Purificació del DNA covalent circularment tancat (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 2
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 5

Vista previa del texto

→Mètode de purificació del DNA circular tancat covalentment 1 Tenim un cultiu de bacteris Ecoli infectats amb el fag M13. El fag ha crescut dins dels bacteris, s’ha replicat, i dins de les cèl·lules bacterianes tenim molècules de DNA circular del virus, el genoma del bacteri, i possibles plasmidis. Volem purificar únicament el DNA víric i que aquest estigui tancat. Fem una lisi alcalina i la cèl·lula bacteriana llisarà. A més, com que estem treballant a pH alt el DNA es desnaturalitzarà.
2 Ara baixem el pH fins que prengui un valor neutre. Amb això aconseguirem que el DNA víric renaturalitzi però el DNA bacterià no; com a molt renaturalitzarà parcialment (és molt llarg, té 4M de parelles de bases). Veiem que el procés de renaturalització del DNA lineal i el DNA circular covalentment tancat és diferent.
El DNA lineal –que representa el genoma bacterià- per poder regenerar la seva doble hèlix ha de seguir un procés complicat que té dues fases: 1 Nucleació, molt lenta, que requereix l’encarament de les bases complementàries i 2 Zippering, que és molt ràpida, també anomenada “efecte cremallera”. El DNA circular covalentment tancat, com que té les dues anelles unides per un enllaç topològic, no cal que passin per la fase de nucleació.
3 A continuació centrifuguem. Tindrem, al pellet, un precipitat format per fragments del DNA d’ecoli de gran pes molecular. El DNA covalentment tancat quedarà al sobrenedant, juntament amb DNA circular nicat. Ara sols cal purificar aquesta última fracció.
4 El següent pas és una centrifugació d’equilibri amb clorur de cesi (CsCl), que constituïrà un gradient autoformat. Afegirem una quantitat concreta d’aquesta sal a la mostra de DNA (el sobrenedant) i bromur d’etidi. Es posarà tot dins d’un tub de centrifugació especial. Inicialment la mescla és homogènia i no hi ha gradient. Com que la velocitat de rotació de la màquina és molt alta hem d’assegurar-nos que el tub no perdrà líquid, perquè podria fer malbé la màquina. Això ho fem omplint tot el tub fins dalt amb oli, i després segellarem el forat per on hem injectat els materials amb calor.
5 Centrifuguem. El producte final serà un tub amb diferents fraccions: a la fase inferior trobarem DNA circular covalentment tancat, més amunt el DNA nicat i a la interfase proteïnes contaminants. Al pellet hi quedarà RNA.
6 Al llarg de la centrifugació el gradient es formarà espontàniament de manera que en acabar el procés hi haurà més CsCl a la part de baix que a la de dalt: la densitat augmenta de dalt a baix del tub. Els diferents components s’aturaran allà on hi hagi una densitat de clorur de cesi igual que la seva densitat intrínseca. El DNA circular covalentment tancat es pararà en una zona més avançada que el DNA lineal, la qual cosa ens indica que és més dens. En el DNA lineal o bé en el circular nicat el bromur d’etidi podrà entrar molt bé i podrà assolir una saturació de fins el 50%. El DNA circular covalentment tancat en presència de bromur d’etidi es saturarà abans, admet un nombre de molècules inferior al del DNA lineal/nicat. La presència d’agents intercalants en el DNA genera buits; és per això que com més molècules tingui un DNA menys densa serà.
DNA lineal/nicat → admet més bromur d’etidi → menys dens.
DNA circular covalentment tancat → adment menys bromur d’etidi → més dens.
El rotor emprat per a l’experiment és el que anomenem “swimming bucket rotor” o de tubs suspesos. Els tubs estan enganxats amb ganxos de ferro i en centrifugar es posen horitzontalment: la densitat màxima de clorur de cesi estarà al fons del tub. El temps per arribar a l’equilibri de densitat amb el DNA és de dies. Podem escurçar-lo posant el rotor a més revolucions, però llavors ens arrisquem a que el clorur de cesi estigui tan concentrat a la part inferior que precipiti. Si una sal precipita pot formar cristallets que impactaran amb el fons del tub amb una energia cinètica molt elevada (recordem que en una centrífuga el que fem és augmentar la gravetat moltes vegades respecte la gravetat terrestre, fins a unes 1000 vegades). Aquest impacte pot trencar el rotor.
Per evitar aquests problemes es van desenvolupar uns rotors de titani massís que no col·loquen els tubs horitzontalment en la centrifugació. Això farà que el gradient no es formi en vertical sinó que ho faci perpendicularment a les parets del tub.
Quan parem el rotor el gradient es col·locarà verticalment.
7 Amb una agulla hipodèrmica es punxa l’oli i s’extreu perquè entri aire a dins del tub.
Convé posar una tira de celo perquè no es facin esquerdes. Seguidament punxem amb l’agulla la banda de dalt de tot (la del DNA nicat), i amb una inclinació adequada podem recollir-ne tot el líquid. Fem el mateix amb la banda de baix, que conté el DNA circular covalentment tancat. I ja està ☻ ...