TEMA 2 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura ecología microbiana
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 07/04/2015
Descargas 2
Subido por

Descripción

Mètodes i mostreig

Vista previa del texto

TEMA 2. MÈTODES I MOSTREIG Tres qüestions fonamentals: 1. Què hi ha? (diversitat) 2. Quants n'hi ha (abundància) 3. Què poden fer? (activitat) Tres fases: recollida de mostres, processament i mesures.
Per examinar els microorganismes en sistemes naturals, s'han analitzat submostres representatives i els resultats s'han extrapolat a la totalitat de la comunitat o de l'ecosistema. Sorgeixen problemes tals com: – En molts ambients la distribució de microorganismes és heterogènia – Solen trobar-se en microhàbitats.
La forma de recollir i de processar les mostres pot influir profundament en el resultat de les mesures.
El mètode de mostreig dependrà de: – Les propietats físico-químiques de l'ecosistema sotmès a l'estudi.
– L'abundància esperada dels microorganismes.
– Els procediments de recompte i mesura utilitzats.
El mètode de mostreig ha d'assegurar: – La no alteració de les mostres fins el seu processament final. Les mostres es guarden en una nevera, per tal que la comunitat quedi intacta, que no es mogui més. També utilitzant compostos com formaldehid per fixar les mostres (però això no és utilitzat per aïllar microorganismes, sinó per hibridació o altres.).
– Que els microorganismes només provenen de l'ecosistema que s'està estudiant.
SÒL: Característiques del sòl: – Ambient molt estable.
– Elevada diversitat i alt nombre de microorganismes (abundància i riquesa elevades).
Abans de començar un anàlisi de la microbiologia del sòl és important seleccionar un disseny experimental adequat i una estratègia de mostreig. El mostreig a nivell de parcel·la és l'estrategia més comuna, s'han d'agafar les mateixes rèpliques de diferents llocs d'una mateixa superfície. La gran abundància de microorganismes en el sòl relativitza l'acció de possibles contaminants.
Si es desitja obtenir una mostra de sòl d'una profunditat determinada, s'utilitza un mostrejador cilíndric (corer) per sòls. D'aquesta manera es pot obtenir les diferents capes del sòl.
Quan el nombre de microorganismes és relativament baix s'utilitzen altres sistemes que permeten el creixement “in situ” com la tècnica Cholodny-Rossi, on s'enterra el portaobjectes i s'enganxen els microorganismes. També s'utilitza la reixeta de microscopia electrònica. Així com capil·lars plans de vidre, que s'anomenen pedoscopis (sòl) o peloscopis (sediments). Els sediments tenen aigua per sobre, mentre que el sòl no.
Tècniques capil·lars: – Observació de microorganismes – Descripció de nous gèneres de microorganismes no cultivables.
– Observació de les diferents fases de cicles biològics.
Magatzem i pretractament de mostres: – 4ºC fins a 3 setmanes.
– -20ºC per períodes més llargs.
– Abans de les anàlisis, les mostres es poden garbellar per una malla de 2mm (5mm en terres humits, o bé pressecar).
AIGUA: L'espectre d'hàbitats i la diversitat de comunitats microbianes associades és tant ampli que cal revisar curosament els protocols de mostreig abans d'aplicar-los al lloc d'estudi. Hi ha un gradient molt abrupte d'energia en la zona eufòtica, variacions latitudinals d'energia solar i gradients importants de nutrients (horitzontals i verticals). També trobem variacions diàrires, intra, interestacionals i interanuals en els processos microbians.
Es requereix un programa de mostreig rigurós i ben dissenyat. S'ha de tenir en compte: – Escala de temps (1 cop al mes, a l'any, estació, etc.) depenent si es vol estudiar cicle estacional, dia i nit, etc. Variabilitat espaial i 1 profunditat o vàries.
– Volum d'aigua.
– Dades complementàries (substrats dissolts, gassos dissolts, matèria particulada, etc.) – Rèpliques (ideal 3 rèpliques).
Les estacions són els llocs de mostreig. S'elaboren transectes, el lloc per on ha de passar el vaixell.
S'escull una determinada corrent d'un mar per estudiar els microorganismes que hi ha. Quan s'arriba al lloc de mostreig, els paràmetres físico-químics són molt importants i s'han d'analitzar sempre.
Entre aquests trobem la fondària, temperatura, salinitat, llum, fluorescència, pH o l'oxigen dissolt.
Antigament s'utilitzaven els discs de Secchi, un disc blanc i negre, lligat amb un cable marcat amb longitud, s'tulitza per veure la terbolesa (fondària de Secchi).
Primer s'han de mesurar els paràmetres físico-químics de la columna d'aigua. Els imprescindibles són la llum, salinitat i temperatura. S'ha de decidir les fondàries que s'ha de mostrejar, amb un nombre de mostres limitats.
S'ha d'agafar sobretot de la part inicial, on hi ha més canvis, fet que fa possible una major quantitat d'ambients microbians. Aquests paràmetres poden canviar segons el dia i la nit o les estacions. Problemes com l'accessibilitat (control remot) i la contaminació per organismes no autòctons.
Aparells utilitzats: – Xarxes (algues i protozous planctònics). Xarxes per fitoplàncton, zooplàncton i mànegues per plàncton.
– Mostrejador Johnson-ZoBell (J-Z). Està format per un tub de vidre o bulb de goma. És un recipient estèril conectat a un tub de vida i a un tub de goma. Aleshores se submergeix l'aparell a una certa fondària i es llança un pes cap a l'aparell que s'anomena testimoni o missatger. Quan impacta sobre aquest, es trenca el tub de vidre, permetent l'entrada d'aigua dins l'ampolla, fent que s'omplís d'aigua de forma estèril.
– Bossa papallona de Niskin. És una bossa estèril que està lligada a un suport de motlles junt amb una ganiveta. Aquesta serveix per tallar un tub de goma i és aquí per on entra l'aigua.
Avui en dia no es fa servir.
– Ampolles hidrogràfiques. És una ampolla no estèril. L'ampolla ha d'estar oberta quan la baixes fins arribar a la fondària desitjada. Es llença el testimoni fent que l'ampolla es tanqui gràcies a un sistema de motlles. Trobem de mostreig horitzontal, com l'ampolla de Van Dorn i la de mostreig vertical, com l'ampolla de Nansen. Continuament es pot mostrejar amb les fondàries que vols. També trobem l'ampolla Ruttner, utilitzada per llacs. Pot portar un termòmetre al seu interior. Trobem també l'ampolla de Niskin. Pot haver-hi problemes durant la recollida d'aigua, com la contaminació degut a la recollida amb aigua de diferents fondàries i la contaminació pel cable hidrogràfic. El braç mostrejador se separa del cable hidrogràfic al llençar el testimoni. Hi ha una xeringa a la punta, i al separar-se aquest cable lligat a la xeringa fa succionar aigua.
– Sistema CTD i rosseta d'ampolles. Presenta conectades en rosseta diverses ampolles de Niskin. Aquest sistema té un cable hidrogràfic amb una sèrie de sensors, que es poden llegir des de l'exterior. Hi ha un conjunt de cables elèctrics conectats a les ampolles i les permet obrir o tancar des de l'exterior. Amb els sensors mesures oxigen, llum, temperatura, profunditat, etc. A certa fondària decideixes quina o quines ampolles vols obrir.
SEDIMENTS: És un ambient molt estable amb una elevada diversitat i alt nombre de microorganismes.
Per mesurar els paràmetres físico-químics dels sediments s'utilitzen els microelectrodes, els quals mesuren pH, temperatura, oxigen, sulfhídric, nitrat, hidrogen, etc. Es pot mesurar a escala de mm.
Els tapets o mantells microbians són comunitats de microorganismes estratificades. Hi ha diferents coloracions degut als pigments dels microorganismes. Així per exemple, l'oxigen és més present a la part superior així com la llum, fent que hi hagi algues i cianobacteris, mentre que a la part inferior hi ha presència de sulfhídric, amb la presència de bacteris fotosintètics anoxigènics.
Els microelectrodes es realitzen en escala de mil·límetres, ja que un mantell té pocs centímetres.
Aparells utilitzats: – Dragues o corers cilíndrics. És una espècie de cullera que es baixa oberta, es recull sediment junt amb aigua.
– Box corer. Presenta una guillotina. S'introdueix en el sediment, es tira el pes i la guillotina fa tallar el sediment.
– Corer de gravetat. Pesa molt, és robust però bastant fiable.
– Multicore. Pot estar compost fins a 8 tubs (varies mostres) el poses al fons i un cop introduit el sediment hi ha uns pistons que succionen la mostra. No hi ha barreja amb aigua.
– Submarinistes i/o aparells submergibles. Alvyin és el que es va descobrir el Titanic. És una petita nau on van dues persones, el tècnic i científic. Permet baixar fns a 4000m de profunditat.
AIRE: Característiques de l'aire: – Utilitzat principalment com a medi de dispersió.
– Pocs microorganismes.
– Alta diversitat i homogeneïtat.
– Estabilitat baixa.
La recollida de microorganismes viables de l'aire requereix mecanismes que minimitzin l'estrés del mostreig i que permetin l'obtenció de mostres del tamany de les gotes de bioaerosol.
Aparells utilitzats: – Mostreig passiu. Utilitzat per espores fúngiques.
– Recipient d'Andersen. Utilitzat per bacteris. És un aparell que aspira l'aire que passa per una reixeta. A sota es fica una placa d'agar, on els microorganismes xoquen i es queden enganxats.
– Recuperació de microorganismes de plantes i animals, mitjançant fluids vitals, dissecció de teixits, productes d'excreció o mostreig de superfíce. Els que es troben en superfície es fan friccions amb un escobilló sobre la superfície a mostrejar. Els microorganismes no poden estar massa adherits a superfície, a més pot ser que hagis de recuperar la comunitat microbiana, com passa amb el virus, on no els pots separa de la cèl·lula hoste.
Els envasos on es recullen la mostra han de ser adients, de material inert i que sigui capaç de suportar fred i calor. A més, les mostres han d'estar etiquetades (data de mostreig, lloc, contingut, rèplica, etc.). Ha d'haver-hi un transport i processament ràpid, amb un temps entre congelació i descongelació mínim, molt important per tal que la comunitat sigui representativa. En alguns casos, un cop processada la mostra, s'ha de fixar. Si vols fer un anàlisi d'una hibridació in situ, s'ha de fixar un cop agafada la mostra. Per fixar s'agafa una substància que mata les cèl·lules (formaldehid o paraformaldehid).
Molt poques vegades les mostres que agafes són utilitzades per fer anàlisis. S'ha de concentrar mitjançant centrifugació o filtració, o bé diluir, mitjançant dilucions seriades. Posteriorment s'ha de tenir en compte tant si concentres com si dilueixes.
Alguns dels problemes que poden sorgir és l'efecte ampolla, els microorganismes s'adhereixen a les parets, amb una concentració de nutrients més alta i començen a proliferar. També que es dongui la mort de microorganismes, degut a l'oxigen, agitació, etc.
És important el temps de barrejar (d'agitació per suspendre els microorganismes) ja que el rendiment pot variar. S'ha d'optimitzar depenent del tipus de mostra. Així com els filtres que s'utilitzen, que poden tenir porus de diàmetres diferents. Generalment s'utilitzen de policarbonat, el diàmetre és molt homogeni.
Si les condicions no compatibles amb els requeriments fisiològics dels microorganismes produiran resultats inferiors als reals.
...

Tags: