T4, Genetica (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2013
Páginas 22
Fecha de subida 30/03/2015
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

T. 4  Genètica Què és la genètica? La genètica és una ciència que estudia la herència biològica i la variació → transmissió de la informació I a nivell molecular: • Estructura i organització dels àcids nucleics • Replicació del DNA • Transcripció i processament del DNA • El codi genètic i traducció  Estructura d’un nucleòtid: Segons si té o no l’oxigen del OH Per unir dos nucleòtids es forma l’enllaç fosfodiéster.
Es forma entre el grup fosfat i el carboni 3’ de la pentosa.
 Cadena polinucleotídica i direccionalitat S’anomenen àcids nucleics pel grup fosfat (carregat negativament a pH fisiològic) Els nucleòtids s’uneixen mitjançant enllaços fosfodiéster L’extrem 5’ correspon al nucleòtid on el seu grup fosfat no participa de cap enllaç fosfodiéster L’extrem 3’ correspon al nucleòtid on el seu OH en posició 3’ no participa de cap enllaç fosfodiéster Quan es llegeix una cadena polinucleotídica, es llegeix començant pel nucleòtid de l’extrem 5’ i acabant pel nucleòtid de l’extrem 3’ (té direccionalitat 5’->3’) L’ARN és més “inestable” que no pas l’ADN (l’alcohol en 2’ podria hidrolitzar l’enllaç fosfodiéster)  L’ESTRUCTURA PRIMÀRIA equival a seqüència de la cadena polinucleotídica. Es pot resumir especificant tant sols la seqüència de les bases nitrogenades des de l’extrem 5’ fins al 3’  ESTRUCTURA SECUNDÀRIA D’UN ÀCID NUCLEIC (WATSON i CRICK) Dues cadenes polinucleotídiques antiparal·leles formant una doble hèlix dextrogira (gira cap a la dreta) L’esquelet sucre-fosfat es troba en l’exterior de la doble hèlix Les bases nitrogenades queden en l’interior de la doble hèlix i sols són accessibles des de l’exterior pels solcs Les 2 cadenes són complementàries (i.e. interaccionen mitjançant ponts d’hidrogen entre A i T i entre G i C de cadenes diferents).
El nombre de mols d’A i de T (i de G i C) en un DNA determinat són iguals Aquest model permet explicar perquè la replicació és semiconservativa  Aparellament de bases de la doble hèlix El nombre de ponts d’hidrogen és característic de cada parell de bases (2 per AT i 3 per GC) Com major sigui el contingut en GC d’un DNA, major serà la temperatura a la qual es desnaturalitzarà (es separen les cadenes).
Les dimensions de la doble hèlice són pràcticament idèntiques amb independència del parell de bases La formació dels ponts d’hidrogen entre bases complementàries no esgota les possibilitats de aquestes participin en més interaccions d’aquest tipus Estructura: Molècules com les proteïnes poden interaccionar amb les bases nitrogenades, encara que aquestes quedin a l’interior de l’hèlix. Entren a l’interior pels solcs (major i menor)  Organització del DNA dins de la cèl·lula El DNA és molt àcid, per tant els aminoàcids que formen les histones tenen caràcter bàsic.
Nivells d’empaquetament: - Primer nivell: Collaret de perles Fibra de DNA associada a histones.
Estructuralment està constituïda per partícules anomenades nucleosomes (octàmer d’histones) Rosete = Solenoide - Segon nivell: Solenoide Enrotllament sobre si mateix del collaret de perles - Tercer nivell: El solenoide forma una sèrie de bucles.
 Flux de la informació genètica REPLICACIÓ Procés pel qual una doble hèlix de DNA és copiada per originar dues molècules idèntiques a la progenitora.
Característiques generals (procariotes i eucariotes): - És semiconservativa. La meitat del DNA de la filla prové de la mare, l’altre es nou - És ordenada i seqüencial. És copia de la cadena motlle, i va de 3’ a 5’.
- Requereix substrats activats - És semidiscontinua o La replicació és ordenada i seqüencial Les DNA polimerases catalitzen la unió del nucleòtid al grup 3’-OH lliure d’un polinucleòtid i, per tant, la cadena només pot créixer en la direcció 5’->3’ LES DUES CADENES FILLES DE DNA ES SINTETITZEN SEMPRE EN LA DIRECCIÓ 5’->3’ La reacció de polimerització es produeix per un atac nucleofílic del grup 3’-OH de la cadena que s’està sintetitzant sobre el fosfat alfa del desoxinucleòsid trifosfat que entra (s’allibera pirofosfat inorgànic) Degut a la complementarietat entre les bases nitrogenades, la cadena que serveix de motlle es llegeix en la direcció 3’->5’ La complementarietat entre bases serveix a la DNA polimerasa per saber quin desoxinucleòsid triar i és el fonament de la replicació semiconservativa Les DNA polimerases sols poden afegir nucleòtids a l’extrem 3’ d’una cadena polinucleotídica preexistent (necessiten d’un encebador o primer que, normalment és una molècula de RNA) S’afegeixen nucleòtids trifosfats perquè afegir nucleòtids monofosfats no està afavorit termodinàmicament Hidròlisis dels dos grups fosfats restants PPi = Pirofosfats o La replicació és semidiscontinua Les dues cadenes filles es sintetitzen en direcció 5’->3’ però mentre que en una, es fa de forma contínua (i.e. la cadena guia), en l’altra es fa de forma discontínua (i.e. la cadena endarrerida).
Per tant, es diu que, globalment, la replicació és SEMI-DISCONTÍNUA La replicació té lloc gràcies a l’acció d’enzims i altres proteïnes que hi intervenen. El procés de replicació es pot dividir en 3 etapes: -Iniciació -Elongació -Terminació  Etapa d’iniciació En la etapa d’iniciació es forma un complex DNA-proteïna creant una tensió que força el desenrotllament de DNA, ajudat per les helicases i la síntesis del RNA encebador per part de l’enzim primasa.
DNA A: proteïnes de la E.Choli que reconeixen l’origen de replicació, i fan un tomb per tensar la cadena.
Helicasa: entra en l’origen de replicació i va obrint les cadenes per a que es separin.
La replicació té lloc bidireccionalment, perquè si obrim les cadenes tenim 2 forquetes de replicació Origen de replicació: en procariotes és únic, en eucariotes n’hi ha diversos El DNA de les eucariotes es més gran que el de les procariotes, per tant té més orígens de replicació per a que tingui lloc més ràpid.
 Etapa d’elongació Les dna polimerases sols poden afegir nucleòtids a l’extrem 3’ d’una cadena polinucleotídica preexistent o Les dues cadenes parentals es repliquen simultàniament a la forqueta de replicació La forqueta de replicació és el punt on el DNA parental és desenrotllat i les cadenes separades, són ràpidament replicades.
Enzims en la forqueta de replicació Proteïnes SSB: s’uneixen al DNA de cadena senzilla i estabilitzen que la cadena estigui oberta.
Topoisomerasa: lleugera la tensió que es pot produir quan es va obrint la cadena.
Ligasa: catalitza l’ultima unió entre el grup hidroxil i el fosfat Les nucleases són enzims que degraden el RNA o el DNA - Les exonucleases degraden l’àcid nucleic des d’un dels seus extrems [des de l’extrem 5’ (exonucleases 5’->3’) o des de l’extrem 3’ (exonucleases 3’- >5’)] - Les endonucleases poden començar la digestió del DNA des de qualsevol lloc -Les DNA polimerases tenen activitat 3’->5’ exonucleasa que li permet revisar el nucleòtid després d’afegir-lo DNA polimerases en procariotes: -DNA polimerasa I: elimina els fragments de RNA encebadors i els substitueix per DNA (5’- >3’) -DNA polimerasa II: reparació del DNA (3’- >5’) -DNA polimerasa III: va afegint els nucleòtids (3’- >5’) o DNA POLIMERASA III - És el principal enzim de la replicació - Formada per 10 o més tipus de subunitats - Un nucli polimerasa està format per una subunitat de cadascun dels tipus , i que: (a) polimeritza DNA; i (b) presenta baixa processativitat - Dos nuclis polimerases poden formar un complex amb un dímer de dues subunitats de tipus  - Aquest complex dimèric es pot associar amb un complex format per 6 subunitats de 5 tipus diferents (i.e. 2’) i el conjunt de 14 subunitats que en resulta és la DNA polimerasa III* (que pot polimeritzar DNA però amb una processativitat baixa).
- La processativitat elevada s’aconsegueix amb l’addició de les 4 subunitats de tipus . El conjunt resultant (18 subunitats de 10 tipus diferents) constitueixen la DNA polimerasa III o SÍNTESIS DE LA CADENA RETARDADA La DNA polimerasa I en bacteris té activitat 5’ exonucleasa, i elimina els ribonucleòtids de l’encebador i els substitueix per desoxiribonucleòtids - Mitjançant la seva activitat 5’->3’ exonucleasa: Elimina els encebadors de RNA formats durant la replicació - Repara el DNA: Mitjançant la seva activitat 3’->5’ exonucleasa “Correcció de probes” - Mitjançant la seva activitat polimerasa substitueix el RNA cebador per DNA (aquest procés rep el nom de nick translation perquè trasllada l’osca que hi ha en la cadena filla) La DNA ligasa catalitza la formació de l’enllaç fosfodiéster entre els extrems 3’ i 5’ o SEQÜÈNCIA D’ACCIÓ DE LES DNA POLIMERASES III, I i DE LA DNA LIGASA EN LA CADENA RETARDADA o Etapa d’elongació 1) Elongació de la cadena guia a) La primasa (també anomenada proteïna DnaG) sintetitza una cadena curta de RNA (de 10 a 60 nucleòtids) que servirà d’encebador b) Posteriorment, la DNA polimerasa III afegeix els nucleòtids i fa la polimerització (coordinada amb el descargolament del DNA a la forca de replicació) c) La síntesi de la cadena guia es va produint conforme el DNA és descargolat per la DnaB helicasa 2) Elongació de la cadena retardada a) La primasa sintetitza una cadena curta de RNA (de 10 a 60 nucleòtids) que servirà d’encebador per la creació d’un primer segment de DNA (un dels anomenats segments d’Okazaki) b) La DNA polimerasa III polimeritza fins que arriba a l’encebador del segment d’Okazaki anterior c) Es sintetitza un nou encebador prop de la forca de replicació i comença de nou el procés.
 Finalització de la replicació En e. coli la replicació acaba a la regió Ter, on s’uneix la proteïna Tus bloquejant les forquetes de replicació.
TRANSCRIPCIÓ Procés de síntesi enzimàtica d’un RNA amb una seqüència complementària a un segment de DNA Els principals enzims implicats són les RNA polimerases, que catalitzen la síntesi d’RNA, depenent del DNA motlle i dels 4 ribonucleòsids 5’-trifosfat (ATP, GTP, UTP, i CTP) La transcripció s’assembla a la replicació en què… 1) El mecanisme d’addició de nucleòtids a la cadena polinucleotídica és el mateix (i.e. atac nucleofílic de l’hidroxil en posició 3’ al fosfat en posició del ribonucleòsid trifosfat) 2) La direcció del creixement de la cadena polinucleotídica també és 5’->3’ 3) Es necessita una cadena de DNA que actuï de motlle La transcripció difereix de la replicació en què… 1) La RNA polimerasa no necessita cap encebador 2) Només es transcriu una zona determinada del DNA i no tot ell (en els gens hi ha seqüències específiques que indiquen els punts d’inici i d’acabament de la transcripció) 3) Durant la transcripció només serveix de motlle una de les dues cadenes del DNA 4) La RNA polimerasa no té activitat 3’->5’ exonucleasa (activitat exonucleasa correctora d’errors) o Cadenes de DNA motlle i no motlle 1) La cadena que es transcriu s’anomena cadena motlle i pot estar situada a qualsevol de les dues cadenes 2) La cadena que no es transcriu s’anomena cadena codificant o cadena no motlle i és idèntica en seqüència al RNA que es transcriu (llevat que les T són substituïdes per U) o ETAPES DE LA TRANSCRIPCIÓ  Què és un promotor? Tots els gens que es transcriuen tenen promotor Segment de DNA que reconeix la RNA polimerasa i que li permet reconèixer fàcilment quin DNA s’ha de transcriure (és l’adjacent a la pròpia seqüència del promotor) El primer nucleòtid que se transcriu se’l numera com a +1, el següent +2 i així successivament Els nucleòtids del DNA a l’esquerra del +1 reben valors negatius (e.g. el que queda immediatament a la seva esquerra és el -1 i així successivament) Cada segment de DNA que s’ha de transcriure té el seu propi promotor Per conveni, les seqüències reguladores que controlen la transcripció es descriuen mitjançant la seqüència de la cadena codificant (així té la mateixa direcció que el RNA transcrit) El promotor té variabilitat, però hi ha regions fixes.
Les seqüències consens: són les seqüències que més es troben o Característiques dels promotors d’E.coli Hi ha zones molt ben conservades al voltant de les posicions -10 i -35 que són on s’uneix la subunitat 70 de la RNA polimerasa.
La subunitat sigma després de 10 nucleòtids es dissocia.
Els promotors dels gens altament expressats presenten l’anomena’t upstream promoter (UP) que és ric en AT i abasta la regió que va de -40 a -60 (s’hi uneix la subunitat de la RNA polimerasa).
Les pròpies característiques del promotor (i.e. seqüències de les zones conservades, espai entre elles i distància a la posició +1) poden afectar notablement l’activitat de la RNA polimerasa i establir un nivell basal d’expressió.
Com més semblant sigui un promotor al consens, més es transcriurà el gen corresponent (serà un promotor fort). Com menys s’assembli, menys es transcriurà el gen corresponent (serà un promotor feble).
 Iniciació  Iniciació i elongació o La bombolla de transcripció  Terminació de la transcripció La seqüència de DNA determina que s’acabi la transcripció i l’mRNA sintetitzat s’alliberi, ja sigui degut a la pròpia estructura de mRNA o bé amb l’ajut de proteïnes que s’uneixin a l’mRNA i en faciliti la dissociació del DNA.
En bactèries se’n coneixen dos tipus: - Depenent de proteïna Rho - Independent de proteïna Rho El RNA forma una estructura que sobresurt i la polimerasa interacciona per si mateixa.
Al final de la cadena hi haurà interaccions molt febles, es a dir predominen el nucleòtids TA.
 Processament de l’RNA - El RNA acabat de sintetitzar (l’anomena’t transcrit primari) no té perquè ser funcional - Per tal de ser funcionals o madurs, molts RNA s’han de processar mitjançant un seguit de reaccions - Els RNAs que es processen més extensivament són els RNAm d’eucariotes i els RNAt (tant d’eucariotes com de procariotes) - El processament és catalitzat per enzims (tant proteics com ribozims) Traducció •Les combinacions han de ser com a mínim de 3 nucleòtids: 43 = 64 •Cada combinació de 3N (un triplet) = codó codifica per a un aminoàcid determinat •El conjunt de codons que especifiquen els aminoàcids proteics constitueix el codi genètic  Característiques del codi genètic  No té solapaments Quan es llegeix un missatge codificat, és mol important la pauta de lectura.
Es va deduir eliminant bases.
Al eliminar un nucleòtid, va canviar totalment la pauta de lectura, i quan eliminaven 3 la proteïna era la mateixa però faltava un aminoàcid  El codi genètic està degenerat: 64 codons per a 20 aminoàcids  El codi genètic no és ambigu: cada codó designa un únic aminoàcid  És quasi universal  AUG, a més de codificar per Met, és el codó d’inici de la traducció  Hi ha 3 codons de parada de la traducció: UAA, UAG, UGA. No codifiquen per aminoàcids.
 Síntesi de proteïnes als ribosomes (En procariotes, en eucariotes és molt semblant) Es poden distingir 3 fases: - Iniciació - Elongació - Acabament  El ribosoma El ribosoma és el lloc on es fa la traducció del mRNA a proteïna.
Les formes de les subunitats i la del ribosoma sencer de procariotes i eucariotes s’assembla molt Té tres llocs enllaçants per a tRNAs: • Lloc A: enllaça els tRNA que porten els aminoàcids • Lloc P: enllaça els tRNA que porten el pèptid • Lloc E: enllaça els tRNA que no porten cap aminoàcid La metionina, al ser l’aminoàcid inicial, és l’únic aminoàcid que entra pel lloc P.
La resta d’aminoàcids sempre entren pel lloc A.
Poden dissociar-se en 2 subunitats: - Subunitat gran - Subunitat petita Funcions: - Reconèixer les regions apropiades del mRNA per començar la traducció - Aparellar correctament codons i anticodons - Formar els enllaços peptídics  Iniciació AUG: codó inici, però també codifica per la metionina Com es distingeixen els AUG d’iniciació dels interns? Ho determina el context en que es troba el codó AUG.
Si nomes fos de inici, les proteïnes no tindrien metionina, només la tindrien al inici.
Seqüència de Shine-Dalgarno: precedeix l’AUG, és una regió que no es tradueix, rica en A i G per alinear l’mRNA al ribosoma La seqüència Shine-Dalgarno és complementària d’un fragment ric en pirimidines (CU) de l’extrem 3’ del rRNA 16S L’aparellament de bases entre la seqüència Shine-Dalgarno del mRNA i l’rRNA 16S, permet que el ribosoma seleccioni el codó d’iniciació correcte  tRNA No hi ha cap afinitat específica entre les cadenes laterals dels aminoàcids i les bases nitrogenades del mRNA.
Calen molècules adaptadores que relacionin els codons amb els seus aminoàcids: els tRNA Braç de l’aminoàcid: l’aminoàcid s’uneix a l’extrem 3’ que sempre acaba amb la seqüència CCA Braç anticodó: regió de la molècula de tRNA que interacciona directament amb un codó del mRNA, a través d’una seqüència de 3 bases (anticodó)  Activació dels aminoàcids Per sintetitzar proteïnes cal formar enllaços peptídics, reacció que és termodinàmicament desfavorable. Cal activar el carboxil dels aminoàcids. Això es fa enllaçant-los als tRNA.
 Elongació Cada aminoàcid s’afegeix per la repetició d’un microcicle que consta de 3 etapes: 1) unió de l’aminoacil-tRNA reconegut per un codó, al lloc A 2) formació de l’enllaç peptídic 3) translocació: desplaçament del ribosoma pel mRNA un codó cap a 3 La cadena creix en un residu El ribosoma es desplaça al llarg de l’mRNA un codó És un procés costós energèticament!! EF: Factor d’elongació o En procariotes la traducció i la transcripció són simultànies En les eucariotes no pot tenir lloc a la vegada perquè la replicació i la transcripció tenen lloc al nucli, mentre que la traducció té lloc al citoplasma en els ribosomes.
En la traducció diversos ribosomes poden llegir a la vegada la mateixa molècula de mRNA formant un poliribosoma o polisoma.
o Acabament de la traducció en procariotes Quan el codó que hi ha al lloc A és un codó d'STOP (UAA, UAG, o UGA) s'acaba la síntesi proteica.
RF: Factor d’alliberament El codó d'STOP no és reconegut per un tRNA sinó per proteïnes factors d'alliberament. L'extrem de la cadena s'allibera amb la hidròlisi de l'enllaç pèptidtRNA.
 Maduració de les proteïnes Processament que experimenten les proteïnes fins adquirir la conformació funcionalment activa - Plegament del polipèptid: quan la cadena polipeptídica comença a sortir del ribosoma ja comença a plegar-se per adoptar les estructures secundària i terciària. Algunes es pleguen de forma espontània, però també sovint amb l’ajut d’altres proteïnes acompanyants (espelmes moleculars o xaperones) - Modificacions covalents Desformilació de N-fMet (desformilases) Eliminació de metionina Formació d’enllaços dissulfur Hidroxilació (ex: hidroxilació de Pro i Lys al col·lagen) Fosforilació d’hidroxiaminoàcids Carboxilació Metilació Unió a grups prostètics Unió a cadenes hidrocarbonades Proteolisi (ex: zimogens) o Per arribar al seu destí les proteïnes a vegades han de passar a través de membranes Nucli → Reticle endoplasmàtic rugós → Aparell de Golgi ...