DGM- Tema 10. Molecular genetic diagnosis of fanconi anemia (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 19
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls TEMA 1- MOLECULAR GENETIC DIAGNOSIS OF FANCONI ANEMIA L’Anèmia de Fanconi és una malaltia hematopoiètica. Hauria de considerar-se un síndrome de reparació del DNA. Estem exposats a moltes fonts de mutació, tan intrínseques (reaccions metabòliques espontànies...) com externes. No obstant, tenim molts mecanismes de reparació per fer front a això: Els defectes en aquests mecanismes de reparació donen lloc a diferents síndromes.
• • • • • Xenoderma pigmentosum: Tenen melanoma si s’exposen al sol.
Síndrome Cockayne: Relacionada amb mecanismes d’escissió de nucleòtids Síndrome de Bloom: Problema amb processar trencaments de doble cadena. Síndrome de fragilitat cromosòmica Síndrome de Seckle: Síndrome de fragilitat cromosòmica Atàxia: Problema amb processar trencaments de doble cadena causats per radiació. Síndrome de fragilitat cromosòmica Tots aquests estan causats per mutacions en diferents gens i afecten a diferents vies de reparació Anèmia de Fanconi La producció de HSC (hematopoyetic stem cells) no està funcionant correctament pels problemes de reparació del DNA i, com a conseqüència, tenen una anèmia molt forta pel que fa al baix número de totes les cèl·lules sanguínies (no només els glòbuls vermells).
La raó de la pancytopenia (baix número de totes les cèl·lules sanguínies) és que la medul·la ossia no funciona correctament (Bone marrow failure).
• • • És una malaltia autosòmica recessiva en el 99% dels casos, però existeixen diferents subtipus genètics i un d’ells és el lligat al X.
Malaltia molt rara: freqüència 1/400.000.
Altament heterogènia, tant genètica com clínicament.
1 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls El problema principal en aquesta malaltia és sanguini, però també està associat a malformacions, no osbstant, aquestes no sempre estan presents (1/3) o o o o o o o o • • Malformacions als polzes i als dits. (de les més freqüents) Altres malformacions esquelètiques (braços molt curts).
30% dels pacients amb anomalies a ronyó i cor.
Taques marró a la pell.
Microcefàlia i microftàlmia.
Microsòmia (són baixets) i baix pes Problemes gastrointestinals Hipogonadisme en homes (testicles petits) Fenotip clínic o En algunes famílies, els portadors tenen certa predisposició a càncer de mama i ovaris (vies de Fanconi relacionades amb les de càncer de pit).
o Cèl·lules sensibles a quimioteràpia i radioteràpia, el que fa difícil el tractament.
o Resposta inflamatòria anormal: alta expressió de citoquines à molt tòxiques per les cèl·lules de la medul·la (bone marrow).
o Problemes endocrins (deficiència hormona del creixement) o ...
Fenotip cel·lular o Alta producció de citoquines.
o Inestabilitat cromosòmica.
o Cicle cel·lular alterat.
o Sensibles a oxigen (dany oxidatiu).
o Sensitivitat a aldehids.
o Dèficit en la reparació de ruptures dobles del DNA (DNA interstrand crosslinks).
o Excés d’apoptosi 2 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls Les característiques més importants a l’Anèmia de Fanconi són el desordre sanguini (bone marrow failure) que va lligat a certes malformacions. Hi ha moltes síndromes en les quals el seu fenotip inclou bone marrow failure i malformacions, però si a més presenten inestabilitat/fragilitat cromosòmica podem sospitar amb més seguretat que es tracta d’anèmia de Fanconi. Per tant, la forma de diagnòstic és la detecció de fragilitat cromosòmica.
• • • A edats primerenques sovint els pacients no són diagnosticats, sinó que ho són més tard, quan la bone marrow failure es fa evident.
S’està millorant la mortalitat gràcies a diagnòstics temprans i millores dels protocols de transplantament de medul·la òssia.
A l’adolescència hi ha un increment de tumors sòlids, especialment de SCC (carcinoma de cèl·lules escamoses) a les regions de coll i cap.
Com a conseqüència de tots aquests problemes, passen molt temps a l’hospital.
Bone marrow failure in Fanconi Anemia (BMF) • • En un individu sa, la majoria de cèl·lules sanguínies (HSC) són generades durant el desenvolupament embriològic i es va mantenint la producció al llarg de la vida més o menys constant, amb un petit descens a mesura que avança l’edat.
En individus amb Fanconi, hi ha baixa producció de HSC durant el desenvolupament embriològic, de manera que, al néixer tenen molt poques HSC. Però en tenen suficients per produir cèl·lules sanguínies (no són diagnosticats). Amb el temps, hi ha un descens de HSC, de manera que sobre els 7 anys no poden produir més cèl·lules sanguínies, cosa que porta a BMF.
Càncer in Fanconi Anemia Si tenim mutacions en gens de reparació del DNA, hi ha inestabilitat genètic i això facilita l’apoptosi.
Les cèl·lules que superen la mort cel·lular poden causar càncer.
Això pot passar tant a nivell somàtic com a nivell germinal.
3 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls Importància de la via BRCA A l’Anèmia de Fanconi, la via BRCA és important en la generació del càncer.
• • • Protecció davant càncer.
Protecció i manteniment de HSC.
Reparació de interstrand crosslinks, els quals inestabilitzen les replication forks.
Causes de la Bone Marrow Failure Hi ha un problema en poder estudiar la malaltia perquè els ratolins knock-out utilitzats com a model, no desenvolupen mai bone marrow failure, sinó només un descens en la producció de HSC.
Aldehids com a font endògena de dany del DNA i fallada medul·lar? De manera natural, al nostre cos es productixn aldehids, que són processats per l’ALdh2 (aldehid deshidrogenasa).
- En el casos normals, els aldehids produeixen dany al DNA que es pot reparar.
- En l’anèmia de fanconi, el dany produït pels aldehids no es pot reparar, pel que les cèl·lules moriran (algunes degeneren en leucèmia).
Per tant, el metabolisme dels aldehids és molt important i probablement el seu mal processament porta a BMF en pacients amb anèmia de Fanconi.
Com moren les HSC? Hi ha diferents models: 1. P53 és un mediador de l’apoptosi cel·lular.
2. Les Citoquines produeixen mort cel·lular.
3. Model integrat amb stalle replication forks.
Interstrand Crosslink Repair (ICLR) Mitomycin-C (MMC) és un reparador de ICL (interstrand crosslinks).
- Funció normal: quan hi ha una unió intercadena (ICL) la forquilla se replicació es queda col·lapsada, per tant, calen enzims de la via de Fanconi que permetin l’alliberament dels ICL. El 4 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls - gap que queda és omplert per síntesi a partir de l’altra cadena. Finalment tenim recombinació homòloga, la qual dóna lloc a dues cromàtides normals si la via de Fanconi funciona bé.
En anèmia de Fanconi la reparació d’aquests gaps no funciona correctament, cosa que porta a trencaments cromatídics (cromatid breaks). Si es fusionen cromosomes amb aquests trencaments, es poden formar cromosomes quadriradials, cosa que s’aprofita al realitzar el diagnòstic de la malaltia.
o La majoria de cèl·lules acumularan errors durant la fase S, cosa que portarà a l’activació del punt de control, quedant aturades a la fase de G2.
Chromosome fragility in Fanconi Anemia (BMF) - Tipus de trencaments cromosòmics presents a FA: diiradials, multiradials, quadriradials.... Es important diferenciar aquests de dos cromosomes solapants.
A les imatges (31-34) veiem exemples d’aberracions cromosòmiques presents a FA.
En un individu normal trobem algunes metafases amb reordenacions, en FA en podem trobar milers.
DEB chromosome fragility test: serveix per avaluar el nivell de fragilitat cromosòmica El protocol que utilitzem és: 1. Extraiem sang de pacients que pensem que tenen FA pel fenotip clínic a. Normalment agafem 5ml de sang perifèrica 2. Fem tres cultius, que contenen 4,5 ml de medi de cultiu i hi afegim 0,5 ml de la sang. Hi posem fitehemaglutinina, que estimula divisió 3. A les 24 hores, en dos dels cultius s’hi posa DEB (DNA crosslinker) i l’altre no es tracta.
4. Al cap de 3 dies, posem colcemid, que para la divisió 5. Sembrem els cultius en una placa.
Resultats: - En les cèl·lules no tractades, hi ha molt poques cèl·lules amb trencament. En un individu normal, les cèl·lules tractades, segueixen també igual que el cultiu no tractat.
5 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls - En l’anèmia de Fanconi, sense tractament veiem algun trencament. Però amb tractament veiem moltes cèl·lules amb trencaments i poques cèl·lules sense trencaments.
Overlapping syndromes Hi ha símptomes clínics que són solapants. També síndromes.
Inherited bone marrow failure syndromes: - Dyskeratosis congenita, - Diamond-Blackfan anemia, - Shwachman-Diamond syndrome, - severe congenital neutropenia, - thrombocytopenia absent radii (TAR) syndrome, - amegakaryocytic thrombocytopenia. Aquesta malaltia és similar a FA però no té inestabilitat cromoòmica Other overlapping syndromes: o Baller-Gerold syndrome, o Nijmegen breakage syndrome (MMC+) o Rothmund-Thomson syndrome, o Roberts syndrome (MMC+) o Warsaw Breakage syndrome (MMC+) o DK-phocomelia, o VACTERL hydrocephalus syndrome, o Wiskott-Aldrich syndrome Spanish FA chromosome fragility database El gràfic presenta el percentatge de cèl·lules amb trencaments i el numero de trencaments per cèl·lula.
• En els afectats hi ha un 90% de cèl·lules amb trencaments i una mitjana de 5 trencaments per cèl·lula) • En els individus normals aquests valors són molt baixos • També hi ha individus mosaic. A la FA hi ha moltes mutacions, si els afectats de FA tenen una mutació reversa, es pot revertir la mutació, llavors aquesta mutació si és somàtica, revertirà el fenotip. Al llarg del temps aquestes cèl·lules sense la mutació proliferaran i aniran substituint les cèl·lules anormals de FA d’una forma competitiva. Així generen sang normal. Llavors veurem a la sang una barreja de cèl·lules sanguínies, normals i amb la mutació de FA.
En un individu normal, si li fem l’estudi d’inestabilitat, la majoria de cèl·lules son normals (verdes). En un afectat, la majoria amb trencaments (vermelles) i en un mosaic n’hi haurà de les dues.
En els mosaics és difícil fer un diagnòstic. Per això haurem d’estudiar els fibroblasts de la pell (el 100% tenen la mutació de FA).
6 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls El mosaicisme a FA és molt freqüent, es troba al voltant del 20% dels afectats.
Molts gens implicats a l’anèmia de fanconi Hi ha actualment uns 16 gens relacionats amb FA. Ara s’ha trobat un 17è (FANCS).
5 d’aquests estan relacionats amb la predisposició al càncer de mama (com els BRCA).
La FA segueix una herència autosòmica recessiva. Si hi ha mutacions a FANC-D és lligada al X.
El FANC- D segueix una herència lligada al X. Les dones són portadores i poden transmetre el gen mutat als seus descendents (els homes estaran afectats).
És important detectar les portadores, perquè tenen alt risc de tenir un fill afectat de FA.
7 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls Tenim molts gens però tots estan implicats en la mateixa via, la reparació de intercrosslinks. Per tant, un individu amb mutacions amb FANC-A serà clínicament molt similar a un amb mutacions amb FANC-C. No podrem distingir la mutació que porten només pel fenotip clínic.
La funció dels gens en aquesta via és mantenir l’estabilitat genòmica. En els individus normals, aquesta via es dona de forma normal. Però en els afectats de FA aquesta via és incorrecta i per tant no hi ha funció, per tant, hi ha la malaltia. Per tant, mutacions en els gens A, B o C donen el mateix fenotip.
Anèmia de Fanconi i resistència a MMC En les cèl·lules normals es necessita molta MMC per matar les cèl·lules (hi són resistents). Mentre que en les cèl·lules de FA es necessita molt poca dosi de MMC, perquè moriran pels trencaments acumulats. (no hi son resistents) Test de complementació_ Hi ha molts tipus d’Anèmia de Fanconi: A, B, C i D.
Amb el tractament de MMC i la transducció dels gens mutats a FA podem detectar les mutacions que tenen els afectats.
Imaginem un individus amb la mutació A en el qual introduïm una copia del gen C normal. Aquesta cèl·lula, després de la transducció del gen (amb un retrovirus), seguirà sent FA (no serà resistent a MMC) perquè té el gen A mutat. Només si introduïm el gen A normal, es revertirà el fenotip i serà resistent a MMC.
Anem provant amb tots els gens fins que les cèl·lules són resistents a MMC.
Un cop detectat el gen que està mutat, el podem seqüenciar.
8 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls Spanish FA mutational spectrum En Espanya, la majoria de pacients són FA-A. Igualment però, hi ha moltes mutacions diferents en cada gen.
Hi ha exons, però, amb més mutacions (13, 36, 38).
La mutació que s’indica en punts vermells, només es troba en gitanos d’Espanya.
El protocol que se seguia a la UAB per trobar mutacions FANC-A és per passos: 1. MLPA + exons 13, 36 i 38 2. Exons 1, 3, 7, 8, 10, 16, 18, 19, 26, 27, 28, 32, 39, 41, 42 3. Exons 4, 9, 11, 15...
4. Exons 2, 5, 6...
A més, cada família té mutacions diferents (privat mutations) 9 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls MUTATION SCREENING - Mutacions puntuals: seqüenciació per PCR mitjançant primers intrònics - Múltiple Ligation Probe Amplification (MLPA): per grans delecions MLPA (Multiple ligation probe amplification) - Desenvolupada per Schouten JP et al. (2002) Es una tècnica per detectar delecions/duplicacions grans als exons.
També detecta trisomies Necessitem tansols 20 ng de gDNA Necessitem dos oligonucleòtids diferents per cada exó o al·lel. Cada sonda té un primer universal en 5’(que ens servirà després per amplificar), una seqüencia específica que reconeix l’exó i en una sonda, entre la seqüencia universal i l’específica d’al·lel/exó, hi ha una seqüencia de longitud variable (en verd) que permetrà diferenciar les diferents sondes.
Si les sondes s’uneixen al exó, com que son adjacents lligaran en el punt de la lligació.
Un cop dissenyats els primers, el que fem es desnaturalitzar, hibridar i lligar amb una lligasa termoestable. Amb els primers dels extrems, si els oligos han lligat, podem amplificar i llavors segons quin encebador hagi hibridat i lligat, tindrem productes de diferent mida, que els analitzarem per electroforesi capil·lar.
10 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls El problema dels pseudogens (FANCD2) En alguns gens hi ha un problema de pseudogens, és a dir, copies del gen no funcionals.
El gen FANCD2 té dos pseudogens, el P1 en el mateix cromosoma i el P2 en un altre cromosoma.
Els pseudogens no s’expressen, així, per evitar detectar pseudogens, podem - seqüenciar el cDNA del gen - o bé dissenyar primers que només s’uneixen al gen (com per exemple al promotor) Mutacions recurrents en FA al llarg del món A vegades és útil saber que hi ha mutacions recurrents en certs grups de pacients. Per exemple un pacient d’ètnia gitana espanyol probament tindrà la mutació 295C>T.
Per tant si coneixem l’origen ètnic de la persona (ethnical origin). El diagnòstic és mes fàcil.
Whole exome sequencing Es van seqüenciar 50 genomes de pacients de FA dels que no se’n coneixia la causa.
En aquests hem d’assegurar-nos que els gens causants de FA estan ben coberts. Es una bona tècnica per trobar mutacions en els gens de FA, i potser si no trobem res, podria ser que hi hagués un nou gen implicat en FA.
11 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls aquest mètode també permet la detecció de grans delecions (homozigotes i heterozigotes) a través de l’anàlisi de la cobertura. Si en un dels dos al·lels hi ha un exó delecionat, llavors la cobertura serà del 50%. Això es el que es mostra en el requadre, no hi ha reads a la part de dalt, el que ens indica que hi ha una deleció dels exons 16-20.
Llavors es confirma la deleció d’aquests exons per MLPA.
Les delecions també es poden detectar en heterozigosi.
En la població espanyola, la mutació més freqüent es FANCA, seguida de FANCD2. En l’estudi es va detectar un nou gen FANCQ (també anomenat ERCC4 a la Human Genomic Organisation).
12 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls El gen FANCQ codifica per una proteïna implicada en la reparació per escissió de nucleòtids. Les mutacions en aquest gen també es troben a la xenoderma pigmentosa, XFE-progeria, a més de la anèmia de fanconi. Per tant, segons el tipus de mutació que hi hagi al gen, dona una malaltia o altra.
La reparació per escissió de nucleòtids (NER) es dona quan hi ha dímers de timina produïts per llum UV. Es reconeixen per un complex proteic, es talla i es deixa un gap, que s’omple per la DNA polimerasa i finalment la lligasa uneix la cadena. També hi ha una altra via, la ICLR. El producte del gen FANCQ participa en les dues vies. Dependent de la mutació que tingui podrà participar en una, dues o cap via (d’entre aquestes dues).
• En pacients de XP, la síntesi del DNA a NER es diu que és UDS (unscheduled DNA synthesis). La síntesi de DNA UDS en aquests pacients és molt baixa. Això evidencia que la NER no funciona bé.
• A Anèmia de Fanconi la UDS és aproximadament un 50 %, el que es suficient per reparar la majoria de delecions.
• Si induïm dímers de timines per llum UV o En una cèl·lula normal es reparen normal o En un pacient amb XP hi ha una cinètica molt lenta de reparació dels dímers o En les cèl·lules de FA amb mutacions a FANQ la reparació no és perfecta però està bé Pel que fa a la ICLR, si la reparació és bona, hi haurà la banda de baix. En els pacients de FA no hi ha aquesta banda, per tant no funciona ICLR.
13 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls 1 gene (XPF), 2 repair pathways, 3 syndromes: - Xenoderma pigmentosa: afecta més a NER i hi ha una alta sensibilitat a UV a la pell Anemia de fanconi; afecta més a ICLR. Hi ha anèmia.
Progeria (nomes un pacient al mon), afecta per igual a NER i ICLR. Les característiques clíniques són una barreja de FA i XP: anèmia i sensitivitat a llum UV a la pell.
TRACTAMENT ACTUAL 1. Andrògens, EPO (dazanol): per estimular la producció de cèl·lules sanguínies. Els pacients tractats amb aquest, al final necessitaran transfusió 2. Transfusions de sang 3. Trasplantament d’HSC (Hematopoyetic stem cells): l’únic tractament curatiu.
o Medul·la òssia Limitacions § Compatibilitat HLA § Graft versus host disease: GVHD: és una reacció del sistema immune del que s’ha trasplantat i el del propi individu.
§ Hipersensibilitat a Quimioteràpia/radioteràpia: quan es fa un trasplantament, hem d’immunosuprimir el pacient (eliminar-li el seu propi sistema immune) de manera que les cèl·lules del donant poden ser acceptades. Els pacients de FA presenten hipersensibilitat a la quimioteràpia/radioteràpia.
§ Tumors secundaris: El trasplantament de medul·la òssia és efectiu però pot generar tumors secundaris. (100% de pacients de FA als que s’ha fet un trasplantament i 60% als que no se’ls ha fet) o Sang de cordó umbilical, UCB o Mobilized HSC en sang la primera persona que es va sotmetre a un transplantament de cordó umbilical és Mattew Ferrow, un afectat de FA. Això va permetre la creació i desenvolupament de bancs de cordó umbilical.
El trasplantament de cordó umbilical s’ha utilitzar per tractar síndromes metabòlics.
From genes to therapy • • • • Trasplantament d’HST transplant (medula òssia, sang de cordó umbilical, mobilized HSC en sang).
Selecció d’embrions per Diagnòstic Genètic Preimplantacional Teràpia gènica? Medicina regenerativa basada en cèl·lules mare? En cas que no tinguem un donador compatible, podem fer un diagnòstic genètic preimplantacional, per tenir un fill sa. Imaginem que hi ha una parella amb un fill ja afectat, i 14 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls necessiten un fill que sigui compatible (savior baby), per DP les probabilitats que sigui compatible són baixes, per tant podem fer servir DGP per aconseguir un fill compatible i a més, sa, que pugui donar sang de cordó umbilical. Les probabilitats són ¼ (HLA) i ¾ (sa). à 3/16 El primer nen nascut per aquest mètode va néixer el 2001. A Catalunya, el primer va ser el 2006.
La probabilitat real de obtenir un fill sa i histocompatible, en realitat és menor del 5% (en 42 proves).
Probability of head and neck cancer in Fanconi Anemia També hi ha probabilitat de càncer en el 100% de pacients d’anèmia de Fanconi sotmesos a un trasplantament.
Per tant, aquests pacients s’han de sotmetre a un control estricte, per detectar primerencament el tumor i extirpar-lo amb cirurgia.
Per tant, el transplantament no és sempre bo, s’estan estudiant noves tecnologies com la TERÀPIA GÈNICA.
La teràpia gènica consisteix en obtenir medul·la òssia del pacient, s’aïllen les HSC CD34+ i es corregeix el genotip utilitzant retrovirus (introduïm el gen correcte) i llavors, les cèl·lules corregides es trasplanten al pacient.
- Amb aquesta teràpia no hi ha risc de rebuig ni d’efectes GVHD.
La teràpia gènica es va provar fa anys sense èxit, però ara hi 15 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls ha millors tecnologies per fer –la. Es pot utilitzar un vector lentiviral el que és millor i més segur.
• • • Aquest vector va ser eficaç en curar la malaltia en ratolins. En els ratolins amb FA tractats amb placebo hi ha molta fragilitat cromosòmica, i en els tractats amb el vector lentiviral, el 100% de cèl·lules es corregeixen, perquè no hi ha fragilitat cromosòmica després del tractament diapo 102 El vector és segur, perquè el promotor és dèbil.
A més, també s’ha de tenir en compte la FA en mosaic. El mosaicisme, normalment resulta en una millora clínica rapida. diapo 103-104 “Natural vs Medical gene therapy” S’està estudiant la mutació reversa perquè es un mètode de curació natural.
Phase I/II Gene therapy trial of Fanconi anemia patients with a new Orphan Drug consisting of a lentiviral vector carrying the FANCA gene En els pacients de FA, el numero de HSC és molt baix, pel que la teràpia gènica pot fallar perquè no tenim suficients HSC. El que es pot fer es tractar els pacients per mobilitzar les HSC de la medul·la òssia cap a la sang.
Quan el pacient és molt jove, encara tenim bastantes HSC, per tant si les agafem en aquest moment i les congelem. Quan els símptomes clínics siguin més greus, podem fer la teràpia gènica en aquell moment (descongelem les HSC i canviem el gen). Això es perquè primer de tot hem d’esperar que hi hagi donant, ja que el tractament de transplantament de medul·la òssia per donant és curatiu, en canvi la teràpia gènica no.
Aquests dos passos es diuen FANCOSTEM i FANCOLEN.
16 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls La teràpia gènica ja s’ha estudiat i fet per immunodeficiències, ara s’està treballant amb els equips que han desenvolupat les tècniques per traspassar-ho a FA. (això és el que estudia el profe) Mirar diapos 106-115 Futur - Inducció de cèl·lules mare pluripotents des de Fibroblasts: Com que hi ha molt poques cèl·lules hematopoètiques mare, potser podem fabricar-les a partir de fibroblasts. La manera que s’ha proposat és aconseguir cèl·lules iPS mitjançant l’expressió d’un numero de FT humans en el fibroblast. Aquest mètode es va inventar per Yamanaka.
Tenim un pacient afectat de FA i li agafem fibroblasts, que també tenen la mutació, per tant hi fem teràpia gènica (amb vectors lentivirals). Llavors mitjanant factors de transcripció les convertim en iPS, que es podran diferenciar a HSC mitjançant citocines. Aquestes cèl·lules són totalment compatibles amb el pacient, per tant, es poden trasplantar a aquest.
Per exemple potser podríem generar cardiomiòcits sans en un afectat de FA a partir de fibroblasts de la pell.
La inestabilitat genòmica és una barrera en la reprogramació amb èxit de la pluripotència Per tal d’aconseguir iPS necessitem 3 factors, que són molt estressants per les cèl·lules, de manera que activen la “DNA damage response” que pot acabar anant a la via de p53 de manera que es pot donar apoptosi. Per tant, per això aquesta tècnica no acaba de funcionar.
17 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls • • I si inhibim la resposta de p53? En els pacients de FA si intentem fer les iPS des de fibroblasts amb la mutació, directament activen totes aquestes vies (perquè tenen el DNA danyat), de manera que l’eficiència és molt baixa.
(gairebé 0) Si utilitzem cèl·lules de FA amb la resposta al p53 inhibida, s’aconsegueix una mica més d’eficiència.
Reconstiuting hematopoiesis from iPS cells A la FA el problema està les HSC, de manera que es danyen totes les cèl·lules sucessores: plaquetes, eritròcits...
Els progenitors de sang són positius pel marcador CD34. En els controls (no afectats FA) les cèl·lules amb el marcador son moltes, en FA poques i en C-FA (pacients de FA tractats amb HSC) torna a pujar.
- GENOME EDITING: Per fer teràpia gènica (un cop s’ha identificat el gen alterat) necessitem que el gen es col·loqui on toca.
Hem d’assegurar-nos que no s’integri en altres llocs.
Per evitar aquests problemes d’integració podem fer servir les noves tecnologies com la “genome editing” . Aquestes utilitzen: - Nucleases o Zinc finger nuclease o Talen o CRISPR/Cas9 - Recombinació homòloga Amb aquestes eines, potser podrem reparar la mutació o bé, trobar un lloc del genoma segur per integrar el gen sense la mutació (save harbour).
- - Per reparació de la mutació: o Per nucleases: La reparació del gen s’iniciaria per un tall fet per nucleases, llavors per NHEJ es repararà. Després de la reparació, com que NHEJ té errors, es pot revertir el wt.
o Per recombinació homòloga: es fa un tall (DSB) al gen, llavors s’introdueix un plasmidi amb el gen normal, de manera que per recombinació homologa, es canviarà el gen del plasmidi. (el gen del plasmidi s’intercanviarà pel mutat en la posició correcta del genoma gràcies a la recombinació homòloga).
Diapo 132 Per Save harbour El locus AAVS1 es considerat un locus “save harbour”. Utilitzant un vector amb braços homòlegs, la seqüencia del gen pot ser introduïda en el “save harbour” per genome editing.
18 DGM- Tema 1 (2n parcial) mfiguls Genetic correction stategies in FA therapeutics - També podem integrar la copia wt per teràpia gènica en qualsevol lloc del genoma, així es diu untergeted gene therapy.
Fer save harbour Fer genome editing per recombinació homòloga Fer genome editing per CRISPS/Cas9 Targeting blood progenitors (CD34+) in Fanconi Anemia therapeutics Tenim molts mètodes per fer teràpia gènica, i també per recol·lectar les HSC. Un pacient de FA te molt poques HSC. Llavors, quan es jove les podem agafar (perquè es quan en tindrà més), llavors hi fem teràpia gènica i fem un trasplantament de les HSC. Això és el que s’està fent normalment per afectats de FA.
Però si el numero de HSC es massa baix, una altra opció es agafar fibroblasts de la pell, corregir la mutació i reprogramar els fibroblasts fins a iPS i després podran diferenciar-se a HSC, que es trasplantaran al pacient. Això és més del futur.
Perquè és important la recerca en malalties rares com la anèmia de fanconi? A l’anèmia de fanconi: - Malaltia on es va fer el primer trasplantament de sang de cordó umbilical - La malaltia on primer es va seleccionar un embrió histocompatible sa - Es de les primeres de les que es fan més estudis de teràpia gènica - La primera en la que es van generar cèl·lules iPS sanes - Es un model per entendre els processos biològics fonamentals (estabilitat genòmica, càncer, envelliment, pluripotència...) - Son una eina per trobar nous fàrmacs per càncer i gens del càncer.
19 ...