Bloc IV (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2017
Páginas 9
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 18. MORFOLOGIA I ESTRUCTURA DELS VIRUS Virus: són microorganismes acel·lulars, sense orgànuls i molt petits. Els poxvirus són els que tenen el límit de resolució del microscopi òptic. Els picornavirus són els més petits.
Podem diferenciar dues etapes: - Cel·lular: etapa replicativa, virus constituït per l’àcid nucleic Extracel·lular: tenim la partícula de virus completa i diem que està en forma de virió, constituït per àcid nucleic, proteïnes replicatives incloses a una càpsida proteica, podem trobar un embolcall en alguns i una matriu proteica entre aquestes dues capes.
 Àcid nucleic: Tenen DNA o RNA, mai tots dos tipus. Constitueix el genoma del virus i només hi ha una còpia d’aquests excepte en els retrovirus que són diploides.
- - - DS DNA: pot ser lineal (fag λ) o circular com a la majoria, la circularització és necessària perquè es pugui replicar el material genètic. Si és DNA circular pot ser supercargolat (papovavirus) o parcialment de cadena doble (hepadnavirus), són els que tenen una de les cadenes completa i a la complementària li falta un tros.
SS DNA: parvovirus SS RNA: la majoria o SS (+) o polaritat positiva: la orientació de la cadena del virus és idèntica a la del missatger, no hi ha transcripció sinó que es tradueix directament pels ribosomes.
o SSn(-) o polaritat negativa: orientació de la cadena oposada a la del missatger:  Genoma constituït per una sola molècula: virus mononegavirals  Genoma constituït per diferents trossos: virus segmentats, poden ser lineals (orthomyxovirus o virus de la grip) o circulars (arenavirus).
DS RNA: tots són segmentats i lineals (reovirus).
La mida del genoma varia molt, els pox-virus que tenen el DNA més gran presenten característiques semblants al de les cèl·lules eucariotes (introns, regions repetides...) i els missatgers que elaboren són sempre monosistrònics (cada missatger una proteïna). Als que tenen RNA de cadena senzilla la longitud també varia bastant però en els de cadena doble és més constant.
 Càpsida proteica: Protegeix el genoma viral davant de qualsevol tipus de lesió a la fase extracel·lular. Constituïda per diferents subunitats proteiques anomenades capsòmers, s’uneixen entre sí per un procés d’autoensamblatge sense formació d’enllaços covalents adoptant dos tipus de simetria: helicoïdal o icosaèdrica, també pot ser complexa.
La helicoïdal està constituïda per un únic tipus de proteïna i es forma condensant els diferents capsòmers al voltant de l’àcid nucleic mitjançant unes unitats pre-formades. Aquests virus s’observen al microscopi com partícules allargades.
La icosaèdrica es forma adoptant la forma d’un icosaedre amb la part central buida on s’incorporarà més tard l’àcid nucleic. Pot incloure més quantitat d’àcid nucleic que l’helicoïdal. Les proteïnes que la formen són diferents, i els icosaedres poden presentar diferents plans de simetria.
Microbiologia I Silvia Expósito Quan és la capa més externa, presenta unes estructures d’unió als receptors cel·lulars i es troben situades al vèrtex de l’icosaedre amb diferents formes.
Si tenim simetria complexa és una barreja de les dues, són els bacteriòfags T parells. Tenen una estructura superior icosaèdrica i una inferior helicoïdal més algunes estructures d’unió. Cal que tinguin alguna estructura que li permeti introduir el genoma a la cèl·lula a l’interior de la membrana cel·lular, normalment seran proteïnes contràctils. Els pox-virus, que són virus animals també tenen aquesta simetria complexa.
 Embolcall: No tots el tenen, és una estructura que deriva de la membrana citoplasmàtica, AG o del RER. La seva adquisició és conseqüència del procés de replicació del virus i d’on es doni. A l’embolcall s’inclouen proteïnes modificades pel virus que poden sobresortir formant els peptòmers. Dos tipus de proteïnes virals a l’embolcall: -  D’unió: sobresurten de l’embolcall i actuen com a unió a receptors cel·lulars, són de tipus glicoproteic.
De fusió: actuen com a fusió facilitant la unió entre embolcall i la membrana cel·lular, fent que la cèl·lula presenti una sèrie de característiques. En general són no glicosilades.
Classificació i taxonomia dels virus: Les primeres classificacions es van fer segons el tipus d’hoste que infectaven. Actualment es classifiquen segons la morfologia (tipus d’àcid nucleic, proteïnes, presència d’embolcall), característiques físiques i químiques (resistències, temperatura, pH...), tipus de replicació i les relacions genètiques amb altres virus.
La morfologia és una de les característiques més importants per classificar-los, aporta molta informació de molts grups de virus. Segons el tipus d’àcid nucleic es van crear els grups de Baltimore que dividia els virus en 7 grups diferents: 1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
DNA DS DNA SS RNA DS RNA SS+ RNA SSRNA que utilitzen transcriptasa inversa en la replicació (retrovirus) DNA que utilitzen transcriptasa inversa en la replicació (hepatitis B) Segons el tipus de proteïnes de la càpsida, de l’embolcall... si presenten alguna activitat enzimàtica, etc.. La última classificació feta els distribueix en 7 ordres diferents, respecte els 2 que hi havia prèviament. Inclouen unes 100 famílies, diferents subfamílies i gèneres. També s’adopta el nivell d’espècie per parlar de virus. Una espècie viral són un conjunt de soques de virus que mantenen alguna relació en l’habitat. Nomenclatura: - Ordre: -VIRALS Família: -VIRIDAE Subfamília: -VIRINAE Gènere: -VIRUS Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 19. REPLICACIÓ DELS VIRUS Cal diferenciar els virus segons les cèl·lules que infecten. Etapes: - Adsorció o unió a la cèl·lula: Procés específic, hi intervenen estructures d’unió del virus i receptors cel·lulars. Entren en contacte mitjançant un procés a l’atzar, els virus no tenen òrgans per dirigir-se a una cèl·lula o altra, i depèn de la proporció relativa que tinguem entre un i altre, com més quantitat de virus respecte el nombre de cèl·lules el procés tindrà més èxit.
Aquesta relació s’anomena multiplicitat d’infecció (%), segons aquest valor l’adsorció està més afavorida o no. En bacteriòfags, amb un valor entre 1 i 5 és suficient perquè es doni. En virus animals cal una multiplicitat major perquè molts dels processos després no funcionaran.
La unió pot ser molt específica de manera que un tipus de virus pot infectar només a una cèl·lula o tipus cel·lular concret, però hi ha altres que són poc específics i poden infectar a molts tipus cel·lulars diferents. El tipus de cèl·lules que infecten determina l’escala d’hostes d’un virus.
Els receptors de les cèl·lules hostes pels fags són proteïnes de membrana externa als gramnegatius i en grampositius en troben per sobre la capa de mureïna. En cèl·lules animals les proteïnes d’unió poden tenir també altres funcions i en cèl·lules vegetals no hi ha receptors sinó que els virus són introduïts per insectes o per alguna lesió que tingui el vegetal.
Les proteïnes del virus que reconeixen aquests receptors es troben als vèrtex de les càpsides o inserides si tenen un embolcall extern.
- Entrada a la cèl·lula: En el cas dels bacteriòfags, la càpsida queda fora de la cèl·lula i només s’introdueix l’àcid nucleic.
En virus animals en general les càpsides sí que entren a la cèl·lula, però hi ha una excepció (Picornavirus) on la càpsida queda fora.
Hi pot entrar mitjançant dos mecanismes diferents: - - Si no presenten embolcall extern, l’entrada es dóna per endocitosi on el virus es fixa a la superfície de la cèl·lula i entra a l’interior per una vesícula endosomal. Es produeix una disminució del pH intracel·lular, causant que s’alliberi l’àcid nucleic i que es doni la lisi de la vesícula; la càpsida pot patir alteracions o una lisi també, depèn del virus.
Si tenen embolcall extern: o Per endocitosi, amb el mateix mecanisme que abans. Es produeix una fusió entre l’embolcall i la membrana de la vesícula alliberant així la càpsida al citoplasma.
o Per fusió, aquest virus presenten les proteïnes típiques d’unió al receptor i també proteïnes de fusió. Quan s’uneixen als receptors cel·lulars promouen directament la fusió entre l’embolcall del virus i la membrana cel·lular, no es forma cap vesícula, i la càpsida s’introdueix a l’interior.
Per tant, la cèl·lula presenta a la membrana un tros que correspon a l’embolcall del virus, quan la cèl·lula estigui a prop d’una altra que tingui els receptors adequats per aquestes proteïnes, es donarà la unió d’aquestes dues cèl·lules. Com a resultat tindrem la formació d’una cèl·lula que tindrà dos nuclis i a més continuarà tenint a la superfície el tros d’embolcall del virus, la fusió es pot tornar a donar.
Microbiologia I Silvia Expósito Acabem tenint uns macro-agregats cel·lulars anomenats sincitis que no són funcionals i contenen diversos nuclis. El virus es segueix replicant tot i que no siguin funcionals.
El mecanisme d’entrada del material genètic al nucli cel·lular pot ser de diferents maneres, si es repliquen al nucli primer hi entren i després perden la càpsida, els que es repliquen al citoplasma perden allà la càpsida.
- Replicació del virus: es fa en tres etapes: 1. Transcripció: L’àcid nucleic es transcriu a diversos RNAm que portaran la informació per la síntesi de proteïnes estructurals i proteïnes replicatives perquè el virus les necessita. En els virus més senzills només hi ha una tanda de transcripció, en els més complexes es dóna dues o tres vegades. En aquest cas, a la primera es sintetitzen RNAm que codifiquen per proteïnes replicatives i a la segona les estructurals i també les replicatives associades al virió.
- DS DNA: es dóna al nucli (excepte als pox-virus) es necessita la RNA-pol DNA dependent de la cèl·lula hoste. Els pox-virus ja codifiquen les seves pròpies DNA-pol.
SS DNA: han de fer un pas previ, porten associat sempre al virió enzims capaços de copiar una cadena complementària per transformar el DNA a DS, necessari perquè es doni la transcripció.
Si tenen RNA el procés es realitza al citoplasma excepte en retrovirus i orthomyxovirus.
- SS RNA (+): no hi ha transcripció, es dóna directament la traducció als ribosomes cel·lulars, excepte en retrovirus que es repliquen per un sistema totalment diferent a la resta.
Replicació dels retrovirus: el genoma del virus es copia per un enzim que el virió porta associat, la transcriptasa inversa que actua com a polimerasa i fa la cadena complementària però en forma de DNA, aquest mateix enzim (actuant com a endonucleasa) elimina la cadena de RNA i ara tindrem un genoma SS DNA (-), amb el mateix enzim (actuant com a polimerasa) es sintetitza la cadena complementària obtenint la SS DNA (+), com a resultat tenim DS DNA. Ara aquest genoma víric s’integra a un dels cromosomes cel·lulars, a partir d’aquí és tractat com un tros més de DNA cel·lular.
- SS RNA (-): tots porten sempre associat al virió un enzim, la RNA-pol RNA dependent.
DS RNA: també necessiten aquest mateix enzim per poden sintetitzar els RNAm a partir de la cadena amb polaritat (-), ja que el RNAm sempre és (+).
Els RNAm vírics han de tenir les mateixes característiques que els RNAm de la cèl·lula hoste perquè es puguin traduir: a l’extrem 5’ han de tenir una proteïna K que interacciona i fixa el RNAm al ribosoma i al 3’ ha d’haver-hi una regió de poli-A.
2. Replicació del genoma: En els virus DNA es repliquen a través de diferents tipus d’enzims, els més senzills depenen només dels enzims cel·lulars, és el que passa als parvovirus. Els enzims que repliquen DNA sempre estan sintetitzats i actius en procariotes (no hi ha problema per bacteriòfags), però en eucariotes només es sintetitzen en la fase S replicativa. És per això que els virus més complexes són capaços de sintetitzar els seus propis enzims de replicació, així poden infectar cèl·lules que es trobin en qualsevol fase del cicle cel·lular.
Microbiologia I Silvia Expósito En els RNA que es repliquen al citoplasma no hi ha problemes, les cèl·lules sempre tenen enzims replicatius al citoplasma; ho fan a través d’intermediaris replicatius.
- SS RNA (+): sintetitzen la cadena complementària (-) que serà l’intermediari i a partir d’aquesta s’aniran copiant nous genomes virals (+).
SS RNA (-): tindran un intermediari de cadena (+) i a partir d’aquí es sintetitzen les còpies de genoma (-).
Els RNA que es repliquen al nucli (orthomyxovirus), han de ser capaços de sintetitzar enzims per poder replicar el seu genoma.
3. Síntesi de les càpsides proteiques: Es dóna al mateix temps que la replicació del genoma, les proteïnes sintetitzades al citoplasma s’aniran unint per un procés d’autoensamblatge (no enllaços covalents) per formar les càpsides.
- Ensamblatge: Es produeix un cop estan sintetitzats el genoma i la càpsida. L’àcid nucleic entra a l’interior de les càpsides formades. Normalment no es dóna a l’atzar, és una inserció específica, ja que sempre hi ha una quantitat fixa de DNA. En virus amb genomes segmentats, cada segment és inserit a una càpsida independent.
Una vegada formades les càpsides es dóna la maduració on l’àcid nucleic adopta l’estructura necessària i els plegaments per ser funcional, si els virus porten proteïnes associades al virió també s’introdueixen. Quan tenim les partícules virals completes, els nous virus surten de la cèl·lula.
- Alliberació del virus: Varia segons el tipus de virus. En bacteriòfags (excepte els filamentosos) es produeix per lisi cel·lular; en virus animals sense embolcall extern no hi ha cap mecanisme específic per sortir de la cèl·lula, han d’esperar a que es mori; i els que presenten embolcall extern la sortida es dóna per exocitosi on obtenen aquest embolcall de la membrana citoplasmàtica, del RE o de l’AG de la cèl·lula hoste.
En tots els virus que adquireixen l’embolcall de les estructures membranoses, prèviament s’hauran adquirit les glicoproteïnes que es trobaran a una regió determinada de la cèl·lula hoste on anirà el virus, finalment es formarà una vesícula d’aquesta regió i donarà lloc al nou virus.
El procés de replicació es pot evidenciar mitjançant un cultiu de cèl·lules i virus, també es poden representar en forma gràfica les diferents etapes de la replicació: nº de cèl·lules/temps, s’observa un perfil semblant al creixement cel·lular dels bacteris. A la gràfica es diferencien diverses regions: - Etapa inicial: període de cripsi, durant aquest període no es detecten virus lliures al medi de cultiu. Els virus estan en etapa replicativa dins de les cèl·lules.
Etapa exponencial: la replicació ha acabat i comencen a alliberar-se de les cèl·lules les noves partícules virals fins a arribar a un màxim on no hi ha més creixement. La diferència de temps a la fase exponencial és deguda a que la infecció es dóna de manera gradual, no totes les cèl·lules es posen en contacte amb el virus al mateix temps.
Microbiologia I Silvia Expósito El temps que triga des de que es posen en contacte virus i cèl·lules i es comencen a produir els primers virus ja replicats, just quan acaba el període de cripsi, és el temps d’explosió. Per un virus i sistema cel·lular determinats el temps sempre serà el mateix.
La mida d’explosió és la divisió del nº de virus alliberats/nº de cèl·lules infectades. Així obtenim el nº de virus que s’han alliberat en una única cèl·lula.
Experiment one-step growth: es barreja un cultiu de cèl·lules i virus, es deixen perquè els virus puguin adsorbir-se a les cèl·lules, després es neutralitzen amb Ab específics els virus no adsorbits per evitar infeccions secundàries. Per evitar tenir molt virus lliures o moltes cèl·lules no infectades, s’ajusta la multiplicitat d’infecció (nº virus/nº cèl·lules) entre 1-5, si són virus animals s’augmenta perquè no sempre que s’infecta un animal s’acaba completant la replicació.
Es prenen mostres i mesurem al llarg del temps el nº de virions que es produeixen. Per determinar els dos paràmetres anteriors (temps i mida d’explosió) també cal determinar el nº de cèl·lules infectades i no infectades.
Per realitzar l’experiment, s’agafen 2ml de la mostra que conté els bacteriòfags i s’afegeixen a un tub que conté un medi de cultiu d’agar tou i també 2ml d’una concentració coneguda de suspensió bacteriana. Es sembra per superfície a una placa i es formarà una petita placa a la part superior que contindrà la barreja de bacteris i fags.
Hauríem de tenir un creixement confluent de cèl·lules bacterianes i entre mig tindrem els bacteriòfags que cadascun d’ells infectarà les cèl·lules del seu voltant, es donarà la replicació i la lisi de les cèl·lules. El resultat de tot això després d’incubar la placa serà que allà on es trobin els fags tindrem unes zones de lisi anomenades calbes que equivalen a les colònies bacterianes. Si les comptem podem saber quants bacteriòfags teníem als 0,2ml que hem afegit al tub.
Amb els virus animals cal utilitzar un suport cel·lular com animals d’experimentació o els seus embrions només per obtenir creixement dels virus, per comptar-los cal utilitzar un cultiu obtingut a partir de cèl·lules de teixits. L’inconvenient és que les cèl·lules animals són molt més inestables que les bacterianes.
Agafem una mostra de teixit i la tractem amb tripsina que trenca l’exosquelet cel·lular i disgrega les cèl·lules. La sembrem a plaques de Petri o a flascons de Roux i afegim una barreja de diferents ions a concentracions isotòniques, aminoàcids, vitamines, sèrum i bicarbonat per tamponar el sistema; les cèl·lules comencen a créixer i es divideixen per generar noves cèl·lules ocupant tota la superfície del flascó o placa, s’anomena cultiu monocapa perquè el gruix és d’una única cèl·lula.
Aquest és un cultiu primari que s’utilitza per fer diferents tipus d’experiments, després d’un cert temps degeneren i les cèl·lules acaben morint, per evitar-ho haurem de fer subcultius: agafem el cultiu primari, li afegim tripsina per disgregar les cèl·lules, les sembrem i afegim un medi de cultiu nou per iniciar un cultiu secundari. Les cèl·lules animals no permeten massa subcultius.
Normalment es seleccionen algunes cèl·lules dels subcultius que presenten una resistència major i constitueixen les soques cel·lulars. Dins d’aquestes soques poden aparèixer cèl·lules amb una morfologia diferent, que creixen més de pressa que la resta i necessiten menys cèl·lules per iniciar el subcultiu, constitueixen les línies cel·lulars i perduren al llarg del temps sense degenerar-se, s’han obtingut sobretot a partir de cèl·lules canceroses.
Microbiologia I Silvia Expósito A partir d’aquí per fer el recompte de virus s’utilitzen les línies cel·lulars i es compten les calbes si el virus produeix la lisi cel·lular o es tenyeixen les cèl·lules d’una manera determinada per identificar-los.
 Factors que afecten al creixement dels virus: - Temperatura: en general els virus són força sensibles a temperatures altes (40-50ºC).
Les baixes, en canvi, permeten una bona conservació; es poden mantenir a temperatures de refrigeració i congelació i es manté la seva viabilitat.
[Sals]: els virus augmenten la seva estabilitat en presència de determinades sals, magnesi sobretot.
pH: la majoria es mantenen estables a pH neutres, hi ha alguns que també es mantenen a pH àcids (els que infecten el tracte intestinal); pH superiors a 8 els destrueixen.
Radiacions: tots són sensibles a les radiacions ionitzants, no ho són a les de l’espectre del visible excepte quan estan en presència de determinats colorants. Es produeix la inactivació fotodinàmica quan es tenyeixen les cèl·lules amb alguns colorants.
Dissolvents: els orgànics inactiven els virus que tenen embolcall extern, els que només tenen la càpsida proteica no són sensibles.
Detergents: depèn de si són iònics o no, en general tenen un cert efecte sobre els embolcalls del virus (components lipídics sobretot i càpsides proteiques també).
Formaldehid: reacciona amb l’àcid nucleic del virus, especialment amb els que tenen SS RNA. S’utilitza per obtenir soques vacunals perquè inactiva el virus i evita que es repliqui però no afecta als components proteics mantenint així l’antigenicitat.
- - Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 20. GENÈTICA VÍRICA Els canvis genètics o errors als virus es poden donar a nivell de: - Replicació de l’àcid nucleic: Com a conseqüència de mutacions o per recombinació. Alguns dels canvis induïts per mutació originen genomes no funcionals, per tant, són mutacions letals. Quan no són letals es poden detectar i poden produir canvis en la població dels virus que poden ser perjudicials, neutres o beneficiosos, la mutació causarà l’aparició d’una nova soca viral.
Els virus DNA que es repliquen a partir d’enzims cel·lulars tenen una freqüència de canvis semblant a la de les cèl·lules hoste degut a que les DNA-pol tenen efecte reparador, per això la freqüència mutagènica és tan baixa. Els DNA que es repliquen a partir de DNA-pol virals, com els poxvirus, també tenen una freqüència similar a la de les cèl·lules hoste perquè també tenen efecte reparador.
En virus RNA hi ha una freqüència molt més elevada perquè no hi ha aquest efecte corrector, les mutacions són molt important en els virus que causen infeccions persistents a l’hoste com el VIH, cal tenir-ho en compte per l’aplicació del tractament, elaborar vacunes...
Mutacions: segons el canvi a l’àcid nucleic (substitucions, delecions, ... igual que en bacteris); segons l’expressió fenotípica si no són letals: mutants de calba o virus que pateixen mutacions que fan que es modifiqui la forma de la calba en un cultiu; segons la resistència a la neutralització amb Ab: quan afecten als determinants antigènics del virus de l’embolcall o càpsida i els Ab formats a l’organisme ja no els reconeixen.
Es poden produir de manera espontània o afavorir-se amb agents mutàgens, a vegades es manipulen els virus amb agents mutàgens per obtenir soques i utilitzar-les per fer vacunes anul·lant la virulència i mantenint els Ag.
Recombinació: es dóna quan dos virus més o menys relacionats infecten alhora una mateixa cèl·lula i es pot ser: - Recombinació molecular: es dóna entre tots els virus que tenen DNA com a genoma i entre alguns amb RNA (picornavirus, coronavirus). Com es dóna en tots els virus DNA i en molts RNA, això suposa l'aparició d'un nou tipus de virus com en el cas d'un virus RNA, el de l'encefalitis equina de l'oest, es va originar per recombinació del virus de l'encefalitis equina de l'est amb el sindbis.
Es pot donar entre diferents famílies de virus, entre DNA viral i cel·lular i s’obtenen cèl·lules transformants (en adenovirus, herpes virus, altres).
- Reordeonament genòmic: es dóna en virus que tenen un genoma segmentat, pot ser que quan dos virus que infectin la mateixa cèl·lula i es repliquin acoblin un segment que sigui de l’altre virus (virus de la grip o orthomyxovirus), es pot donar en tots els virus amb RNA segmentat.
Microbiologia I - Silvia Expósito Formació de la càpsida Si una cèl·lula està infectada per dos virus alhora i es formen les càpsides hi pot haver un intercanvi de glicoproteïnes entre els virus, la conseqüència és que les glicoproteïnes són les que determinen a quin tipus de cèl·lula es podrà unir i replicar el seu genoma llavors ara podrà introduir el seu genoma a una cèl·lula que abans no podia infectar.
- Adquisició de la càpsida i embolcall: La transcapsidació consisteix en que quan dos virus infecten la mateixa cèl·lula, pot ser que el genoma d’un virus s’introdueixi a la càpsida de l’altre i tindrà les mateixes conseqüències que abans.
Poliploïdia o heteroploïdia: es dóna només en els virus amb embolcall extern. Normalment els virus són haploides però en alguns casos quan es forma l’embolcall poden adquirir més còpies de material genètic. Es produeixen errors en el procés de formació de l’embolcall i s’inclouen més càpsides proteiques tenint així moltes còpies del genoma viral. Si en la formació de partícules els virus són iguals = poliploïdia; si a les càpsides hi ha material genòmic de dos virus diferents = heteroploïdia.
...

Comprar Previsualizar