Tema 6 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2014
Páginas 20
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 41
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Tema 6.1. CINÈTICA ENZIMÀTICA: INHIBICIÓ Fins ara hem estudiat la transformació de substrat a producte en reaccions catalitzades per enzims. En aquest tema veurem que hi ha molècules que sense participar directament en el mecanisme de catàlisi, la seva presència en el medi de reacció fa que l’enzim estigui inhibit, és a dir, que la reacció vagi a una velocitat inferior.
FUNCIONS DE LA INHIBICIÓ ENZIMÀTICA La inhibició enzimàtica té una gran diversitat de funcions, entre les quals destaquem:  La inhibició de l’activitat dels enzims és un dels sintemes de regulació més importants pel bon funcionament de l'organisme. Recordem que l’activitat de l’enzim s’ha d’ajustar a les necessitats biològiques de les cèl·lules.
 Els inhibidors ens permeten, a nivell cinètic, diferenciar entre diferents mecanismes enzimàtics.
 La inhibició ens permet obtenir informació sobre l’estructura de l’enzim i el seu centre actiu. Els podem fer servir a l’hora de resoldre la estructura tridimensional de l’enzim, de manera que la seva localització ens donarà informació sobre aquesta.
 Es pot utilitzar en aplicacions clíniques ja que sabem que una part molt important dels fàrmacs són inhibidors d’activitats enzimàtiques.
 També es poden utilitzar en aplicacions industrials on la major part dels herbicides són inhibidors enzimàtics.
INHIBICIÓ PER EXCÉS DE SUBSTRAT Quan parlem d’inhibició no parlarem de la pèrdua d’activitat enzimàtica per una desnaturalització ja que aquest no és un efecte característic de la inhibició enzimàtica.
En ocasions, el producte de la reacció pot actuar disminuint la velocitat de la reacció, és a dir, el propi producte pot actuar com a inhibidor. Quan analitzem la velocitat de la reacció en funció de la concentració de substrat, veiem que en determinats casos en comptes d’haver-hi una estabilització de la velocitat, en velocitat màxima, es produeix una davallada.
Aquesta disminució pot ser deguda a la presència de llocs alternatius al centre actiu que trobem en el propi enzim i que tot i tenir una afinitat menor pel substrat, si la [S] és molt elevada, el substrat es podrà fixar en aquests centres. Així doncs, si es produeix aquesta interacció es forma un compost terciari que té una menor velocitat que el complex binari.
Per tant, podem tenir una inhibició per producte o bé per substrat. Però, el que realment ens interessa són les inhibicions elaborades per molècules diferents a R o P.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 INHIBIDORS REVERSIBLES I IRREVERSIBLES Trobem tres grans grups d’inhibidors que podem diferenciar en: reversibles, irreversibles i de fixació forta.
Inhibidors reversibles Reversibles --> formació del complex enizm- inhibicodr depen de la concentració d'inhibicor que hi ha en el medi. CO mmajr sigui la concentració, més desplaaçda estarà la reacció cap a les molècules inhibides.
 Aquest sistema com que es un equilibri, funciona ràpidament i és revesible  a nivell experimental, podem aiilar libihidor in vitro per dialisi, dlució, gel filtració, etc.
 Tots aquells farmacs que s'agrupen sota ___21 Inhibidors irreversibles  Irreversibles --> queden units de manera covalentment a l'enzim  el procesd 'inhibició és cinètic___  Generalment, la inhibiicio sol ser més lenta i en principi no pot er revertit. En situacions biològiques només es reverteix l'acticitat, sintetitzant enzm de nou.
 Exemple: farmacs qeu actuen per disminuir la resistencia dels abcteris en els antibiòtics.
Inhibidors de fixació forta  Inhibidors de fixació forta  aquest tipus dinhibodr,sdetrada no suneixen covalentment a l'enzim, però lafinitat és tan forta fque practicamentes comporten com irrevrsbles. --> Ki molt petitat  En aquests casos, com que la fixació és tan foata , tot i que disminuim la concentració d'inhibidor no es reversible la reacció. En situacions biològiques es podrà revertir l'activitat si se sintetitza enzim de nou.
 Exemple: proteases que actuen sobree el viirus Hiv 25__ 2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 INHIBICIÓ REVERSIBLE La inhibició reversible és un procés on la quantitat d'enzim inhibit depèn de la concentració d’inhibidor ja que es tracta d’un equilibri. Quan nosaltres estudiem la inhibició reversible podem determinar diferents opcions: 1.
Inhibició competitiva En el cas de la inhibició competitiva, l’inhibidor únicament es pot unir a l’enzim lliure. Així doncs, totes aquelles molècules que formin el complex ES ja no es podran unir a l’inhibidor. En la inhibició competitiva, el substrat i l’inhibidor competeixen per unir-se al centre actiu de l’enzim. La constant d’inhibició es defineix com KI.
2.
Inhibició acompetitiva La inhibició acompetitiva, l’inhibidor només es pot unir al complex ES. La constant d’inhibició en aquest cas es defineix ’ com KI .
3.
Inhibició mixta En la inhibició mixta, els inhibidors poden unir-se tant a l’enzim lliure com al complex ES. Així doncs, per una banda tenim ’ la constant d’inhibició KI i per una altra la KI .
Sabem que quan aquestes dues constants coincideixen, estem en el cas d’una inhibició no competitiva.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Inhibició competitiva Veiem a l’esquema un exemple d’una inhibició competitiva on l’enzim s’uneix al substrat o bé a l’inhibidor. La gran majoria de vegades, quan l’inhibidor ha interaccionat amb l’enzim, independentment del seu grau de bloqueig, el substrat no té la capacitat d’interaccionar amb el centre actiu.
La velocitat de formació del complex EI és: i la velocitat de trencament del complex EI és: .
Així doncs, com més petita és Ki, més gran és l’afinitat per l’inhibidor i en conseqüència, més gran és la seva efectivitat.
Quan estem en estat estacionari es compleix: .
Equació de Michaelis Menten en presència d’inhibidor. Inhibició competitiva A continuació desenvoluparem l’equació de Michaelis Menten en presència d’inhibidor. Per una banda hem de considerar que l’enzim inicial el trobarem en 3 formes diferents: com a enzim lliure, formant complex ES i formant complex EI. En una inhibició competitiva mai no trobarem complex terciari ESI.
Veiem que la velocitat de la reacció depèn de la concentració del complex ES, i per tant depèn de la concentració d’inhibidor que és capaç d’interaccionar amb l’enzim. Sabem que si la concentració d’inhibidor és molt petita, la seva acció és menyspreable i és això el que ens permet explicar que tot i que hi hagi inhibidor es pugui arribar a Vmax.
Podem definir la concentració del complex ES en funció de la Km. Per fer-ho considerem les premisses de l’estat estacionari.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Obtenim una expressió del complex ES que es troba en funció de la concentració de substrat i de l’enzim inicial. Si ho substituïm a l’equació de la velocitat inicial, arribem a l’expressió de Michaelis Menten.
Observem que la velocitat màxima no és alterada per la presència d’inhibidor ja que aquesta pot ser contrarestada amb una elevada concentració de substrat. Per una altra banda determinem que la Km sí que es veu afectada, concretament, tenim una Km aparent que és més gran que la real. Així doncs, la presència d’inhibidor fa que per tenir la meitat de la velocitat màxima, necessitem més concentració de substrat; trobem una relació que indiquem a continuació: Observem un valor de Km aparent més gran que el real, de manera que equival a què la afinitat de l’enzim pel substrat disminueix però cal tenir present que no és així sinó que la velocitat disminueix perquè tenim enzim ocupat interaccionant amb l’inhibidor.
Càlcul de la constant d’inhibició (KI) Per tal de calcular la constant d’inhibició per a un determinat inhibidor disposem de 3 mètodes: linealització de la corba de Michaelis – Menten, representacions secundàries i mètode de Dixon.
Linealització de la corba de Michaelis – Menten La linealització de la corba de Michaelis – Menten ens permet saber quin és el tipus d’inhibidor. Per un inhibidor competitiu obtindrem que per a diferents concentracions d’inhibidor, l’ajust dels punts experimentals coincidiran en un punt a l’eix d’ordenades que fa referència a l’invers de la velocitat màxima.
Com més gran és la concentració d’inhibidor, més gran és el pendent de la recta, és a dir, més gran és α. El punt d’intersecció amb l’eix d’abscisses estarà sempre desplaçat cap al 0.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 SI linealitzem l’equació de Michaelis – Menten en presència d’inhibidor obtenim: De la fórmula podem deduir que la Ki coincideix amb aquella [I] en què el valor de la Km aparent duplica el valor de la Km real. A partir de l’equació de Lineweaver – Burk en absència i presència d’una determinada [I], es pot tenir la relació entre les dues pendents de les corresponent rectes.
El problema de determinar la Ki a partir d’aquest mètode és que la aproximació està feta a partir d’una [I] i així estem limitant els resultats experimentals. En conseqüència podríem obtenir una Ki poc fiable i per tant, necessitem sistemes que ens permetin fer el càlcul més precís.
Representacions secundàries Per a determinar de forma més correcta el valor de la constant d’inhibició es pot fer una representació secundària de les dades cinètiques obtingudes a diferents [I]. Un cop hem calculat les diferents Km aparents, les representem en funció de la concentració d’inhibidor.
Sabent que el punt que talla l’eix d’ordenades fa referència a la Km i el que talla l’eix d’abscisses a –Ki, podem calcular la constant d’inhibició per a l’inhibidor.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Mètode de Dixon El mètode més general per determinar Ki és mitjançant el mètode de Dixn que és el més precís. A partir de la gràfica obtinguda pel mètode de Lineweaver – Burk es dedueix una gràfica secundària on es representa el valor de 1/Vo vs la concentració d’inhibidor a dues o més concentracions de substrat.
Observem que per a cada concentració de substrat, les rectes es creuen en un punt i que el valor d’abscissa d’aquest coincideix a la Ki. Per tal de calcular aquest punt d’intersecció matemàticament, diem que 1/v1 =1/v2. Arribem a una expressió que únicament serà certa quan [I]=Ki ja que [S1] no pot ser igual a [S2], per definició.
Inhibició acompetitiva En la inhibició acompetitiva, els inhibidors només interaccionen quan el complex ES està format. Cal tenir present que aquelles molècules que tenen inhibidor no tenen activitat. Definim la constant d’inhibició com: Per poder definir l’activitat en funció de la presència d'aquest inhibidor fem un tractament anàleg al cas anterior.
Aquest cas difereix de l’anterior en el fet que la velocitat queda en funció del terme α’ que està modificant el terme de substrat del denominador.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Si tenim valors elevats de [S], la Km és menyspreable de manera que la velocitat màxima tendeix al valor de Vmax/α’. Per tant, en aquest cas, l’efecte de l’inhibidor no es reverteix quan la concentració de substrat augmenta.
Per una altra banda, a valors de [S] molt baixos ([S]<<Km), l’efecte de l’inhibidor es pot menysprear.
En aquest tipus d'inhibició veiem que quan es produeix l’equilibri de formació de ES, part d'aquest va cap a la formació de ESI, fent que la presencia d’inhibidor desplaci l’equilibri cap a més formació de complex ES, de manera que el valor de Km més petit. Així doncs, aparentment observem que l’enzim té més afinitat pel substrat però això no és veritat, continua tenint la mateixa).
Quan elaborem la representació de Lineweaver – Burk observem que en presència d’un inhibidor acompetitiu, a diferents concentracions d’inhibidor (diferents α’) obtenim línies paral·leles.
Així doncs, obtenim en relació a diferents [I], una família de línies paral·leles amb un pendent Km/Vmax (igual que pels valors en absència d’inhibidor. La intersecció en 1 /[S] correspon a –α’/Km i en 1/Vo a α’/Vmax.
La inhibició acompetitiva requereix que l’inhibidor no tingui afinitat per l’enzim lliure i per tant, Ki tendeix a infinit. En canvi, Ki’ és finit ja que requereix que hi hagi afinitat pel complex ES. Cal tenir present que això és contrari al que obtenim en la inhibició competitiva.
Inhibició mixta En la inhibició mixta observem que l’inhibidor es pot unir tant a l’enzim lliure com al complex ES, de manera que la formació del complex amb l’inhibidor no és excloent. Com que hi ha dues possibilitats de formació del complex amb l’inhibidor, tenim dues constants Ki (formació EI) i Ki’ (formació EIS. Cal tenir present que partim de la suposició que aquestes dues constants no tenen perquè coincidir.
El tractament matemàtic torna a ser el mateix que en els casos anteriors amb la diferència que hi ha més constants ja que hi ha més equilibris: 8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Quan fem la corresponent transformació a la formula de Michaelis – Menten i la representació obtenim: De manera que el valor de la Vmax està afectat per α’ i el terme Km està afectat pel quocient α/Vmax.
A la imatge veiem que totes les rectes conflueixen en un punt que està fora dels eixos d’abscisses i ordenades. Cal tenir present que el podem trobar tant per sobre de l’eix X com per sota. En la inhibició mixta s’observa variació en les dues constants cinètiques: Km i Vmax.
Depenent d'aquestes relacions, la representació ens donaria per sobre o per sota de l’eix d'abscisses.
Inhibició no competitiva Si Ki = Ki’ (α = α’) les rectes obtingudes a diferents [I] tenen el punt d’intersecció en l’eix d’abscisses, corresponent a 1/Km. Així doncs en aquestes condicions, l’efecte sobre la Km serà nul però la velocitat màxima es veurà afectada. Quan tenim aquesta situació l’inhibidor es coneix com inhibidor no competitiu.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 RESUM Representació de l’efecte dels diferents inhibidors reversibles Taula resum de les característiques dels mecanismes d’inhibició reversibles Representació de Dixon 10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 INHIBIDORS REVERSIBLES. APLICACIONS FARMACOLÒGIQUES El primer grup de molècules amb propietats antibiòtiques que es van identificar van ser les sulfamides que frenen el creixement bacterià.
Hem vist que a les reaccions enzimàtiques o metabòliques, quan hi ha transferència de grups monocarbonats, sovint intervé el tetrahidrofolat. Sabem que aquesta molècula o les seves derivades no les sintetitzem nosaltres ja que els precursors els ingerim amb la dieta. Concretament necessitem dels precursors: 6 – mteilpterina, p – aminobenzoat i glutamat.
El motiu pel qual interfereixen les sulfamides en el creixement bacterià resideix en el fet que moltes vies de síntesi bacterianes utilitzen el p – aminobenzoat i les sulfamides actuen com a inhibidors competitius. Així doncs, en presència de sulfamides es bloqueja la síntesi de tetrahidrofolat i els bacteris no poden sobreviure.
CONCEPTE DE IC50 El concepte de IC50 s’utilitza molt en el camp dels fàrmacs per tal d’avaluar la seva eficiència. Aquest paràmetre té una certa relació amb el càlcul de la inhibició enzimàtica. Cal tenir present en quines condicions podem aplicar aquest concepte i en quines no i a més a més, quines són les conclusions que podem treure.
Quan tenim una molècula que té un efecte, el IC 50 és un terme biològic, no enzimàtic, i ens diu quina és la concentració de la molècula que produeix el 50% de l’efecte observat. Quan fem un anàlisi dosi – resposta , la representació implica una gràfica logarítmica de la concentració de l'efector. Observem a la imatge que està en funció d’un màxim de resposta (1) i un mínim (0).
En aquest tipus de comportament veiem que obtenim unes corbes de tipus sigmoidal on podem determinar quina és la concentració de l'efector que hem dona el 50% de resposta. Aquest sistema és molt útil perquè per exemple si a la industria farmacèutica cal avaluar fàrmacs o molècules que ho poden ser, el que es fa és calcular els valors de IC50. Així doncs, aquells que donen l'efecte més bo són els que anem seleccionat 11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Premisses per aplicar el concepte de IC50 Quan analitzem l’efecte de IC50 sobre un procés, treballem sota unes certes condicions. Per exemple, quan treballem en el camp dels enzims i els inhibidors, amb el IC 50 podem veure quin és l’efecte de l’inhibidor sobre la velocitat. Així doncs, al gràfic podem veure quina és la velocitat respecte la màxima a diferents concentracions d’inhibidor i a una determinada de substrat.
El valor de IC50 depèn de quina és la concentració de substrat i alhora de quines són les condicions en les quals l’hem determinat. En la imatge veiem que el valor de IC 50 varia en funció de [S] que hem utilitzat; en aquest cas quan teníem [S]=Km i [S]=10Km.
És important considerar això ja que quan volem repetir un experiment fet anteriorment o bé fet per uns altres investigadors, hem de garantir que estem treballant en les mateixes condicions, tant de pH, força iònica com en la concentració de substrat. Així doncs, el IC50 és un sistema d’anàlisi d’interaccions biològiques molt diverses que podem aplicar en sistemes enzimàtics.
Aplicació del concepte en l’anàlisi de fàrmacs Inhibidors dels enzims COX (ciclooxigenases) Les ciclooxigenases són enzims que participen en la biosíntesis de lípids anomenats tromboxans i prostaglandines, que estan implicades en respostes biològiques molt diverses com la secreció de la mucosa gàstrica, processos inflamatoris, articulacions, febre, contracció del úter....
Les diferents prostaglandines provenen d’un metabòlit comú: arachidonat. En la primera reacció aquest es converteix en PGG2 per acció d’aquests enzims, dels COX. Aquests enzims són inhibits per fàrmacs del tipus antiinflamatoris no esteroideos (NSAIDs o AINEs). La inhibició d’aquesta reacció genera un problema ja que si inhibim la síntesi de prostaglandines a nivell del producte final potser estem inhibint algun procés que potser l’organisme necessita per funcionar correctament.
Dels enzims amb activitat COX trobem de dos tipus:  COX1: associat a la regulació de la mucosa gàstrica en l’estomac  COX2: implicat en la biosíntesi de prostaglandines associades amb el dolor i la inflamació Veiem que tant l’estructura de COX 1 com la de COX2 són molt similars entre elles, és una estructura formada per un heterodímer on tenen una part unida al reticle endoplasmàtic, el lloc d’entrada de l’àcid arachidonit i el lloc d’interacció dels fàrmacs.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Si una persona utilitza com a fàrmac l’aspirina o l’ibuprofè depenent de l’eficàcia d’aquest sobre la forma COX1 o la forma COX 2 pot ser que se li millorin els efectes inflamatoris (que la inflamació baixi) però també pot tenir com a conseqüències que la mucosa gàstrica de l’estomac funcioni incorrectament i per tant, el sistema digestiu no acabarà de funcionar correctament.
En el camp dels fàrmacs el que es va veure és que a partir de l’anàlisi estructural de les formes COX 1 i COX 2 tot que es va veure que eren molt similars entre elles hi havia una petita regió, una zona de connexió corresponent a la interacció amb el reticle endoplasmàtic que es diferent i per tant, es poden generar els fàrmacs amb més especificitat en que, per exemple, l’aspirina té un 0,45 de IC50 per COX1 mentre que és de 13 per COX2 Per cadascun dels fàrmacs es pot calcular la relació entre COX1 i COX2 amb el quocient COX2/COX1, en que, l’aspirina té una relació de 3 i per tant, és més important i efectiva en la COX2 tot i que l’efecte secundari sobre la COX1 també pot ser important. Trobem altres fàrmacs en que la relació de IC50 és molt favorable per la COX2, és a dir, que té molts efectes sobre aquest i pocs sobre COX1 i per tant, aquests van ser molt importants per millorar els processos inflamatoris ja que l’avantatge que tenen és que inhibeixen molt COX2 i pràcticament res COX1 tot i que en el mon farmacològic es va generar una controvèrsia perquè aquests tenien efectes secundaris en pacients amb altres patologies.
D’alguna manera, a partir de l’estudi de IC50 es pot avaluar la capacitat d’un fàrmac sobre un determinat enzim. Trobem molts inhibidors enzimàtics que actuen per mecanismes diferents i que tenen utilitats clíniques en un ampli ventall de malalties com antibiòtics o derivats de la penicil·lina.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 INHIBICIÓ IRREVERSIBLE Els inhibidors reversibles es caracteritzen perquè hi ha un equilibri en la formació del complex enzim – inhibidor que depèn de la concentració d’inhibidor. En una inhibició irreversible, en els seus inhibidors el que observem és la unió covalent de l’inhibidor a l’enzim i per tant, això és un procés cinètic, és la transformació de l’enzim cap a una nova forma modificada, diferent a l’anterior.
Tal com vem veure en les característiques generals, l’enzim modificat només pot recuperar l’activitat per síntesis de nou enzim ja que aquesta reacció no pot tirar enrere, no es tracta d’una reacció reversible.
Efecte dels inhibidors irreversibles en l’activitat de l’enzim El que hem de veure de forma important és que la inhibició segueix un procés cinètic, és una reacció que té una transformació i per tant, la velocitat de transformació depèn de la formació del complex enzim – inhibidor, el canvi en el temps depèn de la constant de la velocitat per la concentració d’inhibidor.
Si desenvolupem les expressions anteriors arribem a una expressió en que hi ha una relació logarítmica entre l’activitat que hi ha en una preparació al cap d’un cert temps (t) en funció de l’activitat inicial. Aquest aspecte depèn de la constant de velocitat de la reacció, del temps i de la concentració d’enzim.
Si elaborem la representació de l’activitat/activitat inicial en funció del temps veiem que per cadascuna de les concentracions d’inhibidors tenim un pendent que és un reflex de la velocitat d’aquest inhibidor. Així doncs, com més elevada és la concentració d’inhibidor més ràpidament s’inhibeix l’enzim. El pendent de cadascuna de les situacions depèn de la concentració del inhibidor i de la constant d’aquest.
Inhibidors irreversibles inespecífics Aquests inhibidors són molècules que reaccionen covalentment amb l’enzim i disminueixen la seva activitat però no tenen cap tipus de reconeixement específic de l’enzim sobre el qual actuen sinó que la seva base d’acció és la seva capacitat reactiva sobre cadenes laterals de certs tipus d’aminoàcids. Els principals aminoàcids que són modificats per la reactivitat són la cisteïna, histidina, lisina i tirosina, en que, generalment trobem un grup electròfil que forma un enllaç covalent amb un nucleòfil de l’enzim.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Marcadors d’afinitat A nivell d’estructura tenen com a característica que hi ha una part de la seva estructura que té afinitat pel centre actiu de l’enzim i per tant, hi ha un reconeixement específic enzim – inhibidor. Per una altre banda, hi ha un grup reactiu que permet la unió covalent del inhibidor amb l’enzim per tant, tenen especificitat per la part de la molècula que és reconeguda pel centre actiu (Els anteriors només tenen la reactivitat però no és específica).
Així doncs es produeix una reacció covalent que com a conseqüència té la formació d’una unió covalent d’un electròfil amb un nucleòfil i això ens dona dos avantatges:  Dóna especificitat a la reacció inhibida, cal un reconeixement previ  El reconeixement específic afavoreix a un increment de la concentració local d’inhibidor en el centre actiu perquè la afinitat fa que la interacció inicial del inhibidor sigui gran, la unió covalent ha de ser fàcil.
Un exemple d’aquest tipus de reactiu és la aspirina en que hi ha un aminoàcid que serina tant en COX1 com en COX2. La part de l’aspirina que és reconeguda per afinitat del centre actiu és la seva estructura d’anell (reconeix la part hidrofòbica) i per altre banda, la seva part reactiva és el grup acetil. La reacció que es produeix permet l’acetilació de la serina i per tant aquesta no pot elaborar la seva funció de manera que, actua com un marcador d’afinitat.
Marcadors d’afinitat (inhibidors irreversibles dirigits al centre actiu) Aquests es troben dins dels marcadors d’afinitat i són marcadors anomenats substrats suïcides o bé inhibidors basats en el mecanisme. D’alguna manera, l’inhibidor és reconegut igual que pel marcador d’afinitat (interacció en el centre actiu) però per una altre banda, en la reacció el que es produeix és que l’inhibidor es transforma parcialment pel propi mecanisme de l’enzim, en interaccionar sobre el centre actiu, el mecanisme catalític de l’enzim actua sobre l’inhibidor de manera que es genera una certa recció però mai no acaba amb l’alliberació d’un producte. Així doncs el que tenim és que el substrat es transforma i aquesta molècula que resulta queda permanentment unida al centre actiu, no hi ha una alliberació del producte i això és conseqüència del mecanisme de catàlisi de l’enzim.
Aquests tipus d’inhibidors en el cas dels fàrmacs són molt bons perquè si no hi ha l’enzim no produeixen cap tipus de reacció i quan actuen el seu producte no és alliberat de manera que, la constat de fixació del inhibidor és molt superior a la de dissociació (que no existeix).
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Exemple 1: Les penicil·lines Els antibiòtics en contra de la penicil·lina es basen en una estructura característica on tenen un anell comú de tiazolina (en groc) i un anell de β-lactam. En funció del tipus de substituent en el carboni 6 d’aquest últim anell trobem diferents tipus de penicil·lines amb aplicacions diferents com per exemple:  Penicil·lina V: és una molècula relativament estable en les condicions de pH de l’estomac (àcid). Aquest és un medicament que es pot administrat via oral.
 Penicil·lina G: és una estructura que no suporta les condicions de l’estomac però és més estable amb les resistències bacterianes (mecanismes per els quals els bacteris és fan resistents a l’efecte d’antibiòtics). És un medicament que s’administra per via intravenosa.
Així doncs acabem d’observar que les propietats a nivell químic estan relacionades amb la forma d’administració.
Les penicil·lines són bons antibiòtics perquè inhibeixen el procés de síntesis de la paret cel·lular bacteriana i per tant, aquesta és una via metabòlica exclusiva dels bacteris de manera que només afecta a la viabilitat d’aquest i no a la del pacient (aquest és un aspecte molt important ja que tenen un efecte molt petit sobre l’hoste). Concretament, aquest tipus d’antibiòtic actuen sobre la última via de la síntesis i la reacció que inhibeixen és una transpeptidasa; en la paret cel·lular hi ha fragments de pèptids que formen entrecreuaments entre ells i el que inhibeixen és precisament aquest nivell, és a dir, tota l’etapa pot funcionar bé però aquesta part s’atura i per tant, tot el bacteri deixa de funcionar.
Així doncs, en absència de transpeptidasa la penicil·lina circula per la sang, amb un temps de vida suficient llarg com per poder fer efecte en les cèl·lules que toca, és a dir, per difondre’s per tot l’organisme. Quan arriba al lloc de la infecció bacteriana interacciona amb el centre actiu amb molta afinitat ja que té una cadena lateral d’una serina que reconeix l’antibiòtic com a substrat i per tant, s’inicia el procés de reacció que genera en el temps un intermediari covalent entre la serina i l’antibiòtic. La reacció queda aturada en aquest punt i per tant, el producte queda unit al centre actiu.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 En aquest esquema veiem en el costat que dins les resistències (per els quals existeixen diferents mecanismes) els bacteris poden desenvolupar una activitat anomenada β-lactamasa, que reconeix l’anell β-lactàmic de l’antibiòtic i per un mecanisme semblant al que segueix la inhibició efectiva de la penicil·lina trena aquest anell, generant una forma de la penicil·lina que si és alliberada però que és inactiva.
La activitat i eficiència ve donada per la relació entre la no resistència i la resistència però generalment l’antibiòtic necessita d’un inhibidor de la β – lactamasa Exemple 2: Infeccions per protozous i la malaltia de la son La malaltia de la son està produïda per un organisme unicel·lular eucariota i s’anomena d’aquesta manera perquè l’organisme en ser infectat produeix una primera resposta immunitària i durant un temps, la persona infectada bloqueja l’efecte de procés infecciós. La part proteica però té una alta tasa de mutació de manera que al cap d’un cert temps, la part que es reconeguda pel sistema immunitari queda modificada, l’organisme reconeix com una segona infecció la infecció primària de manera que desencadena una resposta immunitària massiva. Aquest aspecte sumat a condicions de vida poc favorables produeix que en cada episodi de resposta i l’organisme quedi més debilitat.
Una opció per combatre aquesta malaltia era intentar trobar una via metabòlica específica però no existia cap sobre la qual es pogués incidir. Es va trobar però, que hi havia un enzim (ornitina descarboxilasa) del metabolisme del patogen que es caracteritzava pel temps de vida mitja en quant a proteïna (el temps de vida mitja dels protozous és major al dels humans) i que estava implicat en la biosíntesi de les poliamides per les quals és necessari un aminoàcid no proteic (ornitina). Aquest enzim té en el seu centre actiu un grup proteic no prostètic (pirodoxal fosfat) que durant el procés dona un intermediari transitori entre el substrat i el tirosol fosfat, que és una base de shiff. Aquest producte permet la descarboxilació de la ornitina el que permet regenerar el procés.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Hi ha un fàrmac derivat de l’ornitina (DFMO o difluorometil orinitina) amb una estructura relativament semblant a l’ornitina però amb dos àtoms de ferro. Si administrem aquest a una persona infectada aquesta començarà el procés, formarà la base de Shiff i seguirà el mecanisme fins a la descarboxilació del fàrmac i per efecte de la persona i la reactivitat dels dos àtoms de ferro en aquesta posició hi ha un grup de l’enzim que forma un enllaç covalent amb el producte de la reacció, de manera que l’enzim queda modificat de forma permanent a causa del producte. Com que l’enzim en quant a proteïna del patogen té un temps de vida llarg al patogen no li dona temps a canviar aquest enzim modificar per noves formes de l’enzim mentre que la persona infectada té un intercanvi del derivat de l’ornitina molt ràpid i és substituït ràpidament per noves molècules d’enzim, de manera que els efectes secundaris sobre l’hoste són baixos.
Exemple 3: Síntesi del timidilat i objectius quimioterapeútics Per inhibir el timidilat com agent antitumoral, des del punt de vista estricament del mecanisme s’elabora a partir del cluoroacil. Sabem que per l’obtenció del substrat de dUMP es troba la forma fluorada, produint un producte final covalent en el qual no hi ha dissociació del producte de la reacció de manera que l’enzim queda modificat el que està associat a la necessitat de nucleòtids de timina en les cèl·lules el que provoca la inhibició ràpida del creixement cel·lular i de la formació de tumors.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 Inhibidors de fixació fora o pseudoirreversibles Aquests inhibidors es caracteritzen per ser teòricament reversibles però l’afinitat entre l’inhibidor i l’enzim és molt més elevada i per tant, tenen valors de la constant d’inhibició molt petits (generalment menor a 10-8 M) i per tant, tenen molta afinitat per la formació del complexi per tant es comporten pràcticament com a reversibles el que pot confondre en un estudi cinètic.
Per l’estudi del sistema aquest ha de tenir dues característiques:  L’inhibidor ha de tenir una estructura molt similar a l’estat de transició de la reacció i per tant, parlarem d’anàlegs d’aquest estat. Aquestes són molècules estables en estructura química però que recorden a la distribució anatòmica que té l’estat de transició en un moment determinat. Hem de tenir present que podem trobar tant anàlegs del substrat com de l’estat de transició.
 Quan els inhibidors interaccionen en el centre actiu de l’enzim aquest en el seu mecanisme de catàlisi ha d’implicar un canvi conformacional de l’estructura que afecti al seu centre actiu.
Aquesta característica la podem trobar per exemple en la proteasa del virus del VIH.
Aquesta proteasa té una estructura dimèrica en que el centre actiu es troba en la meitat.
Sabem que el substrat d’aquest centre actiu és una altra proteïna de manera que com a inhibidor el que es fan servir són molècules semblants a l’estructura del substrat (no aminoàcids) en que ja es satisfà la primera condició esmentada anteriorment.
Generalment, si funciona correctament l’enzim, quan es produeix la interacció es genera un canvi en el centre actiu d’aquest; en absència de substrat és una estructura oberta amb dos flaps però durant el procés de catàlisi aquestes dures regions pateixen un canvi conformacional i els dos flaps es sobreposen el que permet que el centre actiu quedi tancat durant la catàlisi i alliberi el producte.
En presència del inhibidor però les interaccions són molt fortes i queda estabilitzat i per tant, la forma tancada de l’enzim no allibera el producte i no canvia de conformació el que provoca la inhibició d’aquest.
El coneixement de l’estructura tridimensional d’aquest enzim ha permès desenvolupar tota una sèrie de fàrmacs que es basen en la mateixa estratègia: molècules que es situen en el centre actiu d’aquest enzim.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi T6.1 MESURES PER L’EFECTE DE FÀRMACS Amb la informació explicada anteriorment podem classificar i analitzar el comportament d’una molècula com a fàrmac en el cas que aquest que estiguem estudiant vagi en contra d’un enzim. Així doncs, aquest estudi ens pot donar una idea de l’eficiència del compost com a fàrmac tot i que això sempre genera ambigüitats.
 KD: és la constant de dissociació de la interacció entre el fàrmac i el receptor, que si estem parlant d’un sistema amb un enzim inhibidor sabem que la identificarem com Ki quan sabem que mesurem la interacció del inhibidor amb l’enzim lliure o Ki’ quan sabem que l’inhibidor està interaccionant amb el complex enzim – substrat.
 IC50: és la concentració d’inhibidor a la qual tenim el 50% de l’activitat màxima  ED50: és la dosi efectiva d’un fàrmac, aquella dosi que es requereix per produir un efecte terapèutic del 50% en una mostra, que pot ser un efecte de supervivència o del que sigui.
 TD50: és aquella dosi que es requereix per produir un efecte tòxic del 50%, com més elevat és aquest valor el sistema és més resistent.
 LD50: en aquest cas ens referim a la dosi necessària per causar un efecte letal del 50%.
 TD50/ED50: el quocient és la relació entre aquella concentració que produeix toxicitat en funció d’aquella que dóna l’efecte necessari. Aquest quocient ha de ser elevat, per produir la toxicitat necessitaríem una elevada concentració de fàrmac mentre que per produir l’efecte necessari necessitaríem una baixa concentració.
Quan es comença a identificar algun compost com a possible fàrmac, si estem parlant d’un compost basat en la inhibició enzimàtica el primer valor que s’ha de conèixer és KD, que ha de ser menor a 1µM.
20 ...