3- Traducción (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Biología molecular de la célula
Profesor R.
Año del apunte 2017
Páginas 21
Fecha de subida 18/10/2017
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TEMA 3: REGULACIÓN A NIVEL POSTRANSCRIPCIONAL  Control postranscripcional La traducción no es la etapa principal de regulación, pero hay algunos genes que necesitan esta regulación, porque es un modo de activar o desactivar la transcripción de manera rápida.
Este control se da cuando necesitamos un cambio o regulación más fina. Su función consiste en modular finamente la expresión, en caso de que queramos niveles específicos de un producto según las circunstancias de las células.
No todos los sistemas funcionan a la vez, ni para todas las dianas. Estos sistemas actúan solo en genes concretos y en cada gen puede actuar un proceso concreto.
Después de la transcripción tenemos un RNA inmaduro, la primera regulación que observamos es el splicing, pero también puede ser modificado a nivel de localización (controlamos que haya mayor cantidad en un punto concreto), transporte a través del poro nuclear, con respecto a la estabilidad es la tasa se transcripción así como la vida lo que determina la cantidad de RNA que tenemos dentro de la célula.
La transcripción está relacionada con el procesado, ambos se llevan a cabo simultáneamente.
 Breve repaso sobre el procesado del mRNA En el esquema tenemos dibujado el DNA en rojo. Vemos que el complejo de la RNA polimerasa va produciendo RNA. Este es modificado en su extremo 5’ añadiéndole una caperuza para que no quede libre el extremo. Además queda acompañado por una serie de proteínas, el complejo de unión a la caperuza (CBC Cap Binding Complex) en el núcleo.
A partir de aquí a medida que aparecen intrones y exones aparece el splicing y otras proteínas importantes a nivel de regulación. Otras proteínas se quedan en los puntos para marcar que ha habido fusión.
Con la señal de corte y poliadenilación se corta el RNA y se añade la cola poli A, esta se asocia a la proteína PABP (Poli A Binding Protein).
Las porteínas que están en el núcleo y se unen el RNA se conocen como hnRNP (Heterogenous Nuclear Ribonuclic Protein). La diversidad de proetínas a nivel de secuencia y estructura es muy variada.
Es típico, aunque no aparece en todas, que las proteínas tengan dominio de unión a RNA, llamado RRM (Recognition RNA Motive). Otras tienen otro métodos como los dedos de cinc o la familia SR (proteínas que participan en estos procesos de modificación de RNA y son ricas en Ser y Arg). Otra familia es la DEAD, o proteínas con DEAD-box, son aquellas que tienen la secuancia de aminoácidos DEAD (aspártico-glutámico-alanina-aspárico).
1 Estas proteínas acompañan al RNA por el transito del poro. Una parte de esas proteínas una vez que llegan al citosol, vuelven al núcleo, pero otras se quedan marcando al RNA.
Tenemos proteínas que marcan al RNA desde que nace, son importantes es traducción y localización, incluso en vida media o la calidad de es RNA. El RNA nunca viaja desnudo, sino que va con las hnRNP.
En el citoplasma, el complejo de unión a la caperuza es sustituído por el complejo de inicio de la traducción eIF4E.
 Adición de la caperuza (breve repaso) La función de la caperuza consiste en proteger de las nucleasas para que el RNA no sea degradado.
El primer nucleótido suele ser una A/G (purina), tenemos un trifosfato, pero actúa un complejo reclutado por el RNA polimerasa, que está fosforilada en el residuo 5, este actúa como señal para que el complejo de adición de la caperuza vaya allí.
Una enzima multifuncional elimina el fósforo más alejado de la ribosa y adiciona la guanina monofosfato. La diferencia de este enlace es que tenemos un fosfodiéster con 3 P y además en sentido 5’→5’. Este enlace no es capaz de ser atacado por la nucleasa. Este es un control de la vida media porque para degradarlo hay que expresar esa nucleasa capaz de romperlo.
Es frecuente, además, que se metile la posición 2 de la ribosa 1 y 2.
Estos tres mecanismos se suelen conocer como cap 0, cap 1 y cap 2.
Además hay un complejo proteico que se une a esta zona para protegerla.
2  Corte y empalme de intrones/exones (breve repaso) Al proceso de corte y empalme se le conoce también como splicing.
A medida que van apareciendo exones separados por intrones, estos se van eliminando. En este proceso participan proteínas importantes como las SR.
El corte y empalme se da en secuencias conocidas. Hablamos de corte y empalme en genes de pocas copias o copia única. Hay 2 tipos de intrones, pero el procedimiento es parecido.
Hay una secuencia consenso que delimita el final del exón e inicio del intrón (lo vemos en verde y amarillo en el dibujo). La G y U son invariables, siempre tienen que estar presentes, el resto es la secuencia consenso, es decir, es la más representada y la que tiene mayor afinidad por la maquinaria. Esta secuencia es reconocida por U1.
Los genes que participan en el splicing son los snRNA, pero no todos los snRNA participan en splicing, el grupo es más grande.
Hay otra secuencia de reconociendo en el extremo 3’ del intrón. En esta secuencia hay varias pirimidinas (C y U), como unos 10 residuos. La C y U no tienen por qué ser alternantes. La A y G son invariables, es decir, si se muta perdemos el punto de empalme. Este punto es reconocido por U2. La secuencia es complementaria a una parte de este, pero hay una A que no se aparea, esta da la fuerza suficiente como para que protruya, hace que sobresalga. Esto es importante para cuando se ensamble es splisoma.
Hemos visto que U2 hace que protruya, luego se unen U5 y U6/U4 cerca de los extremos. La protuberancia tiene un OH que ataca el enlace fosfodiéster que une GG en el extremo 5’ del intrón. Esto se da con poco gasto de enregía.
Se empalma así guanina con adenina y el intrón queda ciclado, de modo que el extremo 5’ queda unido con el punto de ramificación.
Nos queda ahora libre el OH de 3’ del exón. El OH ataca ahora el enlace que unía GG, de este modo se queda unido a la guanina del siguiente exón. Lo que se hace realmente es cambiar la unión con un OH por otro. Lo que hace el splicesoma es orientarlo y colocarlo adecuadamente.
Ya tenemos los exones empalmados.
Cuando tenemos el otro grupo de intrones, la secuencia cambia y tenemos otro proceso diferente, pero es muy parecido.
(Para más información consultar el Lenhinger).
3  Procesamiento del extremo 3’ del mRNA La RNA polimerasa pasa la secuencia poli A. el complejo de corte y poliadenilación es reclutado por la RNA polimerasa que ya está fosforilada en la Ser 2.
Este complejo puede hacer el corte del RNA y añadir adenilos. No necesita molde, sino que a partir de ARO hace adición de adenosinas. Esta secuencia no es suficiente porque también importa el contexto ría arriba y abajo. No vale con la secuencia solo, además las cercanías tienen que ser abundantes en A y U.
Se corta entre uno 30-50 nucleótidos río abajo y después del corte se deja libre un OH que se usa como cebador para adicionar las adenosinas.
La cola poli A consta de unos 200-250 residuos de adenosina, tanto en el caso anterior (corte y empalme) como en este tenemos factores estimuladores que pueden bien activar bien inhibir los procesos.
En el procesamiento del extremo 3’ intervienen el complejo de corte y poliadenilación (CPSF) y el factor estimulador de corte (CstF). La cola poli A se une a una secuencia de poli A binding protein.
 El corte y empalme puede ser regulado de manera que pueda dar luagar a distintos mRNAs funcionales El hecho de que tenga un gen con 4 exones no significa que el RNA tenga que tenerlos todos, se puede saltar alguno, aunque no siempre. Como vemos en la imagen.
El 90% de los genes humanos en algún momento determinado sufren empalmes diferenciales.
Aumentamos la cantidad de producto que podemos obtener a partir de un gen, bien en tejidos diferentes o en distintas etapas del desarrollo. Se han analizados los genes humanos en todas las situaciones conocidas, el 90% de los genes sufre splicing en una situación u otra, en distintos tejido puede que se empalme de manera diferente.
Dependiendo del grado de conservación de la secuencia tenemos un punto de empalme más fuerte o menos. Pongamos que tenemos una secuencia más conservada al final del 1 y al principio del 3, pero no al principio de 2, entonces se puede hacer el salto.
Hay proteínas que estimulan o inhiben el corte y empalme.
4 En la tabla vemos distintos genes con procesamientos diferenciales, a veces se diferencian en un exón terminal, o a veces en zonas intermedias.
Por comodidad hablaremos de 3 situaciones posibles:  Variaciones en el extremo 5’ a partir de la utilización de 2 promotores alternativos Si el primer exón no está incluido a veces se debe a que tenemos dos promotores. Tenemos dos zonas promotoras en el dibujo, marcadas en rojo y dependiendo de cuál sea el promotor que prioriza en la célula y los factores de transcripción que esté expresando tendremos un corte u otro.
Si el promotor que se expresa es el X, tendremos todos los exones, pero desde Y el 1 queda excluido.
Un exón puede coincidir con un dominio y este determina la funcionalidad de la proteína que tal vez en este caso no nos interesa. Es lo que ocurre con la cadena pesada de las inmunoglobulinas.
5  Variaciones en el extremo 3’ debido a la utilización alternativa de 2 posibles señales de corte y poliadenilación Estas posibles señales de corte y poliadenilación, pueden tener intrones por medio.
Este es el caso de la cadena pesada de la inmunoglobulina. En estos exones tenemos 2 que están implicados en la expresión de un dominio que ancla el anticuerpo a la membrana. En las células B, además hay una secuencia secretora después de C4.
Lo que se ha visto en que en las células B hay 2 secuencias de corte y poliadenilación. Una es de afinidad débil y la otra alta.
Las concentraciones de CstF (factor estimulador del complejo de corte y poliadenilación) determinan cuál de las dos secuencias de corte y poliadenilación son utilizadas.
La secuencia de reconocimiento del factor estimulador en M2 se parece más a la secuencia consenso y, por tanto, tiene más interacción con la proteína. La que está delante de M1 es menos afín.
En una célula no activada, los niveles del factor estimulador son bajos, así que se unirá principalmente a la secuencia de alta afinidad, estimulando así el corte y poliadenilación después de M2, es decir habiendo pasado los exones que contienen los dominios de anclaje a la membrana. El producto final, una vez empalmado contiene los dominios de anclaje a la membrana, de modo que queda expuesta en la membrana.
Cuando hay infección o antígeno, esto causa la cascada que activa la célula y empieza a producir anticuerpo en gran cantidad y a dividirse. Aumenta la expresión del factor estimulador de corte, de modo que este ahora se unirá a los dos puntos, tanto el de alta como el de baja afinidad. La unión con el de baja afinidad causa el corte antes de los exones que codifican para los dominios de anclaje a la membrana, de modo que ahora son excretados al exterior.
En Sm la secuencia en 5’ es más fuerte que en 3’, lo normal es que empalme en 5’, pero al haber cortado antes de M1, ya esto no entra en el proceso. Se incluye así el dominio de secreción.
Es el mismo gen procesado de dos manera y cambia la funcionalidad.
6  Corte y empalme alternativo en casos donde los extremos 5’ y 3’ son idénticos Se ha descrito dos mecanismos posibles: la estimulación de un sitio de corte/empalme mediante un factor que se une en cis o la inhibición del uso de un sitio a favor de otro.
Tenemos exones intermedios que pueden ser incluidos o excluidos.
Si tenemos en cuenta que no todos los puntos de empalme son igual de fuertes, las secuencias consenso pueden estar variadas, según la variación tendrá más afinidad o menos. En el caso concreto que vemos pueden darse dos situaciones: Proteínas reguladoras que se unen a puntos cercanos de la secuencia de corte y empalme pueden estimular o inhibir splicing en un punto. Son las proteínas de la familia SR, que pueden tanto activar como inhibir el splicing.
a) Una proteína estimuladora se une a un sitio con poca afinidad para el splicing, de modo que este puede ser seleccionado. Tenemos 3 exones y en ausencia de factor que estimule o inhiba, la tendencia es que se dé un empalme de 1-3, el punto de 3 es más fuerte que el 2. Si introducimos el factor estimulador se splicing, se estimula el splicing en el punto. Aunque sea débil lo hace fuerte y permite que se dé el empalme de 1 con 2.
b) En este caso tenemos una proteína inhibidora. Un punto favorecido se inhibe. Vemos que es el caso opuesto. En eusencia de factor se empalman los 3, compiten por igual, pero al introducir el factor inhibidor, este se une cerca de la secuencia del exón 2 impidiendo este empalme y haciendo que se una 1 con 3. Aquí puede participar tabto DEAD box como SR.
 El balance de factores reguladores puede decantar el patrón de corte/empalme de exones   En algunos casos hay factores de union en cis especificos de tipo celular (Ejm. en neurona PTB2, nova 1 y nova 2).
En otros casos depende del balance relativo de factores reguladores de corte/empalme.
En neuronas es muy típico que haya este juego de factores de unión en cis en la zona de corte y empalme. Ejemplos de estimuladores son PTV2, nova 1 y nova 2. Permiten una gran diversidad de productos.
En otros casos el balance relativo de factores permite un splicing u otro.
Tenemos un factor estimulador rico en SR, que es el factor SR2. Tiene afinidad por un punto de unión, favorece el empalme de 1 con 2.
7 Otro factor estimulador es hnRNPA, que favorece el punto de splicing 1 con 3, saltando 2. En distintos tipos celulares se juega con el balance de las 2 favoreciendo un splicing u otro.
Cuando el balance es favorable a SR2, es más común el corte y empalme de todos los exones, pero cuando SF2 baja en relación a hnRNP A1, se hace de la otra manera.
Es el balance relativo y no total el que hace que se haga el splicing de un modo u otro.
 La velocidad de transcripción durante la elongación puede afectar al corte/empalme alternativo Otro factor importante es la velocidad de la RNA polimerasa.
Tenemos los intrones 1, 2 y 3. El punto de empalme de 2 es débil, y el de 3 es fuerte.
Si se transcribe a baja velocidad (la RNA polimerasa estimula empalme), como no se ha sintetizado todo el intrón 2, le da tiempo a hacer el corte y empalme de 1 con 2, aunque esta secuencia sea débil, pero es que como la fuerte no se ha sintetizado todavía, no compite, solo se puede unir en ese punto para hacer el splicing.
Si va más rápida, de modo que antes de que se forme spliceosoma, se ha transcrito el exón 3 va a competir con más fuerza esta es una secuencia más potente, favorece así el empalme entre 1 y 3.
8  RNA-seq ¿Cómo sabemos dónde están los intrones? Con el RNA-seq. Si secuencio el RNA y lo comparo con el DNA veo dónde están los intrones que he perdido. Veo que una zona no se traduce, es un intrón.
La zona de grafica que s 0 es un intron, no hay lectura.
 Edición del RNA Otro fenómeno raro, pero no tanto en neuronas es la edición de RNA. Se puede intercambiar un nucleótido por otro. Esto lo hacen algunas neuronas, pero también células del hígado y el intestino.
 Citidina desaminasa: Desamina la citosina y la pasa a uracilo (igual que hacíamos químicamente con el bisulfito).
La célula del intestino expresa la citidina desaminasa, pero no la de hígado.
Al cambiar la C por la U pasa de ser un codón que codifica para un aminoácido a ser un codón de stop. Tendremos como resultado una proteína más corta.
En el hígado se expresa la apolipoproteína APO-B100, mientras que en la célula del intestino la APO-B48, que marca la apolipoprpteína con otra señal.
 Adenosina desaminasa: En neuronas de ratón, se ha visto que hay adenosina desaminasa, que puede pasar de A (adenina) a I (inosina), ambas son purinas.
Esto lo hace el receptor de glutamato, que hay 2 variantes, en algunas neuronas hacen la variación y en otras no.
Al tener inosona, cambia el aminoácido que codifica (la I se lee como una G en vez de como una A), esto permite que el receptor sea permeable al calcio.
Cuando esta modificación se inhibe en ratón, el ratón muere debido a crisis epilépticas.
Vemos que este es un cambio esencial que ha sido seleccionado evolutivamente.
9 Nos puede surgir la duda de a ver si estamos provocando cambios en otros genes (diferentes al mío) que también necesitan la adenosina desaminasa. Para comprobarlo hicieron la mutación directamente en el DNA, cambiando A por I, cuando esto se hace el ratón sobrevive.
En función del tipo neuronal se usa una o la otra, por eso no se ha cambiado en el DNA.
La adenosina desaminasa tiene secuencia de reconocimiento de RNA, que le permite abrazar el RNA, además de la estructura secundaria. Con estas dos cosas se queda fijado con unión no covalente.
 Regulación del transporte y localización del mRNA A veces pueden interesarnos variaciones a nivel local. Podemos hacer que una proteína tenga un efecto mayor si la concentramos en un puto.
Se ha visto que en el oocito fertilizado, distintas proteínas son sintetizadas en diferentes partes de la célula. En condiciones normales la mayoría del RNA mensajero sale del núcleo y son traducidos inmediatamente, pero hay algunos mensajeros concretos que son transportados e un lugar de la célula para polarización de la célula en las futuras divisiones.
Las secuencias de reconocimiento están en 5’ y 3’ (dominios no codificantes pero igualmente importantes por la presencia de secuencias reguladoras).
La cola poli a esta en todos los RNA menos en histonas.
En 5’ y 3’ UTR (untranslated región) podemos tener secuencias reguladoras reconocidas por proteínas de unión que pueden modificar la vida media de la traducción.
Las proteínas se unen al RNA y activan la maquinaria de transporte a un punto. Lo transportan reprimido para que no se traduzca, sino que lo haga una vez llegue al punto concreto.
También encontramos RNA específicos en dendritas de neuronas. En mamíferos 400 mRNA, aproximadamente, son localizados en procesos dendríticos de neuronas.
En el núcleo se sintetizan las mRNA, pero hay proteínas que se expresan en dendritas y no en axón, esto se hace con proteínas específicas que dirigen el transporte. De nuevo, la proteína no se sintetiza hasta que no llega al destino.
Se dan dos fenómenos simultáneos, transporte y represión.
10  Regulación de la estabilidad del mRNA A veces está relacionado con las secuencias reguladoras UTR de ambos extremos, pero es más frecuente que sean las de 3’.
Se sabe desde hace tiempo que hay secuencias en mRNA que lo desestabilizan haciendo que se degrade. Son secuencias ricas en A y U (AU-rich sequences = ARE (adenine rich element)).
Se vio en el caso del gen de la caseína, había una secuencia capaz de cambiar la vida media del RNA. La vida media del mRNA de caseína de la leche aumenta en presencia de prolactina.
Este mRNA tiene una vida media de 5,4 horas, pero cuando la prolactina está presente se da una cascada de señalización y se hace que aumente su vida media a 92 horas. Siempre que la síntesis sea constante al degradar menos RNA acumulamos más producto.
Encontraron en 3’ secuencias ricas en AU y se las llevaron a otro mRNA estable como el de la betaglobina, se vio que bajaba su concentración. Estas secuencias lo que hacen es reclutar maquinaria de degradación que se une a secuencias ricas en AU, lo que se conoce como exosoma. Pero existen otras proteínas que compiten para evitar que sean degradados.
En respuesta a la prolactina hay otra proteína, que normalmente es fosforilada en respuesta a hormona que se une a la misma secuencia e impide la degradación. Esta es una respuesta rápida, los efectos se ven en pocos minutos.
Se permiten cambios de expresión en un tiempo muy concreto, normalmente este mecanismo lo usan genes en respuesta a estrés.
El 50% de las proteínas de respuesta a estrés varían sus niveles de mRNA variando su estabilidad, proteínas de la síntesis del ribosoma y proteínas reguladoras que han de actuar en un periodo muy concreto.
Estrés → Aumento de la vida media → Mayor producción de proteína.
En la respuesta también se incluye el aumento de la tasa de transcripción, pero esta respuesta es lenta y para ver sus efectos son necesarias horas, en cambio con la regulación de la estabilidad del mRNA los resultados se ven a los pocos minutos.
Tenemos genes regulados en su vida media. Algunos son oncogenes, pueden desencadenar cáncer. Son genes que sintetizan para histonas, ciclinas… No son todos de respuesta exclusiva a estrés, este fue el primer caso que se vio.
11 La estructura del mRNA en sus elementos reguladores de estabilidad (5’UTR o 3’UTR) son reconocidos por proteínas específicas que reclutan la maquinaria de degradación del mRNA (exosoma) o que protegen el mRNA de dicha degradación.
Esta secuencia reguladora que hemos comentado, tienen estructura secundaria, y estas estructuras son reconocidas por la proteínas de unió.
Se reconoce lazo y secuencia.
A nivel bioinformático se están haciendo programas que predicen la estructura secundaria (lazos…) del RNA, aspecto que se está viendo que es importante.
 Control de la traducción mediante proteínas que se unen al mRNA La vida media del RNA es regulada en función de la concentración de hierro intracelular. Si tenemos grandes cantidades de hierro, disminuye su vida media.
La proteína IRE BP, es una proteína homóloga a la aconitasa, está regulado por fosforilación ante la respuesta a hierro, siendo esta fosforilación un elemento desestabilizante que permite el reclutamiento del exosoma.
Si tenemos una proteína que proteja esa secuencia reconocida por el exosoma, como es el caso de la aconitasa, se evita que el complejo de degradación o exosoma actúe, de modo que la vida media del mRNA es más alta.
La quinasa específica fosforila la IRE BP (Iron Regulated Element Binding Protein), cuando es fosforilada el elemento que reconoce el exosoma queda libre y como consecuencia el RNA se degrada, baja la transcripción de la transferritina.
12  Traducción (el inicio es la etapa regulada) La expresión génica puede ser regulada a nivel de la traducción.
El inicio de la traducción tiene lugar en el ribosoma. Es importante que recordemos que el ribosoma cada vez que acaba la traducción se disocia en 60 y 40 S, para que se da una ronda nueva es necesario el factor de inicio de la traducción 2.
Los factores de traducción siempre llevan estas letras: eIF (eucariota iniciator factor).
El eIF2, tiene que estar unido con en GTP para unir el tRNA iniciador con la metionina específica, forma así un complejo ternario que se une a la subunidad pequeña del ribosoma en el sitio P. Este es el complejo de preinicio 43S, a este complejo es al que se le añade el mRNA.
El mRNA no va solo, sino que tiene la caperuza unida a las Cap binding proteins. El eIF4e es el factor que reconoce la caperuza. Este interacciona con 4B y 4ª, que forman el complejo que se unirá al ribosoma.
Desde aquí el ribosoma empieza a hacer scaning hasta que da con el primer AUG. Cuando lo localiza hace una parada, hidroliza al GTP a GDP del factor 2 y se libera. Una vez liberado este factor, con la ayuda de los otros factores de inicio se ensambla la subunidad grande y se comienza la traducción.
En la disociación del complejo de la traducción es clave el factor 6, que impide que las dos subunidades del ribosoma se reasocien antes de tiempo.
El principal mecanismo de regulación de la transcripción se da con el factor 2, que tiene que estar activo con GTP.
La cola poli A interacciona con el factor F y mantiene ciclado el mRNA. Cada vez que el complejo da la vuelta completa, se disocia y se ensambla, esto es la traducción dependiente de caperuza, pero hay otras posibles situaciones.
13 La traducción dependiente de caperuza depende de que tengamos factor 2 unido a GTP, es un mecanismo de control de la traducción.
Cuando la célula está sometida a estrés, se para la traducción.
 Control en la traducción a nivel de modificación del aparato de traducción Cuando las células son expuestas a estrés la traducción es reprimida mediante la modificación de factores de traducción.
Existe un factor, el 2B, que es una proteína que se une al factor 2 cuando este está unido a GDP y permite su activación intercambiando GDP por GTP.
Este factor 2B está, estequiométricamente, en menor concentración que el factor 2, es limitante. Esto tiene sentido porque es un catalizador.
Una parada total de la traducción en situaciones de estrés hace que se fosforile el factor 2B y cuando el factor 2 se une a él no puede disociarse, por lo que el factor 2 no puede catalizar más intercambios, se bloquea el ciclo de reactivación de intercambio de GDP por GTP.
En condiciones normales se suele tener una traducción dependiente de caperuza, el ribosoma hace escaneo hasta el AUG, pero esto no se puede hacer al estar bloqueado el factor 2 unido a GDP. Si bien existe un pool de RNA que se puede saltar este control, los RNA de respuesta a estrés.
 Control de la Traducción. Los elementos IRES permiten la traducción independientemente de CAP5’ En situación de estrés las proteínas de respuesta a estrés pueden continuar traduciéndose gracias sus elementos IRES.
Los mRNA de respuesta a estrés, es habitual que tengan IRES (Internal Ribosome Entry Site). Estos elementos IRES permiten ensamblar el ribosoma sobre ellos y así no se necesita el factor 2 ni los factores F de antes.
14  Control de la Traducción. Modificaciones en la maquinaria de la traducción Cuando las células son sometidas a una situación que induce apoptosis el eIF4G es degradado por caspasas inactivando también la traducción dependiente de CAP5’.
Un mecanismo paralelo o muy parecido para situaciones concretas es el que funciona para la apoptosis.
Selectivamente el factor 4G es degradado por las caspasas, de modo que se inhibe la traducción dependiente de caperuza.
En apoptosis tenemos mRNA con IRES que permiten la traducción independiente de la caperuza. Esto solo está en apoptosis, el resto es repirimido.
 Control de la Traducción. Modificaciones en la maquinaria de la traducción En otros casos la regulación es a nivel de eIF4Ebp por ejemplo en respuesta a insulina.
Otro caso es el de la proteína que se une al factor 4E BP. Esta es una proteína represora, que se une al factor 4E que se une a la caperuza e inhibe la traducción dependiente de caperuza.
Se sabe que cuando hay altos niveles de insulina, la traducción dependiente de caperuza aumenta entre 2 y 3 veces (condición happy flower). Para evitar el factor regulador inhibidor de la traducción dependiente de caperuza, en presencia de insulina es inhibido mediante fosofrilación, esto impide que se puede reprimir la traducción dependiente de caperuza.
15  Control de la traducción mediante proteínas que se unen al mRNA Los elementos que controlan la vida media del mRNA también pueden funcionar para controlar la traducción.
Se sabe que la ferritina, en respuesta a hierro aumenta su expresión. Hace lo contrario que el receptor. Se sabe que tiene un elemento de unión en respuesta a hierro, y se une la misma proteína que en el mRNA, la aconitasa.
En la ferritina, la aconitasa no regula la vida media del RNA. Cuando el elemento de unión está en el 5’ UTR, la unión de esta proteína de reconocimiento lo que hace es reprimir la traducción, impide que el ribosoma haga el escaneo. Solo cuando hay hierro y se fosforila la aconitasa, se desbloque este IRE y se permite la traducción.
Vemos que estamos usando las mismas secuencias y proteínas que hemos visto anteriormente, pero en distintos lugares. En un caso con el hierro aumenta la traducción, mientras que en el otro se degrada el mRNA.
Hemos visto, por tanto, que las secuencias ricas en AU pueden regular tanto la vida media como la traducción el mRNA:  RNAs reguladores Los lncRNA (Long Non-Coding RNA) pueden regular la traducción y la vida media, pero no hablaremos de ellos, se conoce muy poco.
Small RNA, miRNA, siRNA y piRNA son todos inhibidores.
Todos estos RNA pueden actuar a nivel de traducción, con los complejos RITS y RISC (los dos con proteínas de la familia argonauta, uno a nivel de transcripción y el otro a nivel de traducción).
Pueden actuar en represión de la traducción o afectando a la vida media.
16 Las tres tienen una longitud similar, respecto a la cadena sencilla, en algún momento se vuelven dobles, si no, no funcionan. El procesamiento cambia, unos controlan la expresión otros los transposones.
Los transposones son elementos móviles de DNA que permiten que se puedan translocar en el genoma.
piRNA actúa inhibiendo este proceso.
 miRNAs (Micro) Se descubrió en gusano, cuando estudiaban los genes lin4 y lin 14. Cuando inactivaban lin4 , se activaba lin14.
No encontraron la proteína de lin4, su producto es RNA y lo que hace es hibridar con el mRNA de lin14, haciendo que se inhiba la expresión génica de este.
 Origen del miRNA: Cuando comenzaron a estudiarlo en detalle, se dieron cuenta de que genes como lin4 eran transcritos como los otros, pero en la estructura había zonas de doble hebra. Estas zonas eran reconocidas por una proteína en el núcleo (Drosha).
El pre-miRNA es degradado por Dosha, que corta la cadena sencilla. Así queda un fragmento de doble hebra de unos 70 nucleótidos con una estructura determinada.
Una vez cortado tenemos el pre-miRNA, que va al citoplasma, donde es reconocido por a proteína Dicer. Esta proteína causa el cote del resto de RNA de cadena sencilla, así nos queda solo una doble cadena.
Una de las dos hebras de esta doble cadena es degradada y ya tenemos el miRNA maduro. Esta hebra es la que puede hibridar con los mRNA maduros.
Puede hacerlo tanto por complementariedad parcial (regula traducción), como por complementariedad total (control de la vida media).
17  siRNAs Los siRNA (small interfearing RNA) se descubrieron en un mecanismo en plantas. Se ha usado mucho para inhibir la traducción, incluso a nivel terapéutico.
En plantas se usa para defensa contra virus. Cuando el virus le inyecta el RNA de doble hebra, con la proteína Dicer lo fragmenta y elimina una hebra. Los fragmentos que quedan hacen degradaciones de mRNA.
Los siRNA hibridan con el RNA del DNA del virus y los inhiben.
Esto se quedó en mera curiosidad, pero al hacer transgénicos, se dieron cuenta de una cosa muy curiosa, si yo quiero aumentar la expresión de un gen determinado, lo clono, hago copias y estas las inserto en la célula debería tener un aumento de la expresión. Para ello se anlizan varias líneas celulars distintas, para ver dónde es mejor insertarlo. Cuando cuantificaban las copias en el DNA veían que había como 2 o 3 más, pero no había rastro de la proteína, ni de la insertada ni de la copia endógena.
Cuando esto ocurre es que el transgen se ha insertado en el entorno que actúa en el sentido inverso.
Así que tendremos un RNA de doble cadena y se activa el mecanismo de defensa del que hemos hablado previamente, se inhibe todo, tanto las copias, como la proteína normal.
 siRNAs en mamífero: ¿Qué implicación tiene esto en una célula normal? Se encontró que esto mismo ocurría con los genes homólogos.
Debido a transposiciones y duplicaciones tenemos varias de un mismo gen, a veces inactivas. En algunos casos, pseudogenes están en un lugar con un promotor en sentido inverso, se da exactamente el mismo mecanismo de control.
Si el promotor está regulado, a veces se inactivará el gen y otras no. Este es un mecanismo que aparece al azar en la célula, pero esta lo readapta como mecanismo de control.
18  Mecanismo de represión de la traducción por miRNA La proteína argonauta al CAP5’ inhibirá la traducción.
Si se unen al complejo RISC, en el cual hay una proteína argonauta, algunas variantes de argonauta son capaces de sustituir el factor 4E en la unión de la caperuza, con lo cual lo que hacen es inhibir la traducción dependiente de caperuza. Para esta el factpr 4E es necesario, así que al ribosoma no se puede unir a partir de la caperuza y hacer el escaneo.
eIF6 se puede asociar al complejo RISC, lo que inhibirá la asociación de la subunidad 60S.
En otros casos, lo que ocurre es que el complejo RISC recluta el factor de traducción 6 e impide que las dos subunidades de los ribosomas se ensambles, como no se ensamblan, se inhibe la traducción.
 Efecto a mayor escala de los miRNAs sobre factores reguladores Después de lo que hemos visto habría que preguntarse, ¿los miRNA siempre reprimen? La respuesta es no, ya que no actúan sobre una única diana, sino sobre varias. Todas las secuencias similares serán correguladas.
Cuando empezaron a estudiar los miRNAa, vieron que si actúan sobre un mRNA de un gen concreto que codifica para una proteína no reguladora, siempre reprime a nivel de traducción o vida media, pero si es un gen de una proteína reguladora cambia, dependiendo de lo que haga esa proteína.
Si actúa sobre un gen de una proteína reguladora, depende de si la proteína es activadora o represora. Si es activadora, veremos represión de un conjunto mayor de genes. Imaginemos que actúa sobre un factor de respuesta a estrógeno, los genes de respuesta a estrógeno estarán reprimidos. Pero si es inhibidora, al actuar como represor de la transcripción, tendremos la activación de un conjunto de genes que estaban siendo reprimidos por la proteína reguladora.
Puede haber represión o activación como resultado final, pero sobre la diana siempre es inactivación.
19  Mecanismo habitual de degradación del mRNA La cola poli A actúa en la estabilización del mRNA, la cola poli A forma un ciclo con la caperuza, conectándose con el factor 4F. Este ciclo también es un modo de protección.
Cuando el mRNA envejece, si se paraliza la transcripción y veo una diana concreta, observo cómo se va perdiendo la cola poli A, porque el mecanismo de degradación es a través de la pérdida de la cola poli A, es un mecanismo dependiente de deadenilación.
El complejo CCR4NOT se encarga de degradar la cola poli A paulativamente; una vez hemos perdido suficientes A, entran en juego los mecanismos de degradación del mRNA.
Uno de ellos actúa de la cola en adelante, río arriba (3’ → 5’). Estos mecanismos implican el exosoma, pero solo se da cuando el complejo CCR4NOT ha degradado bastante.
Simultáneamente, actúa otro mecanismo mediante el cual el complejo LSM recluta proteínas de decaping, que participan en la eliminación de la caperuza. El compejo LSM va a la cola y recluta las decaping en la zona de la caperuza, que actúan eliminándola. Dejamos así el extremo 5’ desprotegido y empiezan a actuar las nucleasas. Este mecanismo actúa en sentido 5’ → 3’.
 Control de calidad: eliminación de mRNA con codón stop prematuros (NMD) En los puntos de unión exón-exón, hay proteínas (exón junction complex). Estas proteínas acompañan al RNA desde el núcleo al citoplasma, pero tienen más funciones, determinan cuándo el codón el stop está antes de lo que debe. Activa procesos de degradación no dependientes de deadenilación.
20  “P-bodies” y gránulos de estrés Cuando se produce la degradación de RNA en una célula sana, vemos solo el RNA asociado al polisoma haciendo la traducción, pero cuando la célula está sometida a estrés vemos orgánulos (que no son tales, porque no tienen membranas), que no son visibles en células sanas.
Los “P-bodies” son ricos en RNA reprimido transcripcionalmente y que va a ser degradado. Tiene proteínas implicadas en degradación como CCR4NOT, decaping… Estos compartimentos están en equilibrio con la traducción, en condiciones normales hay pocos P-bodies, pero en condiciones de estrés vemos muchos, hay una disminución del polisoma Los gránulos de estrés no contienen maquinaria de degradación, sino que contienen proteínas de regulación de la traducción y de la vida media. La proteína TIA se une a elementos ricos en AU (ARE).
La célula, en condiciones de estrés, lo que hace es dejar en estos gránulos de estrés RNA que luego puede necesitar, pero si va a degradar el RNA los lleva a los P-bpdies.
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