Tema 6 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Biologia de la Reproducción
Año del apunte 2014
Páginas 13
Fecha de subida 18/02/2015
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

BR- Tema 6   TEMA  6.  ANÀLISI  GENÈTICA  DE   GÀMETES   1. ANÀLISI GENÈTICA D’ESPERMATOZOIDES 1.1. ESTUDIS  CITOGENÈTICS   Primera opció: penetració heteròloga d’oòcits de hàmster sense zona pel·lúcida (prèviament eliminada) o microinjecció a oòcits de ratolí Es basa en penetrar oòcits de hàmster sense zona pel·lúcida amb espermatozoides humans. (S’han d’ajustar les concentracions d’espermatozoides perquè no en fecundin molts).
Els factors de l’oòcit el que causen és , primer de tot, la descondensació del cap de l’espermatozoide i posteriorment la condensació de la cromatina dels espermatozoides en cromosomes.
Al final de la fecundació, s’obtenen dues dotacions cromosòmiques, la de l’oòcit i la de l’espermatozoide, lleugerament separades, ja que hem aturat la cèl·lula després de la penetració (els oòcits fecundats s’aturen, no es deixa que es divideixin, de manera que els cromosomes de l’espermatozoide i oòcit es veuen separats).
Sobre els cromosomes d’aquest oòcit fecundat podem marcar els cromosomes de l’espermatozoide amb diferents tècniques de FISH per veure si hi ha cromosomes reorganitzats, per exemple.
- Eficiència: La penetració heteròloga d’oòcits de hàmster és poc eficient, de cada mostra que analitzem a final potser aconseguim fer 50 cariotips d’espermatozoides, els quals podem analitzar. Per tant, no és factible per aplicació clínica.
En el moment que van aparèixer les ICSI, es van començar a fer servir oòcits de ratolí, en els quals s’introduïa un espermatozoide o dos i llavors se n’observaria la   1   BR- Tema 6 dotació. La foto que apareix a continuació correspon a un oòcit de ratolí fecundat.
Aquest mètode, igual que l’anterior és poc eficient.
Això ha fet que aquestes tècniques només s’utilitzin en recerca no es normal que per saber si hi han anomalies als espermatozoides s’apliqui a les clíniques de fertilitat.
Segona opció: FISH en nuclis d’espermatozoides descondensats • Tractament previ perquè la cromatina super-condensada espermatozoides sigui accessible per les sondes dels Des d’inicis dels anys 90 es disposa d’una altra metodologia més eficient. Aquesta consisteix en aplicar tècniques de FISH en nuclis d’espermatozoides prèviament descondensats, per tant, s’apliquen tècniques citogenètiques interfàsiques.
En els espermatozoides dons, s’apliquen reactius que redueixen els ponts S-S, descondensant la cromatina i fent-la més accessible per les sondes.
Els passos a seguir són: 1. Fixació i extensió: s’extenen i fixen els nuclis en un porta amb Carnoy.
2. Descondensació: els portaobjectes es posen en una solució de descondensació que duu un agent químic que redueixe els ponts disulfur (mercaptoetanol, dictiotrenol). La descondensació es veu quan els caps dels espermatozoides son mes grans, 3. FISH: s’apliquen tècniques de FISH i es fa una avaluació en microscopi de fluorescència.
4. Avaluació en microscopi de fluorescència   2   BR- Tema 6 -­‐ Avantatges: • Un dels seus avantatges és que podem analitzar moltíssimes cèl·lules • Metodologia relativament senzilla • Permet detectar anomalies de baixa incidència En la imatge s’han aplicat sondes centromèriques pel cromosoma 18, X i Y, en diferents colors. (veure FISH a les diapositives).
-­‐ Desavantatges: • És un estudi dirigit, no es poden analitzar tots els cromosomes: només estudiem els cromosomes en funció de les sondes.
• Nombre de cromosomes analitzats limitat, com a molt, 5.
Amb el temps s’ha vist que els avantatges superen les limitacions. Això fa que aquests mètodes s’apliquin tant en la clínica com en la recerca.
-­‐ Candidats per l’aplicació d’aquest mètode: els pacients als que se’ls aplica són: • Portadors d’anomalies cromosòmiques constitucionals: numèriques i estructuralsà volem saber el percentatge d’espermatozoides normals que es fan.
• Pacients infèrtils amb cariotip normalà son individus normals, però pel que sigui causen gàmetes amb anomalies cromosòmiques, per tant, en aquest cas volem veure quina causa de la infertilitat hi ha o Factors masculins: s’ha vist que molts factors masculins (molts homes amb anomalies al seminograma) tenen anomalies cromosòmiques als espermatozoides.
§ En els factors masculins severs, aquestes anomalies cromosòmiques als espermatozoides es fan molt evidents (bàsicament en oligospèrmies).
o Parelles amb avortaments amb repetició o Infertilitat idiopàtica: homes en els quals, fent tots els estudis, no es detecta la causa de la infertilitat.
Els següents grups, només s’utilitzen en recerca, no en les clíniques.
-­‐ Progenitors d’individus afectats per anomalies cromosòmiques/trastorns genòmics: volem saber si hi ha un nombre més elevat d’espermatozoides amb anomalies cromosòmiques -­‐ Post – tractaments oncològics: els tractaments amb radioquimioteràpia poden causar una aplàsia de les cèl·lules germinals.
-­‐ Exposició a tòxics: exposició pesticides, components d’envasos...
Parlarem de què en sabem de tots aquests individus: Portadors d’anomalies cromosòmiques estructurals: tenen un comportament meiòtic particular, sobretot pel que fa a la formació de bivalents, que es formen trivalents, tetravalents o nansa d’inversió. Això   3   BR- Tema 6 dona lloc a un percentatge de gàmetes amb segregacions anormals.
Ens interessa saber quants gàmetes amb anomalies es formen.
• Per tal de fer aquest estudi ens cal utilitzar una FISH amb una combinació de sondes adient.
o Si tenim una translocació 13-14 hem de posar sondes per seguir els cromosomes 13 i 14.
o Si les translocacions son recíproques, hem de fer combinacions de sondes centromèriques i subtelomèriques.
o Si estem seguint inversions, com sabem que el producte anormal son del/dupl hem de aconseguir utilitzar sondes subtelomèriques pel cromosoma implicat.
• • Avaluació del comportament meiòtic dels cromosomes implicats en la reorganització Avaluar altres cromosomes no implicats en la reorganització (ICE): La presència d’anomalies cromosòmiques fa que es donin factors/efectes intercromosòmics, és a dir que la reorganització afecti a la segregació d’altres cromosomes. Per tant, si podem, fem FISH amb altres cromosomes que es poden veure afectats.
Normalment s’avaluen aquells que estan més implicats en aneuploïdies humanes: 18, 13, 21 i cromosomes sexuals.
Resultats (publicats i acceptats).
-­‐ Les translocacions robertsonianes es comporten d’una manera mes o menys homogènia § al voltant del 84% d’espermatozoides de portadors de translocacions robertsonianes son normals.
§ Per tant el 16% son anormals -­‐   Translocacions recíproques.
§ 43% de gàmetes normals o equilibrats.
§ En alguns casos especials, aquest percentatge s’escapa d’aquest rang (hi ha més o menys espermatozoides portadors d’anomalies estructurals).
4   BR- Tema 6 Alguns d’aquests casos són les robertsonianes que tenen una satèl·lits mes grans, donen uns percentatges mes elevats de gàmetes anormals.
En general, hi ha variabilitat, que depèn de la reorganització -­‐ Portadors d’inversions: a grans trets s’ajusten a l’esperat.
o Al voltant del 85% dels espermatozoides són normals però hi ha un rang de ± 16%, que depèn de la mida de la inversió.
• En aquells individus amb una inversió molt gran, hi haurà molts recombinants • En aquells amb una inversió petita, hi haurà menys recombinants • En aquells individus amb una mida d’inversió intermèdia es on això pot variar més, per tant son els que s’estudien, per tant es fan estudis amb el 40-50 % del cromosoma invertit.
-­‐ Al valorar l’efecte intercromosòmic (ICE): o al voltant del 40% d’individus portadors de translocacions robertsonianes tenen un efecte intercromosòmic afegit.
o al voltant del 44,5% d’individus portadors de translocacions recíproques tenen un efecte intercromosòmic afegit.
o al voltant del 14% d’individus portadors d’inversions tenen un efecte intercromosòmic afegit.
En tots els casos es miren, com a mínim els cromosomes 21, X i Y.
Cal aplicar aquests estudis rutinàriament en les clíniques? Si coneixem aquests resultats cal que avaluem els espermatozoides d’un home amb alteracions cromosòmiques? Hi ha una certa controvèrsia.
o En aquests casos, si sabem que un home porta una translocació i s’aconsegueix un embaràs, el que recomanarem és un diagnòstic prenatal.
o Però hi ha casos en que els homes volen saber el percentatge d’espermatozoides anormals, llavors bé li podem recomanar la donació d’espermatozoides o bé li podem recomanar el diagnòstic preimplantacional.
El que es farà quan un home porta una anomalies cromosòmica dependrà del centre.
  5   BR- Tema 6 Portadors d’anomalies cromosòmiques numèriques -­‐ Síndrome Klinefelter (47, XYY): utilitzant una combinació de sondes adients (sondes del X i Y i per algun altre cromosoma, ja que així tenim informació addicional, normalment s’avalua el cromosoma 18), s’avalua el comportament meiòtic dels cromosomes implicats i es solen avaluar altres cromosomes (per detectar ICE), com el 13 i 21.
Això nomes es fa en casos de Klinefelter quan produeixen espermatozoides, es a dir, quan són mosaics.
o El seu comportament és variable, poden tenir tant molts problemes com no estar diagnosticats.
o Analitzant les poblacions de Klinefelter s’ha vist que hi ha un increment d’espermatozoides amb disomies per als cromosomes sexuals (XX, XY i alguns YY). Hi ha molta variabilitat interindividual: § 0.7-20% d’espermatozoides amb disomies dels cromosomes sexuals (aprox 0.4% a la població control) § 0.03-4,2% d’espermatozoides diploides (aprox 0.25% a la població control) Hi ha molta discrepància entre autors pel que fa a la competència meiòtica de les línies aneuploides i l’origen dels espermatozoides (podrien ser mosaics en gònades???. No està clar quines son les cèl·lules que generen les anomalies, si les de Klinefelter o les normals.
Pacients infèrtils amb cariotip normal Aquests individus es pressuposa que tenen un comportament anormal en línia germinal.
S’apliquen en: -­‐ Factors masculins (oligospèrmia) -­‐ Parelles amb avortaments per repetició -­‐ Fertilitat idiopàtica -­‐ FISH pels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21: S’ha vist que utilitzar una bateria de sondes per (X, Y, 18, 13 i 21) és indicatiu d’un procés meiòtic normal o lateral. Inclús hi ha autors que proposen analitzar menys cromosomes. Si veiem anomalies en aquests, es indicatiu que el procés meiòtic no s’està donant be -­‐ Avaluació de les aneuploïdies i diploides en els cromosomes estudiats Resultats: -­‐ La població és heterogènia -­‐ Hi ha molta variabilitat interindividual o Aneuploïdia. rangs que van de valors normals al 20% d’espermatozoides amb aneuploïdies (x130 vs controls)   6   BR- Tema 6 o Diploïdia: els rangs que van de valors normals al 10% d’espermatozoides diploides. Aquests, si hi ha fecundació, generen un triploide. La majoria de triploides moren, tot i que hi ha un percentatge que arriba a néixer (però aquests moren molt aviat).
o El 15 % presenten increments respecte la població control.
Alguns investigadors creuen que els estudis citogenètics tenen un valor clínic: Permeten determinar el risc de transmissió d’anomalies cromosòmiques, diagnòstic d’infertilitat, predictius d’èxit en TRAs (si el percentatge de gàmetes anormals es molt elevat l’èxit és baix), consell reproductiu...
Els autors consideren que aquest estudi té molt valor clínic, de manera que és un procediment que ofereixen la majoria de centres de reproducció assistida.
A nivell de recerca, l’estudi citogenètic sobre els altres individus dels que hem parlat (que es presenten a continuació) es fa però mes aviat per buscar origen, mecanismes implicats., factors o estimació del risc de recurrència.
Els individus en els que se’ls aplicarien aquestes tècniques en recerca serien: -­‐ -­‐ -­‐ Progenitors d’individus afectats per anomalies cromosòmiques i trastorns genòmics Post-tractaments oncològics Exposició a tòxics   1.2. ESTUDIS  DE  DANY  AL  DNA   S’adrecen bàsicament a avaluar la integritat del DNA, són bàsicament estudis de fragmentació.
Etiologia  de  la  fragmentació:     És MULTIFACTORIAL. El DNA fragmentat en els espermatozoides es pot originar: -­‐ Per factors intrínsecs a l’espermatogènesi: o Apoptosi abortiva: Les cèl·lules s’han escapat de la inducció de l’apoptosi: tenen el DNA fragmentat però continuen el cicle cel·lular.
o Talls no reparats durant la substitució de les histones per protamines -­‐ Per agents externs: o Endonucleases i caspases endògenes que tallen el DNA o Inducció de fragmentació per radioquimioteràpia o Dany acumulat per agents tòxics -­‐ Generats a l’epidídim (durant maduració): a l’epidídim s’hi produeixen moltes ROS o Efectes de les ROS (fragmentació via ROS)   7   BR- Tema 6   Tractaments  per  disminuir  la  fragmentació:   -­‐ -­‐ Vitamines: només actuen en l’epidídim, per tant nomes afectarem a la fragmentació que causen les ROS És molt difícil determinar l’origen de la fragmentació i per tant, el tractament es difícil.
Detecció  de  la  fragmentació:   COMET  (single  cell  electrophoresis):  Es tracta de fer una electroforesi en cèl·lules úniques.
Partim de portes coberts amb agarosa, on s’hi posen extensions d’espermatozoides. A continuació es tenyeixen amb un fluorocrom i es fa una electroforesi del portaobjectes.
à Si apareixen cues en l’espermatozoide es que hi ha fragmentació. Com més llarga la cua, més fragmentació.
La cua l’anomenem cua de cometa.
TUNEL  (terminal  deoxynucleotidyl  transferase  dUDP  nick  end  labeling): S’utilitzen desoxinucleòtids terminals (dUTP) marcats amb fluorescència i una transferasa terminal (TdT).
Els desoxinucleòtids s’addicionen terminalment (a l’extrem3’-OH) gràcies a l’enzim TdT.
L’avaluació de la fluorescència pot variar: hi ha grups que avaluen els espermatozoides amb microscopi de fluorescència i altres en un citometria de flux.
Els nucleòtids s’addicionen o no en funció de si hi ha fragmentació o no: si hi ha trencaments hi ha extrems i per tant addició de nucleòtids.
Com més fluorescència hi hagi, més fragmentació   8   BR- Tema 6 SCSA:  sperm  cromatin  structure  assay   Consisteix en la desnaturalització de la cromatina espermàtica en pH molt àcid (pH aprox 1).
La desnaturalització va ligada amb: -­‐ Fragmentació del DNA: el DNA fragmentat és més làbil en aquestes condicions de pH. Un DNA íntegre, en aquest pH es veu poc descondensat.
-­‐ Protaminització errònia Així doncs, aquest mètode ens permet tant valorar la fragmentació del DNA i protaminització.
Un cop aplicat el pH, el següent que es fa és una tinció amb un colorant metacromàtic. Aquest tint, en funció de com s’incorpori al DNA dona lloc a un color o un altre.
Normalment es fa servir taronja d’acridina: -­‐ si el DNA és de doble hèlix (no desnaturalitzat), s’hi intercala en forma de monòmers i emet llum fluorescent verda. (λ 515-530 nm) -­‐ si el DNA és de cadena simple (desnaturalitzat) s’hi intercala en forma d’agregats i emet fluorescència d’un color vermell-taronja. (λ ≥ 630 nm) El color que desprèn el taronja d’acridina s’avalua amb microscopi de fluorescència o citometria de flux (menys comú).
DNA normal: color verd DNA fragmentat: color taronja   9   BR- Tema 6 SCD  (sperm  chromatin  dispersion  test) El test més comú és Halosperm, que és un kit patentat per una empresa espanyola.
En aquest cas es fa una estensió en un porta d’agarosa i a continuació un tractament amb pH àcid i una desprotaminització.
-­‐ Els espermatozoides que tenen el DNA fragmentat mantenen el seu nucli compactat, no alliberen bucles de cromatina ni generen una aureòla.
-­‐ Els espermatozoides que no tenen el DNA fragmentat no mantenen el seu nucli compactat, alliberen bucles de cromatina i generen una aureòla de dispersió.
L’avaluació dels portes es fa en un microscopi de fluorescència o bé un microscopi de camp clar.
DNA normal: no aureòla DNA fragmentat: aureòla LIMITACIONS -­‐ Les metodologies són molt diferents: així doncs, no sempre indiquen el mateix tipus de dany -­‐ Condicions d’anàlisi i tractament de les mostres podria afectar als resultats: en aquests anàlisis, les condicions son extremes, el que ens podria generar artefactes.
-­‐ Els valors de cutoff (llindar a partir del qual la mostra es normal o anormal) i mètodes per establir cutoff varien molt entre estudis i centres o En TUNEL i SCD (Halosperm) el cutoff sol ser 33% (si està per sota el 33%, els espermatozoides són normals i si està per sobre, són anormals).
-­‐ No consens en establir un valor pronòstic a partir d’un determinat percentatge de dany.
-­‐ Majoria de series: més de 33% d’espermatozoides amb DNA fragmentat à poques possibilitats d'embaràs evolutiu.
-­‐ El dany reparable és difícil d’estimar, ja que els oòcits en si tenen una certa capacitat de reparació el DNA d’espermatozoides, tot i que no se sap fins a quant.
  10   BR- Tema 6 Fins ara, els estudis clínics que hi ha diuen que, el dany al DNA està associat a: -­‐ Menor taxes d’embaràs natural, inseminació artificial (IUI) i in vitro convencional (FIV).
-­‐ No hi ha relació entre fragmentació del DNA i taxes d’embaràs en ICSI -­‐ En tots els casos la fragmentació del DNA està relacionat amb el nombre d’avortaments (més avortaments si el DNA està fragmentat) VALOR CLÍNIC: Així doncs, normalment quan es fa l’estudi d’infertilitat en l’home, es fa un anàlisi de fragmentació del DNA. Ens pot ajudar en el diagnòstic de la infertilitat, predictiu d’èxit de TRAs i consell reproductiu.
1.3. ALTRES  BIOMARCADORS     Parlarem només de recerca, és a dir, aquells biomarcadors amb els que s’està treballant, aquest són: -­‐ -­‐ -­‐   Metilació del DNA: una metilació anòmala del DNA pot explicar un problema reproductiu en un pacient.
o S’han intentant fer unes plataformes (kits) per unes determinades regions que permetin identificar metilacions anòmales.
o Metilació/acetilació d’histones: o Les restes d’histones retingudes en el DNA de l’espermatozoide tenen una marca epigenètica important. Segons la metilació/acetilació d’aquestes histones quan el DNA de l’espermatozoide arribi a l’oòcit (estat de dos pronuclis), es condicionarà l’expressió gènica quan comenci el desenvolupament de l’embrió Proteoma d’espermatozoide: s’agafen els espermatozoides es lisen i es posen les proteïnes en un gel 2D i s’analitzen.
o Algunes alteracions del seminograma estan relacionades amb mancances de certes proteïnes en alguns espermatozoides (per exemple, en els espermatozoides que tenen manca d’acrosoma, hi ha proteïnes diferencialment expressades).
o Això explica el mal funcionament dels espermatozoides, més que unes conseqüències per a l’embrió.
11   BR- Tema 6 -­‐ Transcriptoma espermatozoide: s’extreu RNA i es seqüencia per RTPCR, RNA-seq, Microarray.based analysis o S’ha vist que hi ha diferents tipus de RNA en l’espermatozoide, que aporten molt al desenvolupament del zigot. Bàsicament, l’espermatozoide té: § rRNA § RNA mitocondrial (a la beina de mitocondris) § RNA codificants • Alguns mRNA dels espermatozoides, quan arriben a l’oòcit son transcrits per aquests.
§   RNA no codificantsà miRNA i piRNA són bàsicament els que s’estudien, ja que es veu que la seva presència pot condicionar al desenvolupament de l’embrió.
• Hi ha mRNA materns transcrits degut a la regulació per miRNA paterns • Alguns pre-miRNA poden ser activats per la maquinària per l’oòcit • Alguns miRNA regulen l’expressió de gens de l’oòcit • Hi ha altres fragments non-coding que participen en la regulació de l’expressió gènica de l’oòcit.
12   BR- Tema 6 Els RNA tindrien una acció de regulació de l’expressió en les primeres etapes del desenvolupament embrionari.
(mirar un esquema diapos) -­‐ Altres parts de l’espermatozoide que participen en les primeres etapes del desenvolupament embrionari o Proteïnes de la theca perinuclear: la theca perinuclear és una xarxa de proteïnes entre l’acrosoma i el nucli de l’espermatozoide i que es projecta fins al coll de l’espermatozoide. Aquesta estructura dóna estabilitat al cap de l’espermatozoide i sobretot al nucli. (És per aquesta theca que no es vesícula tota la part de l’acrosoma en la formació d’aquest) § Aquestes proteïnes, sembla que son fonamentals per començar a estructurar el citoplasma del zigot (importants en l’organització citoplasmàtica del futur zigot).
o Loops de cromatina en l’espermatozoide (organització de la cromatina). En funció d’on estigui una determinada regió d’un DNA espermàtic, hi haurà una transcripció abans o després. Depèn d’on es situïn les protamines i els toroides, es podran expressar uns gens o no en les primeres etapes del desenvolupament.
Totes les tècniques el que fan és “carregar-se” l’espermatozoide, per tant, nomes s’analitzen per tal de fer el diagnòstic. Però NO ES PODEN UTILITZAR POSTERIORMENT ELS ESPERMATOZOIDES que son bons per dur a terme TRAs.
  13   ...