receptor.
Inhibiendo la actividad kinasa del receptor consiguen bloquear el transducción de la vía al interior celular.
Los inhibidores de HSP90 incrementan la endocitosis del receptor constituye un mecanismo para disminuir el número de copias del receptor en la membrana.
Las células tumorales son capaces de desarrollar mecanismos de resistencia a la terapia, ya sea por mutaciones propias o por mutaciones secundarias adquiridas.
Por ejemplo, podemos encontrar varias mutaciones que hacen que el Trastuzumab deje de tener efecto como formas truncadas de la proteína a las que les falta la parte extracelular. Las mutaciones 095 y Δ16 son ejemplos de deleciones de la parte extracelular - sin parte extracelular del receptor, el anticuerpo no puede reconocerlo y el tratamiento deja de ser efectivo.
Los tumores con sobreexpresión de la glicoproteína MUC también son resistentes al tratamiento con Trastuzumab.
14 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En el caso de los inhibidores de la actividad tirosina kinasa, también pueden encontrarse mutaciones que hacen que estos dejen de ser efectivos para el tratamiento del tumor. El Lapatinib es uno de los inhibidores de la primera generación y deja de funcionar cuando hay inserciones en el exón 20.
En estos casos, es necesario desarrollar nuevas generaciones de fármacos (Neratinib) para continuar con el tratamiento.
En la siguiente imagen vemos los efectos de las mutaciones que provocan la pérdida de efectividad de los anticuerpos monoclonales, como las deleciones (totales o parciales) de la parte extracelular.
En las gráficas de crecimiento se representa el volumen de carcinomas de mama (con amplificación de HER2) con diferentes tratamientos (Trastuzumab y Lapatinib). El crecimiento se disminuye respecto al control con la administración de ambos fármacos (más con el Lapatinib).
En el caso de la deleción p95, vemos que el Trastuzumab ha dejado de tener efecto, ya que su crecimiento se equipara con el de la célula tumoral control (sin tratamiento).
Cada vez más, la oncología se dirige hacia la medicina personalizada - se hacen screenings celulares de cada paciente para ver qué mutaciones presenta. En el caso de HER2 también se usan los screenings. Cada paciente tiene unas mutaciones diferentes que se tratarán con fármacos distintos y además, la aparición de resistencias también genera una gran variabilidad en la efectividad de los tratamientos.
Se extraen células del tumor de mama y se hace la secuenciación masiva. Si cogemos estas células y las inyectamos en un ratón, aparecerán las alteraciones que el paciente presenta.
15 CÁNCER Curso 2015/2016 Hoy en día, cuando se recibe un tumor de mama se busca determinar si el tumor es apropiado para el tratamiento con anticuerpos monoclonales. Para ello, se hace una inmunohistoquímica y se valora el resultado asignando un valor numérico.
Después, en función del resultado obtenido en la inmunohistoquímica (nivel 2), se hace hibridación in situ (con una sonda fluorescente para HER2) para ver si hay amplificación (habrá más copias de HER2 a nivel del genoma).
En función de los resultados, como puede verse en el siguiente diagrama, se administrará un tratamiento otro.
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