Inmunohistoquímica en cáncer (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 7
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER Inmunohistoquímica en cáncer Bases de la inmunohistoquímica Se trata de un método para la detección de antígenos tisulares o celulares, normalmente proteínas, basado en el reconocimiento Antígeno-Anticuerpo, que es muy específico. Por tanto el uso de inmunoglobulinas hace que sea una reacción muy dirigida. El anticuerpo es una proteína de la que podemos encontrar diferentes subtipos que reaccionarán de manera específica con una parte concreta de la proteína, el epítopo.
La técnica se utiliza mucho como ayuda diagnóstica y resulta muy importante a la hora de escoger un tratamiento adecuado. Se usa con frecuencia ya que la observación del tejido no es suficiente si la morfología tumoral no permite determinar el tipo tumoral (lo que ocurre a menudo). Por tanto, la técnica facilita el reconocimiento del tipo celular y el diagnóstico. También se usa en investigación.
La inmunohistoquímica comenzó a desarrollarse como una técnica de inmunofluorescencia para la detección de antígenos tisulares en congelación (1940, Coons), ya que los tejidos congelados se conservaban mejor. El objetivo era desarrollar una técnica dirigida sobre todo a la investigación.
A partir de 1990 comenzó a aplicarse como ayuda en el diagnóstico anatomopatológico en tejidos fijados en formol (formaldehído) y parafina, para lo que se desarrollaron nuevos anticuerpos que pudieran utilizarse en parafina.
Tipos de anticuerpos Se utilizan inmunoglobulinas de tipo IgG e IgM obtenidas normalmente a partir de sérum de ratón, o también de conejo, cabra, … inoculado con el antígeno. A la hora de comprarlos se indica qué tipo de anticuerpo tienen y para qué tejidos se pueden utilizar.
Los anticuerpos obtenidos pueden ser monoclonales o policlonales, siendo los primeros más específicos ya que actúan contra un solo epítopo del antígeno.
Las empresas suelen sacar al mercado el anticuerpo policlonal (más fácil de obtener) y, si tiene mucha demanda, desarrollan el monoclonal.
Se han desarrollado tantos anticuerpos que para cada proteína (de las que se usan normalmente en diagnóstico) tenemos varios que reconocerán diferentes epítopos.
Procedimiento 1. Obtención de la muestra: Normalmente se utiliza muestra procedente de una biopsia pero también se hace a partir de citologías o autopsias. Cuando se hace a partir de una citología se aplican los anticuerpos a una extensión sin teñir. La utilidad de aplicar la inmunohistoquímica en autopsias es para determinar el tipo tumoral de un paciente que ha muerto a causa de un tumor muy diseminado del cual no conocemos el origen.
2. Procesamiento El procesamiento de las muestras es normal, es decir, se fijan en formol, se incluyen en parafina y se cortan en el microtomo.
3. Tinción En este caso la tinción no es por hematoxilina-eosina como en una histología normal. La tinción se hace de forma automatizada (antes se hacían de manera manual).
1 CÁNCER Curso 2015/2016 4. Valoración – control de calidad Como se trata de tinciones necesarias para el diagnóstico y para la selección del tratamiento de los pacientes, los laboratorios se someten a un control de calidad interno y otro externo por parte de la SEAP (Sociedad Española de Anatomía Patológica).
Sistemas de detección Son los sistemas que pondrán de manifiesto si se ha producido la reacción antígeno-anticuerpo.
Para la detección se emplean mayoritariamente reacciones enzimáticas aunque, sobre todo en investigación, se detecta con inmunofluorescencia. El sistema de detección más novedoso es mediante el uso de polímeros.
Es necesario un sistema que permita amplificar la señal que permite la detección con una dilución mayor del anticuerpo, que es el producto más caro. Mediante la amplificación de la señal mejora mucho la sensibilidad y nos permite asegurarnos que podremos determinar en qué zonas de la muestra se produce la reacción Ag-Ac.
Podemos encontrar dos tipos de sistemas de detección: los directos, que son los que se utilizaban primero, y los indirectos. Hoy en día, a no ser que sea para una inmunofluorescencia no se utilizan los de tipo directo.
- Detección directa: se aplica el anticuerpo marcado directamente a la muestra.
- Detección indirecta: se pueden utilizar los siguientes sistemas (que van ordenados cronológicamente y también por la potencia del método): Peroxidasa – antiperoxidasa (PAP) Avidina – biotina (ABC) Biotina – streptavidina (B-SA) Como métodos de amplificación de la señal encontramos la tiramida y los sistemas con polímeros (en visión, FLEX, …) A continuación vamos a ver más en profundidad los dos tipos de detección: Conjugación directa Tenemos una muestra de tejido sobre la cual queremos detectar un epítopo. Sobre esta muestra añadimos directamente el anticuerpo marcado con algo que nos permita poder verlo. Esta reacción está muy poco amplificada (la relación antígenoanticuerpo-señal es 1:1:1).
Conjugación indirecta o en sándwich Evolucionó a partir de la directa. En este caso tenemos un anticuerpo secundario entre el anticuerpo primario (unido al antígeno) y la señal. La conjugación química o enzimática que permite visualizar la reacción se aplica al anticuerpo secundario, lo que aumenta la versatilidad y sensibilidad de la técnica). El anticuerpo secundario es general (no es específico para una proteína concreta) ya que debe unirse a los anticuerpos primarios.
2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Sistema avidina – biotina El anticuerpo primario se marca con biotina a la que se une la avidina conjugada con la enzima peroxidasa (que permite visualizar la reacción). El problema de este método es que hay tejidos con capacidad de producir biotina de forma endógena, como el hígado, por lo que se pueden generar falsos positivos o ruido de fondo.
Sistema streptavidina - biotina En este caso se utiliza la streptavidina, producida por una bacteria. Se marca con biotina un anticuerpo que se une a la streptavidina conjugada a la peroxidasa.
La ventaja respecto al sistema avidina – biotina es que la streptavidina no contiene oligosacáridos, por lo que no se producen reacciones inespecíficas. Además, al contrario que la avidina, su punto isoeléctrico es neutro (el de la avidina es básico).
Sistemas de amplificación de la señal mediante polímeros El anticuerpo secundario lleva conjugados polímeros que permiten amplificar mucho la señal, por lo que dan una gran sensibilidad a la técnica.
Inmunohistoquímica en cáncer Aplicaciones 1. Diagnóstico En muchas ocasiones, la observación de la histología del tumor al microscopio no permite determinar de qué tipo de tumor (carcinoma, sarcoma, linfoma) se trata, sobre todo si estamos ante un tumor pobremente diferenciado. Conocer el tipo tumoral es muy importante desde el punto de vista de la asignación del tratamiento, ya que cada tipo tumoral requiere uno diferente. Por ejemplo, los carcinomas se operan mientras que los linfomas son derivados a hematología, donde se lleva a cabo un tratamiento específico.
Antes de la llegada de la inmunohistoquímica los tumores poco diferenciados solo podían diagnosticarse como tumores malignos poco diferenciados, por lo que no era posible administrar un tratamiento específico.
Cada tipo tumoral tiene unos marcadores concretos (antígenos).
Lo primero que se debe evaluar es la expresión de filamentos intermedios específicos, que se encuentran asociados a los microtúbulos formando parte del citoesqueleto. Los filamentos intermedios de tipos I y II se encuentran sobre todo en carcinomas, mientras que los de tipo III suelen encontrarse en sarcomas. Es decir, en función del tipo de filamento que exprese la célula podemos saber cuál es su origen.
3 CÁNCER Curso 2015/2016 Citoqueratinas Son proteínas muy complejas de las cuales podemos encontrar hasta 20 tipos diferentes numerados en el catálogo de Moll et al. – CK1-CK20. Se encuentran formando polipéptidos (40-68kDa).
Se clasifican en dos tipos: - Tipo A o clase I, que son las ácidas. CDK9-CD20.
- Tipo B o clase II, que son las básicas. CDK1-CD8.
A menudos se combinan entre ellas formando heterodímeros (tipoA + tipoB) que tendrán un punto isoeléctrico neutro.
Una célula puede tener entre 2 y 10 tipos de citoqueratinas diferentes. De la mezcla de citoqueratinas que pueden presentar, se podrá detectar mediante inmunohistoquímica aquella citoqueratina mayoritaria. También hay anticuerpos con capacidad de detectar un pool de varias citoqueratinas.
La expresión diferencial de citoqueratinas de los tejidos nos permite determinar el tipo tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo pan-citoqueratina (AE1/AE3) nos permite detectar cualquier tejido de origen epitelial, por lo que obtendremos una inmunohistoquímica positiva en caso de hallarnos ante un carcinoma. Para conocer el subtipo habrá que seleccionar un anticuerpo más específico pero el conocer el tipo nos permite trabajar de forma más dirigida.
En la imagen vemos una tinción con el anticuerpo pan-citoqueratina que además está teñido con hematoxilina de Harris (que tiñe los núcleos de azul).
La reacción Ag-Ac se ha puesto de manifiesto mediante un cromógeno de color marrón. Se trata de la mucosa del colon.
La inmunohistoquímica resulta muy útil para el diagnóstico de neoplasias con poca diferenciación celular y con patrones histológicos engañosos. La mayor parte de carcinomas se presentan ya como una metástasis, es decir, fuera del tejido que les corresponde, lo que dificulta la asignación del origen. Por ejemplo, el ganglio de la axila es el drenaje linfático de muchas regiones por lo que será más difícil determinar el tejido del que procede. En función de la línea de diferenciación celular, las células tumorales presentarán diferentes anticuerpos.
Caso: metástasis de tumor de origen desconocido. Se ha pedido una inmunohistoquímica para la queratina AE1-AE3 (pan-citoqueratina) que ha salido positiva. Esto nos permite determinar que se trata de un carcinoma (origen epitelial) pero para poder elegir un tratamiento más específico necesitamos conocer la localización anatómica del tumor primario y el tipo celular a partir del cual se ha originado.
Se hace primero una inmunohistoquímica más general para determinar el tipo celular (carcinoma, sarcoma o linfoma) ya que hacerlo por pasos permite, a la larga, gastar menos dinero (al ir más focalizado a unos tipos concretos de tumor nos ahorramos muchas inmunos que saldrán negativas) e identificar mejor aquello que se encuentra.
Neoplasias mesenquimales: sarcomas En los sarcomas es característica la expresión de vimentina. Se trata de tumores del tejido adiposo, de tipo fibroso, del músculo, … El leiomioma es tumor benigno del músculo que puede identificarse por la expresión de actina del músculo liso. La identificación mediante inmunohistoquímica es necesaria cuando el leiomioma se presenta de forma rara, diferente a la habitual.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Vimentina Es un filamento intermedio que aparece precozmente durante el desarrollo embrionario.
En la imagen vemos un tumor del útero de gran tamaño, un mioma uterino. Al observar con el microscopio vemos que las células hacen remolinos o haces que recuerdan a tumores derivados del músculo.
Si no está claro que nos encontramos ante un tumor muscular podemos hacer una inmunohistoquímica con un anticuerpo antivimentina. Para determinar que nos encontramos ante una neoplasia origina en el músculo del útero se pueden utilizar anticuerpos más específicos.
En este caso la reacción para la vimentina ha salido positiva lo que se pone de manifiesto con un cromógeno marrón. En caso de que nos encontráramos ante un carcinoma escamoso no se teñiría (ya que no expresa vimentina). En el caso de un carcinoma escamoso, el propio tejido presenta un control interno positivo, ya que las células musculares no tumorales expresan vimetina (en este caso las células tumorales son de origen epitelial).
Antígeno leucocitario común Se utiliza para la detección de linfomas ya que se trata de una proteína expresada en la membrana de todas las células de la serie blanca de la sangre. Mediante el anticuerpo CD45 se detecta esta glicoproteína común a todas las neoplasias hematológicas y linfomas.
En el ejemplo de la imagen vemos células de la amígdala marcadas con este antígeno. Es frecuente utilizar como control externo un tejido que reaccione con el anticuerpo, como la amígdala.
A continuación vemos imágenes de un linfoma B difuso de célula grande. Cuando se corta un nódulo y el tejido extraído es gelatinoso y blando nos encontramos ante un linfoma. Por tanto, viendo cómo es el tumor al corte el patólogo ya tiene una idea de qué puede ser el tejido. Al observar con el microscopio se ven unas células muy indiferenciadas que no permiten asegurar un diagnóstico. Por tanto, es necesario hacer una inmunohistoquímica y, como ya se tiene la sospecha de que es un linfoma, se utiliza el antígeno leucocitario común. Una vez se sabe que es un linfoma, hay que determinar el subtipo.
5 CÁNCER Curso 2015/2016 2. Tratamiento Como ya se ha dicho, además de poder aplicarse para determinar un diagnóstico, la inmunohistoquímica también se utiliza para seleccionar un tratamiento concreto.
Por ejemplo es útil en el caso del cáncer de mama. Ya se sabe que el maligno pero, para elegir un tratamiento, el oncólogo debe saber si las células expresan receptores hormonales ya que, en caso de que los expresen, se puede administrar un tratamiento con tamoxifeno (anti-estrógenos). Como tiene tratamiento, la expresión de receptores hormonales se asocia a un mejor pronóstico, Por tanto, siempre se hace una inmunohistoquímica contra el receptor de estrógenos. EN la siguiente imagen vemos una tinción de núcleos. La inmunohistoquímica salió positiva para el receptor de estrógenos, lo que implica la posibilidad de administrar un tratamiento antiestrogénico.
En el caso de que el tumo sobre-exprese el receptor HER-2 (factor pronóstico independiente) podemos administrar un tratamiento con el bloqueador Herceptina (Trastuzumab) que aumenta la supervivencia.
Estas tinciones para la selección de un tratamiento se llevan a cabo después de tener el diagnóstico.
3. Pronóstico Se puede utilizar la inmunohistoquímica para determinar si un tumor es muy agresivo y predecir si tendrá un buen pronóstico. Por ejemplo, en el caso del cáncer de mama, la presencia de receptores es un valor pronóstico: la sobreexpresión de Her2 es un factor pronóstico independiente del tamaño del tumor (que además presenta la posibilidad de tratar con herceptina y con ello aumentar la supervivencia del paciente).
Índice de proliferación celular En este caso, mediante el anticuerpo Ki67 se ha detectado qué células están en ciclo celular, es decir, las células que están proliferando. El índice de proliferación es un factor pronóstico negativo ya que, si es elevado, indica que el tumor crece muy rápido. La ventaja es que los tumores con un índice elevado suelen reaccionar y responder mejor al tratamiento (la quimioterapia y la radioterapia atacan a las células que están proliferando).
Un tumor con un turnover bajo tendrá pocas señales (del anticuerpo) en los núcleos.
6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CONCLUSIONES - La inmunohistoquímica es un método desarrollado para la detección de antígenos tisulares o celulares.
- He evolucionado hacia el aumento de la sensibilidad y la especificidad de la técnica.
- La expresión de diferentes proteínas celulares ayuda a conocer el tipo de neoplasia y a establecer un pronóstico y tratamiento.
- Validación en investigación de diferentes proteínas diana y estudios de biología molecular. Muchas de las proteínas que se utilizan en esta disciplina pueden validarse en tejidos si se detecta su expresión.
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