4. Mecanismes de reparació del DNA (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura mutagenesi
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 01/04/2016
Descargas 16

Vista previa del texto

4. MECANISMES DE REPARACIÓ DEL DNA A vegades, alguns autors quan parlen de mecanismes de reparació inclouen tot allò que protegeix el DNA, fins i tot allò que no es reparació com a tal.
Altres autors consideren que es dóna un mecanisme de reparació quan el dany inicial ha estat eliminat després d’un procés d’escissió.
En ocasions, quan es fa referència a situacions en què no cal tallar el DNA sinó que és l’acció d’enzims específics el que elimina el dany primari, es parla de mecanismes de reversió del dany.
Però, en definitiva, tot està lligat.
Molts mecanismes de reparació estan conservats evolutivament, però existeixen altres que són particulars de determinats grups filogènics.
1 Qualsevol cèl·lula conté una quantitat important d’aigua. A aquesta aigua també hi ha metalls i, fonamentalment, pel que fa a la producció d’espècies reactives d’oxigen, hem de pensar en els metalls de transició (com el ferro, per exemple). Si tenim aigua i metalls de transició es generen les espècies reactives d’oxigen.
A vegades es produeixen lesions oxidatives ja que la respiració cel·lular genera espècies reactives d’oxigen (ROS) que alteren les bases. Les bases atacades per radicals lliures d’oxigen normalment canvien l’aparellament.
L’enzim superòxid dismutasa d’E. coli que converteix els superòxids en peròxids d’hidrogen (aigua oxigenada). Aquests peròxids són neutralitzats per les catalases i, per tant, el dany oxidatiu no comporta conseqüències mutagèniques. Això no és ni una reversió ni una reparació sinó un mecanisme de destoxificació.
El DNA pot ser alquilat de manera espontània o per acció d’agents alquilants. Quan hi ha grups etil o metil al DNA els grups poden ser segrestats per les alquil transferases. Aquest mecanisme no és una reversió perquè no hi ha cap escissió.
A bacteris, una des les accions més importants a nivell genotòxic de les radiacions UVA és l’aparició de dímers de pirimidina. Dir que un dímer és una mutació és un error perquè no hi ha canvi ni quantitatiu ni qualitatiu, però sí pot conduir a mutacions si no és reparat. L’acció de les fotoliases és el mecanisme encarregat de solucionar els dímers de pirimidina. Les fotoliases són els enzims encarregats de reconèixer el dímer. La seva particularitat és que només el poden desfer en presència de llum. No obstant, la tasca de reconeixement del dímer la poden dur a terme a les fosques.
2 En el cas que s’hagin format aductes, l’única manera és eliminar per escissió de nucleòtids.
A la imatge veiem un DNA que pot tenir uracils com a conseqüència de les desaminacions de les citosines, per exemple. D’entrada, l’uracil no és un constituent normal del DNA, i la seva eliminació és molt neta perquè hi ha enzims específics, uracil-DNAglicosilases, que trenquen l’enllaç amb el sucre i l’uracil queda lliure. A la cadena complementària hi hauria la base correcta que permetria la completa reparació d’aquesta lesió. Així, aquests tipus de danys no condueixen normalment a errors.
Existeixen situacions que impliquen mecanismes posteriors a la replicació i, a vegades, hi participen processos recombinacionals.
En el cas dels bacteris, quan els nivells de dany són tan grans que no poden ser reparats pels mecanismes convencionals, s’indueixi el sistema SOS, que permet la continuïtat de la cèl·lula encara que incorpori moltíssimes mutacions. En realitat, aquest fet és una mena de contrasentit.
3 A la situació inicial tenim C—G. Aleshores, a aquesta cèl·lula es genera un dany oxidatiu perquè hi ha espècies reactives d’oxigen. Conseqüentment, la guanina, que es veu molt afectada pel dany oxidatiu, passa a ser GO (guanina oxidada). Així, ara tenim a la cèl·lula una base que esta modificada com a conseqüència del dany oxidatiu. Moltes vegades en el procés de replicació aquesta base oxidada no es veu modificada, de manera que continua a les següents replicacions. Això és perquè aquesta modificació no és tan dramàtica com per a haver-hi urgència en eliminar-la.
Enlloc d’aparellar-se amb una C, la GO s’aparella amb una A. Aleshores, és en aquesta situació quan la cèl·lula reconeix que la GO és incorrecte. Aleshores, actua l’enzim formado-pirimidina-DNA glicosilasa que elimina la GO..
Si eliminem l’A, tornem a tenir un GO, hi ha hagut un mecanisme d’entrada reparacional però no està recuperant la informació inicial.
Davant d’un cert pas, encara que hi hagi mecanismes que actuen amb més preferència, no es pot saber quin actuarà. A més, també pot haver-hi casos en què es dóna reparació però el resultat no és la seqüència inicial perquè la reparació no ha implicat la base alterada originalment.
El DNA pot ser alquilat. Les alquilacions més importants són les etilacions i les metilacions a nivell de carcinogènesi.
Les alquil-transferases, etil-transferases o metil-transferases, són enzims específics que reconeixen els grups alquil. La metil transferasa s’incorpora a la base metilada, atrapa el metil amb la cisteïna i l’allibera de la G. Si el nivell d’alquilació no és molt gran, la cèl·lula té els enzims suficients com per a reparar aquests tipus de lesions, que són reversions. Quan hi ha molt dany per alquilació, els enzims estan saturats i caldria tallar. Si hi ha tant dany, la cèl·lula entrarà en apoptosi.
Quan parlem de respostes adaptatives veiem que aquella cèl·lula que ha estat exposada a uns nivells alts de radiació, d’agents alquilants... presenta menys efectes mutacionals del que caldria esperar.
El que ha passat és que d’alguna manera s’ha “acostumat”, però realment ha sigut que s’han disparat uns mecanismes per a fer front al dany. Es tracta d’un sistema de tipus reguló complex. El que veiem a la imatge de la dreta es correspon a la resposta adaptativa de bacteris enfront agents alquilants.
Si la cèl·lula no està molt danyada, la quantitat d’enzims que produeix és molt poca. Imaginem que hi ha un factor que indueix la transcripció del gen, i el més probable és que el senyal d’inducció sigui, 4 precisament, l’alquilació del senyal. Un cop tenim el senyal que indueix el sistema, es transcriu molt més aquell gen, donant lloc a un augment en la concentració de l’enzim.
Aquest mecanisme és fàcil d’entendre a bacteris perquè són molt més dependents del medi que nosaltres. Així, succeeix de manera molt ràpida. A eucariotes no és un procés tant immediat.
La imatge que veiem a continuació és un esquema general de reparació per escissió (NER). Es fa un tall a banda i banda del dany i s’elimina un fragment més o menys llarg. Possiblement, a l’omplir el forat no s’incorpori cap base errònia, però no ho podem assegurar. La reparació per escissió pot reparar bé o pot produir error (propensa a error).
Encara que s’hagi omplert de manera correcta copiant la cadena sencera, perquè allò sigui un DNA ha d’actuar la lligasa perquè sinó hi ha una discontinuïtat. La lligasa no és un enzim de reparació però és fonamental la seva actuació.
Hi ha individus que presenten dèficits molt importants en reparació i, quan estudies la base molecular, veus que els enzims de reparació els tenen correctament però tenen nivells baixos de lligasa.
Quan parlem d’escissió de bases (BER) es tracta d’un mecanisme molt puntual i senzillament afecta a la base danyada. Si eliminem la base alterada hidrolitzant-la generarem un lloc AP. Però com a la cadena complementària hi ha la base correcta, d’entrada no donarà llocs a alteracions. Si l’alteració d’aquella base fos important, com per exemple, un adducte, no tindríem BER, sinó que tindríem un mecanismes NER.
La hidròlisi de la base no comporta una gran modificació que impliqui una distorsió important de la molècula de DNA.
Quan generem un lloc AP tampoc estem segurs de que no condueixi a cap mutació.
5 T—G no és una unió correcta, és un mismatch. No sabem quina és la cadena vella, de manera que en principi no podem discriminar quina base és la bona. A l’exemple s’elimina la G i es restaura la situació inicial.
De manera natural o espontània, aquests mismatchs es poden incorporar durant la replicació. Si incorporem una lletra incorrecta, d’entrada no necessito reparar perquè la polimerasa ho pot corregir (mecanisme de correcció en l’edició del missatge). Com l’aparellament de bases és molt específic, és una situació fàcil de solucionar sempre i quan estiguem segurs de quina de les dues cadenes hem de canviar.
al DNA dels bacteris hi ha unes seqüències GATC que estan metilades. Aquesta metilació permet discriminar quina és la cadena vella i quina és la nova, de manera que es pot corregir correctament la base errònia. Imaginem que quan la cèl·lula s’adona que ha de reparar, ja ha metilat la cadena nova, de manera que ja no pot diferenciar la nova de la vella. Aleshores, repararà l’error segons li sembli, tenint un 50% d’encert i un 50% d’error.
La reparació de falsos aparellament a bacteris ja fa molts anys que està estudiada i es coneix bastant bé.
A eucariotes no és tant senzill. Hi ha reparació de falsos aparellaments, però ningú ha deixat clar si hi ha un mecanisme específic per a reconèixer quina és la base errònia, per a discriminar on ha de reparar.
A vegades, aquestes reparacions arbitràries no tenen tanta importància en el fons, no sempre un error en la reparació ha de tenir conseqüències perquè el codi genètic està degenerat.
A la imatge passem d’una molècula de DNA normal a una amb dímers de timina. Quan la molècula repliqui, la DNA polimerasa no reconeixerà els dímers i deixarà dos forats. Davant d’aquesta situació en què cap de les 4 cadenes són correctes, es pot donar un fenomen de recombinació generant una molècula normal i una altra danyada. Aquest mecanisme de reparació està associat a la replicació i permet obtenir DNA sense cap canvi.
Això ens diu que enzims que en un principi els classificàvem com enzims per recombinació poden jugar algun paper en un mecanisme de reparació.
6 Sistema SOS Aquí tenim un esquema que fa referència al mecanisme SOS, que és exclusiu de bacteris. És una mena de reguló que respon quan el cromosoma bacterià ha rebut tant dany que els mecanismes de reparació convencionals no el poden reparar. La inducció del sistema SOS permet la supervivència del bacteri tot i produir-li moltes mutacions.
El gen lexA codifica per a la proteïna LexA, que reprimeix el sistema SOS.
La proteïna RecA activada catalitza la proteïna LexA.
Si hi ha dany, RecA* hidrolitza LexA de manera que aquesta proteïna no pot inhibir el sistema SOS i aquest s’indueix.
Una cèl·lula pot aturar temporalment el seu cicle cel·lular (G0) fins que deixi d’estar exposada als factors genotòxics, pugui reparar i, aleshores, reiniciar la proliferació cel·lular. En un organisme pluricel·lular això no té cap importància perquè hi ha moltíssimes cèl·lules.
Aquest mecanisme, present a E. coli i altres bacteris relacionats, actua quan al DNA hi ha molts errors, com buits, dímers o altres distorsions, que dificulten la replicació.
Aleshores, el bacteri indueix l’expressió d’uns 25 gens, els productes dels quals permeten que la replicació es produeixi en aquests tipus de lesions, a costa de la seva fidelitat.
La transcripció dels gens implicats en la resposta és regulada, al menys en part, per un repressor comú la proteïna LexA, producte del gen lexA. Entre aquests gens hi trobem els següents: recA, uvrA, uvrB, uvrD, sulA i sulB.
El sistema implica la proteïna RecA. Aquesta proteïna RecA és activada pel DNA de cadena senzilla, interacciona amb la LexA i causa la seva escissió, suprimint la seva activitat repressora i induint d’aquesta manera la resposta. Es tracta d’un sistema de reparació propens a error.
La denominació SOS és deguda a que és l’últim recurs que té la cèl·lula per minimitzar el dany en el seu DNA.
7 Quan s’ha activat el sistema, la forca de replicació en comptes d’aturar-se perquè la cadena motlle conté múltiples errors, avança sobre la regió afectada. Això és possible gràcies a que els enzims dels sistema SOS tenen condicions molt laxes pel que fa a l’aparellament de bases i afegeixen nucleòtids molt sovint de manera incorrecta. A més a més, el sistema corrector de proves de la polimerasa també està relaxat per tal de permetre que la polimerització es produeixi malgrat la distorsió existent.
Per les seves característiques, la reparació SOS és mutagènica però permet que la cèl·lula sobrevisqui al dany en el DNA.
La finalitat de SOS és poder replicar, però durant la replicació es produeixen molts errors perquè les polimerases són poc fidels i els enzims de reparació no actuen correctament. Així doncs, el mecanisme SOS és un mecanisme de reparació però pel que fa a la integritat del DNA, ja que sí que omple tots els forats però, alhora, incorpora molts errors.
A eucariotes i llevats hi ha uns certs gens que normalment no funcionen, i que en condicions adverses (radicació, genotoxines) indueixen un procés de reparació. No obstant, no és el sistema SOS.
Regulació de la resposta als agents que causen dany genètic a eucariotes A llevats, s’ha demostrat l’existència de gens induïbles per l’exposició a genotoxines, però no s’ha posat de manifest el funcionament d’un reguló equivalent al del sistema SOS bacterià.
Existeixen gens clarament involucrats en la mutagènesi: RAD (radiation sensitivity), encarregat de la reparació per escissió de nucleòtids. Exemple: el RAD51 és el gen humà que codifica una de les proteïnes més importants implicades en la reparació de trencaments de doble cadena.
Els membres de la família RAD51 són homòlegs als RecA bacterians i Rad51 dels llevats.
RNR (ribonucleòtid reductasa) i POL1 (polimerasa α), possiblement involucrats en la reparació per recombinació.
DIN (damage inducible) és induït per danys al DNA però no es coneix la seva funció.
En mamífers, a més del gens de reparació, hi ha altres gens induïbles com són els responsables dels factors de transcripció, de creixement, de protecció i de proteïnes associades amb la inflamació. Hi ha molts gens implicats en processos que, en últim terme, estan lligats tant a la mutagènesi com a la carcinogènesi. Són gens que, tot i que tinguin un paper, en casos extrems poden tenir un paper addicional (sobreexpressió...).
Aturada del cicle cel·lular com a resposta al dany genètic.
Sempre que analitzem cèl·lules apoptòtiques detectarem dues coses: nivells oxidatius grans i trencaments de doble cadena. Impliquen també un condensació del nucli i de la cèl·lula.
Aquesta cèl·lula apoptòtica, finalment, és fagocitada. Això és molt important perquè la fagocitosi implica que l’apoptosi no genera cap procés inflamatori.
Si es moren les cèl·lules, però no per una mort programada, no són fagocitades i, aleshores, generen inflamació.
Alguns autors consideren que una inflamació continuada podria conduir a una carcinogènesi.
8 ...