purificació de proteïnes (2014)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2014
Páginas 11
Fecha de subida 05/10/2014
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Purificació de proteïnes Criteris de separació: mida, solubilitat, càrrega, densitat, forma, afinitat i polaritat.
Incís en la solubilitat Explicacions: Al punt isoelèctric, les proteïnes tenen mínima solubilitat.
Solubilització per salat: les sals en concentracions baixes permeten canviat el pH de les proteïnes i mantenir-les solubilitzades.
Precipitació per salat: la sal segresta la capa de solubilitat (d’hidratació) de la proteïna.
Altres detergents: SDS (dodecilsulfato sódico) PCA (àcid perclòric) i TCA (àcid tricloroacètic).
1 Els processos no són acumulatius, són independents. Això ens permet saber quina tècnica és més eficaç. Es fa amb una alíquota i un cop triat el mètode es fa amb tota la mostra.
De vegades és millor que la proteïna no sigui tan pura però que en tinguem més quantitat.
Depèn de la tècnica perdem més o menys activitat. Per això hem de triar el mètode segons el que més ens convingui.
Per seguir el procés de purificació es pot mesurar l’activitat específica a cada etapa.
Diferents mètodes de purificació Diàlisi Procés de separar les molècules en una solución per la diferència en els seus índex de difusió o pressió osmòtica a través d’una membrana semipermeable. Procediment: es posa una solució de diversos tipus de molècules dintre una bossa semipermeable com per exemple una membrana de cel·lulosa amb porus i es segella la bossa. Aquesta és introduïda en un recipient amb una solució diferent o aigua pura. Les molècules prou petites per travessar els porus (aigua, sals, molècules petites) tenen tendència a moure’s cap a dintre o cap a fora de la bossa de diàlisi en direcció a la concentració més baixa. Les molècules més grans (proteïnes, DNA, polisacàrids), les quals tenen un diàmetre significativament més gran que el dels porus, es queden dintre la bossa. Aquesta tècnica s’empra sovint per treure la sal d’una solució de la proteïna. El solvent es va canviant perquè no se saturi.
2 Centrifugació Es tracta d’una separació per precipitació en funció del pes molecular. Podem escollir la densitat del medi. Si la densitat de la proteïna és superior a la del medi, precipitarà, si no, surarà.
Ficoll i Percoll són dos medis que serveixen per separar cèl·lules, per exemple, separen hepatòcits de cèl·lules de Kupffer.
També podem variar la densitat del compost. La podem augmentar afegint un àcid, un salat o un agent desnaturalitzant (com mercaptoetanol o urea).
També existeix la centrifugació isopícnica, en la qual es crea un gradient de densitat del medi. El temps de centrifugació és suficientment llarg (1 o 2 dies) com perquè s’assoleixi l’equilibri de sedimentació (entre la força centrífuga, l’empenyiment electrostàtic i la seva difusió). Per aconseguir-ho s’empren gradients continus que cobreixen tot l’interval de densitats dels components de la mostra: al fons del tub la densitat del medi ha de ser més gran que la del component més dens. D’aquesta manera, independentments del temps de centrifugació, les partícules, cèl·lules, etc.
mai sedimentaran al fons, sinó que assoliran una posició estable intermitja en el gradient, on en concentren en un banda molt estreta (millor resolució). Aquesta tècnica separa exclusivament segons la densitat dels component de la mostra, que se situen en la posició del gradient on la densitat del medi és igual a la seva.
3 Cromatografia en columna La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice (SiO2) y alúmina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes velocidades y se conseguirá su separación. Así, de manera similar a otros tipos de cromatografía, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a través del medio sólido se corresponden con diferencias en los tiempos de elución por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogerán en fracciones diferentes.
La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten 4 más eficientemente con las moléculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazará las moléculas, incluyendo las más polares, rápidamente a través de la columna. Si el disolvente es muy polar la elución será muy rápida y generalmente habrá poca separación de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirán los compuestos de la columna. Por lo tanto, la elección del eluyente es crucial para el éxito de la cromatografía en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elución. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separación.
Cromatografia d’exclusió molecular, filtració en gel.
Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional.
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio (Fig. 1) quedando listo para su uso.
En el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirse varios volúmenes (Fig. 2): a) El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado.
b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.
c) El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.
5 Cuando una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se hace pasar a través de la columna de gel, se produce la separación en virtud del siguiente principio: - Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de lasesferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt). Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas del gel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. El res to de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionadamente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo.
Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las esferas del gel y, por tanto, menor es el volumen de líquido que se requiere para extraerla de la columna.
Teniendo en cuenta que para las proteínas globulares el tamaño está, en general, relacionado con el peso molecular, este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más pesadas.
6 Cromatografia de bescanvi iònic La Fase Estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna está influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.
Cromatografia d’afinitat Permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.
7 Electroforesi Es un método que permite separar las proteínas en función de su carga neta al someterla a un campo eléctrico. En la electroforesis, la fuerza que mueve la macromolécula es el potencial eléctrico (E). la movilidad electroforética de la molécula (µ) viene dada por la razón de la velocidad de la partícula (V) al potencial eléctrico; y también es igual a la carga neta de la molécula (Ze), dividida por el coeficiente friccional (f): El coeficiente friccional (f) depende del tamaño y la forma de la molécula, por lo tanto la ecuación anterior indica que la movilidad de una molécula depende de su carga y de las dimensiones moleculares.
La electroforesis no suele utilizarse para purificar proteínas, ya que hay que teñirlas para visualizarlas, y en este proceso generalmente se inactivan. Sin embargo, es muy útil como método analítico, ya que al poder visualizarse por tinción puede hacerse una primera estimación del número de proteínas de una mezcla, o de la pureza de una preparación. Además, mediante esta técnica puede determinarse tanto el punto isoeléctrico de una proteína como su masa molecular aproximada.
La electroforesis de proteínas, o macromoléculas en general, se lleva a cabo utilizando algún medio de soporte, siendo los más habituales el papel, el acetato de celulosa o geles de poliacrilamida entrecruzados. Todos estos soportes están humedecidos o contienen una solución tampón que controla el pH del medio, y están dispuestos en 8 una cubeta que tiene dos electrodos. Sobre el soporte se colocan las muestras de proteínas que se desea separar, y se aplica la corriente eléctrica. Posteriormente las proteínas se visualizan mediante tinción con un colorante. Las manchas se identifican comparándolas con una serie de patrones que han corrido al mismo tiempo en el mismo soporte. La concentración de proteína de cada mancha puede determinarse mediante la lectura del soporte en un densitómetro.
PAGE i SDS-PAGE Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos.
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio (SDSPAGE),tanto para analizar mezclas de proteínas, como para ser combinada con técnicas deinmunoelectrotransferencia. En la ténica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Dado que la relación final carga/masa queda constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa.
9 Electroforesi: Western Blot Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la pro-teína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras.
Electroforesi bidimensional La electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida (2D PAGE) es la herramienta más empleada para el análisis global y la separación de los componentes del proteoma. Dicha técnica permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico.
Permite aislar proteínas mediante una soble separación en un gel 2D-PAGE en base al punto iseléctrico (pI) en la primera dimensión y según su tamaño molecular (PM) en la segunda dimensión.
Isoelectroenfocament Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque, se emplea ampliamente en bioquímica para separar moléculas cargadas. Se trata de un tipo de electroforesis. Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Las sustancias que 10 inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquéllas que se encuentran en medios con pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. La migración las conducirá a una región donde el pH coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.
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