Tema 3 - El cromosoma eucariotico (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura citogenetica
Año del apunte 2014
Páginas 32
Fecha de subida 22/10/2014
Descargas 4
Subido por

Descripción

Apuntes de las clases de Citogenética 2014

Vista previa del texto

TEMA 3 – El cromosoma eucariótico 3.1.-Tipos de cromosomas a) Virus y bacterias: presentan un solo cromosoma, con múltiples copias.
Mayoritariamente suele presentar una estructura circular de doble cadena, aunque lo encontramos también como cadena simple o lineal. La medida del genoma y número de genes de los organismos procariotas es muy variable. Si observamos el genoma de eucariotas vemos como aumenta claramente.
b) Hongos y levaduras: En general presentan más de un cromosoma. Son moléculas grandes que forman complejos con proteínas y en la mayoría de individuos, se desconoce la relación de proteínas con el material genético.
c) Eucariotas superiores: Poseen más de un cromosoma.
Cada cromosoma está formado por una molécula lineal de DNA unida a histonas (unión muy fuerte).
3.2.- Estructura química del cromosoma eucariota a) Organización de la fibra de cromatina Primer nivel – El nucleosoma: es la estructura más simple de organización. Está formado por 146 pares de bases (pb SEMPRE, SEMPRE), aproximadamente dos vueltas de la cadena de DNA, que se encuentran enrolladas alrededor de un octámero proteico de histonas (octámero formado por 4 parejas de dichas proteínas). Dichas proteínas Histonas (H2A, H2B, H3 y H4) son muy ricas en lisina y arginina (que presentan carga neta positiva). En la base de este segmento se encuentra otra histona, H1, y es el conjunto de todo ello lo que denominamos nucleosoma. Se trata del nivel más básico de organización de la cromatina de unos 11nm de diámetro.
Estas histonas son proteínas muy conservadas evolutivamente, en diferentes especies evolutivamente su secuencia de aa es muy parecida, ello nos indica que realizan funciones muy básicas. Una alteración en los aa de las histonas va directamente relacionado a alteraciones en la organización de la fibra de cromatina.
Todas las histonas se caracterizan por presentar dos dominios estructurales diferenciados: • Dominio estructural (histone fold o dominio de plegamiento) que permite que estas histonas interactúen entre ellas para formar el octámero y a su vez que las diferentes histonas interaccionan con la cadena de DNA con puentes de hidrogeno entre Lys y Arg con los grupos fosfato del DNA.
• Dominio del extremo N-terminal de las histonas se proyectan hacia el exterior del nucleosoma. En una visión lateral de la macromolécula vemos que el extremo terminal de las histonas siempre se proyectan hacia el exterior del nucleosoma, esta disposición tiene un significado estructural.
Segundo nivel – Fibra de 10nm o Collar de Perlas: la repetición en cadena del primer nivel a través de la doble cadena de DNA, recibe el nombre de collar de perlas a causa del aspecto que muestra al ser observado al microscopio electrónico (ME). Está formado por la agrupación de histonas con las 146pb enrolladas alrededor del octámero y entre nucleosomas tenemos aproximadamente unos 80pb.
Tercer nivel – Fibra de 30nm: el collar de perlas se va prolongando y se pliega compactándose en una fibra de mayor tamaño. Para que se de esta estructuración (que presenta diversos modelos que observaremos más abajo) es necesaria la actuación de la histona H1 que interactúa con otras H1 y por otro lado las colas N-terminales de la histona H4.
Existen diferentes modelos de organización de dicha fibra de 30nm: - Modelo del SOLENOIDE (o cable de teléfono): se trata del modelo más explicado y el que se consideraba como único modelos hasta estudios de hace relativamente poco (uno de los últimos publicado a finales de 2013). Este modelo explica que la fibra de 10nm forma un muelle de forma cilíndrica, al SE ME observa una fibra más gruesa.
- Modelo en ZIG-ZAG: aunque no está claro que el único modelo sea el del solenoide, hay estudios o teorías que afirman que esta disposición también se da en zig-zag el empaquetamiento de la fibra del collar de perlas.
- Modelos sin determinar alternativos al solenoide Organización de la cromatina en el cromosoma interfasico: a partir de este punto todas las explicaciones de sobre cómo se organiza la cadena de DNA son especulaciones, teorías y fenómenos observados en experimentos in vitro en un laboratorio.
Algunas teorías, hasta hace un año las más aceptadas, explican que la fibra de 30nm se organiza en otro nivel superior de 300nm. Esta estructura sería la de mayor tamaño que un cromosoma interfasico es capaz de alcanzar. La mayoría de la bibliografía indica la existencia de un esqueleto proteico, una base proteica llamada chromosome scaffold, y en ella se enganchan en diferentes regiones fibras de cromatina de diferentes medidas de 30nm con loops de tamaño aleatorio que como mucho el conjunto alcanza un grosor de 300nm, de ahí su nombre de fibra de 300nm.
Al tratar cr metafasicos mitóticos o núcleos interfasicos con un tratamiento para eliminar las proteínas (tratando el contenido nuclear con heparina, sulfato de dextrano, etc) observamos una estructura que recuerdan a los cr metafasicos y en el núcleo interfasico vemos regiones más densas a partir de la cual se proyectan numerosos loops de DNA de medida variable. Estas evidencias son en las que se basaron muchos científicos para afirmar la existencia del esqueleto y la fibra de 300nm.
En otro experimento se identificaron los componentes del scaffold proteico i a día de hoy se han identificado tres proteínas que forman este esqueleto proteico; la topoisomerasa II (implicada en el procesamiento del DNA), SMC2 (proteínas del mantenimiento de los cr) y la KIF IV (de la familia de las kinesinas de unión a los microtubulos).
También se conoce que el scaffold presenta una estructura dinámica pudiendo ser rígido, discontinuo o disperso.
Al estudiar las secuencias de DNA que se une al scaffold se observó que son regiones caracterizadas por la elevada presencia de A/T, estas regiones reciben el nombre de SAR (scaffold attachment regions).
b) Dinámica del cromosoma interfasico: eucromatina y heterocromatina Los cromosomas interfasicos presentan formas de cromatina condensada i formas más laxas: la eucromatina y la heterocromatina.
Concepto citológico: la heterocromatina es aquella que se tiñe diferente de la eucromatina. En núcleos interfasicos se tiñen intensamente (centrómeros i corpúsculo de Barr). En cromosomas mitóticos la heterocromatina corresponde a las regiones que se tiñen menos coincidiendo con las constricciones secundarias.
Concepto funcional - - Eucromatina: cromatina transcripcionalmente activa, más laxa, la mayoría en forma de fibra de 30nm aunque un 10% presentan la estructura de 10nm Heterocromatina: cromatina trancripcionalmente inactiva que presenta un grado de compactación muy elevado. Existen dos subtipos o Constitutiva: DNA altamente repetitico (centrómeros y telómeros).
o Facultativa: cr X en las hembras de mamíferos.
Las características de cada tipo de cromatina (eucromatina y heterocromatina) dependen de los siguientes factores.
• • • Metilación de citosinas Modificaciones de los extremos N-terminales de las histonas Presencia de variantes de estas histonas b1) Metilación de citosinas Se trata de la incorporación de grupos metil en la posición 5 de las citosinas, esta reacción es catalizada por la familia de las DNA Metiltransferasas (DNMT). En mamíferos en general y en algunos eucariotas se han descubierto diversos tipos de DNMT que actúan para producir la metilación de dicho carbono cinco, todas ellas independientemente del grupo celular (no son específicas de ciertos tejidos o tipos celulares sino que están presentes en ellos). Todas las DNMT utilizan como donador del grupo metil a la molecula S-Adenosil Metionina (SAM).
¿Por qué la metilación de citosinas implica cambios conformacionales? - La metilación del DNA impide la unión de factores de transcripción.
La metilación del DNA permite la unión de las proteínas methyl-CpG-binding domain proteins (MBDs).
MBDs reclutan proteínas adicionales, como las proteínas modificadoras de histonas i otras proteínas de remodelación de la cromatina.
b2) Modificaciones del extremo N-terminal de las histonas Se trata de modificaciones covalentes reversibles en los aa de dichos extremos o colas N-terminales realizadas por encimas específicas a las histonas que forman parte del nucleosoma. El hecho de que las histonas presenten estas alteraciones provoca unos cambios conformacionales que consecuentemente afectan al DNA que se encuentra en esos fragmentos cromáticos.
Hablamos de cuatro modificaciones principales: Acetilación de lisinas y argininas (muy frecuentes) Metilación de lisinas y argininas Fosforilación de serinas Ubiquitinizacion Alguna de estas modificaciones también se da en el dominio globular pero son muy poco frecuentes.
Ejemplos de que causa dichas modificaciones: • Acetiltransferasas de histonas (HATs) o Las acetilaciones están catalizadas por estas HATs que transfieren el AcetilCoA a las colas de las histonas. Existen HATs de tipo A y de tipo B (esta en el pdf, él ni lo dijo en clase creo).
o Existen diversos argumentos que indican que esta acetilación implica que la carga neta positiva de las lisinas y argininas queda neutralizada. El DNA de por si como sabemos presenta una carga neta negativa causada por los grupos fosfato. Al neutralizar dicha carga positiva de los aa debilita la interacción entre las histonas y el DNA lo que causa cambio conformacional y facilita la transcripción por lo tanto las acetilaciones están asociadas con eucromatina.
• Deacetylasas de histonas (HDACs) o Producen el efecto contrario al descrito por parte de los HATs. Retiran el grupo AcetilCoA lo que vuelve a compensar las cargas positivas con las negativas. Ello provoca el retorno del cambio conformacional. Ello provoca la unión entre las histonas y el DNA lo que se utiliza para silenciar genes y procesos asociados a heterocromatina.
Metiltransferasas de lisinas (HKMTs) o Estas metiltransferasas actúan de forma específica en determinados lugares. Se dan sucesivas metilaciones en la misma lisina produciendo en algunos casos trimetilaciones. El modelo más sencillo explica que estas lisinas metiladas son un sistema que se utiliza para evitar la acetilación, por ello la metilación siempre está asociada a regiones cerradas transcripcionalmente no activas (heterocromatina).
o Existen también una serie de enzimas que retiran estos grupos metil pero a día de hoy no se conocen cuales son.
• El código de las histonas Esta denominación hace referencia y un símil al código genético del DNA, este código de las histonas viene dado por las modificaciones de los extremos N-terminal que hemos visto anteriormente lo que determina que se produzcan combinaciones de señales que causan que en regiones concretas actúen factores remodeladores de la cromatina (proteínas que se desplazan hasta un lugar determinado del genoma y modifican la cromatina). Todo ello determina el cómo y cuándo el DNA empaquetado en los nucleosomas es accesible.
El código de las histonas pone de manifiesto que una determinada combinación de modificaciones determina que esta zona esté en forma de eucromatina o heterocromatina. Este código actúa como señales que son reconocidas por otras proteínas remodeladoras del DNA cambiando su estado conformacional lo que causa un cambio del grado de condensación de la cromatina.
Hoy en día conocemos como “leer” dicho código lo que nos permite entender en qué estado conformacional se encuentra la cromatina.
- Una trimetilación del aa número 9 de la histona H3 implica una silenciación del dominio cromatinico en forma de heterocromatina.
Una lisina metilada en posición 4 y acetilada en posición 9 este código está relacionado con la expresión génica y eucromatina.
Una fosforilación en la serina en posición 10 y una acetilación en posición 14 indica expresión génica y eucromatina.
Una metilación de la lisina en posición 27 implica la inactivación del cr X y silenciación de genes Hox.
Lectura del código de las histonas #Participación de las proteínas HP1 La proteína HP1 es un oligomero formado por diferentes subunidades, una de ellas se llama cromodimino HP1 que reconoce específicamente lisinas de la cola N-terminal en posición 9 de la histona H3 que estén trimetiladas. Esta proteína HP1 es muy típica en metazoos.
Esta HP1 presenta un segundo dominio funcional llamado cromo-shadow, este dominio tiene la función o capacidad de unirse específicamente a otros dominios cromo-shadow de proteínas adyacentes; creando así dominios de dimeros de HP1-HP1 que se reconocen y unen entre ellas. La función final de esta formación de dimeros es la existencia de regiones o segmentes concretos de nucleosomas que se condensan más y lo que provoca un cambio conformacional en una estructura más cerrada.
Existe un tercer dominio que lleva la enzima necesaria, en este caso una metiltransferasa, para metilar los nucleosomas adyacentes y conseguir aún mayor compactación.
También existen secuencias de DNA que impiden que la histona H1siga compactando el DNA, estas regiones de cromatina suelen ser consideradas sin sentido cuya función es impedir determinadas zonas se compacten.
#Participación de las proteínas Sir (Silence Information Regulator) Son proteínas parecidas a las HP1 pero en modelos de levadura (Saccharomyces) actúan en los extremos de los cromosomas de estas levaduras (en sus telómeros). Inicialmente estas Sir reconocen específicamente las colas N-terminal que no presentan acetilaciones lo que provoca que se unan estas Sir entre ellas. El resultado de dichas uniones es la condensación y heterocromatzación del telómero.
Las proteínas Sir son reclutadas a los telomeros por otras proteínas que reconocen las repeticiones en tándem típicas de los telomeros. Estas proteínas están situadas en esos extremos que serán reconocidas por las Sir buscando las desacetilaciones a través de su dominio funcional que reconoce esta ausencia de grupos AcetilCoA. Sir, además, presenta un segundo dominio funcional que permite crear uniones entre otras moléculas de proteínas Sir adyacentes.
Muchas Sir tienen un tercer dominio funcional que es una desacetilasa que puede eliminar los grupos AcetilCoA de nucleosomas adyacentes a los que se ha unido, lo que provoca una expansión de la desacetilación expandiendo el señal heterocromico.
#Participación de las proteínas que contienen bromodominios Los cromodominios son dominios funcionales en los factores modeladores de la cromatina (dominios proteicos) que lo que hacen es reconocer metilaciones.
Por otro lado existen otros dominios funcionales antagonicos llamados bromodominios que lo que hacen es reconocer acetilaciones.
Lectura del código de las histonas: Modelo de extensión del señal hetero/eucromatinico En el segmento de cromatina que presentamos a continuación, se debe modificar su estructura (de abierta a cerrada o al revés). La primera etapa de un cambio conformacional es la llegada de un señal a la celula que le indique que debe haber modificación. Esta señal lo que hace es activar una proteína reguladora de genes, así se regula la actividad de las proteínas que modifican las colas N-terminales de las histonas. Genéricamente a estas proteínas modificadoras se les llaman como “proteínas que escriben”.
Una vez producida la marca señal en una región concreta, llegan unas moléculas que leen este código de histonas (modificadores de al cromatina) que presentan en la parte intrínseca de su estructura bromodominios o cromodominios (o leen metilaciones o leen acetilaciones).
Estos lectores además modifican el estado conformacional a través de la formación de oligomeros como los dimeros de HP1 y de Sir (respectivamente) que veíamos anteriormente. Así se logra un mayor empaquetamiento de la cromatina o des empaquetamiento de esta.
A menudo estos lectores tienen la capacidad de actuar y escribir como las proteínas que veíamos inicialmente, algunas son factores que a la vez leen y modifican. Este proceso tal y como esta explicado nos puede llevar a preguntarnos si estos procesos no se paran hasta el final del cr, así que este modelo está asociado a modelos de señal frontera que evitan que estas modificaciones se extiendan infinitamente.
En resumen toda esta dinámica del cr interfasico depende de ambos factores que hemos visto antes; la metilación de las citosinas y de las modificaciones de los extremos N-terminales de las histonas que conforman el código de las histonas. En realidad todo ello no va cada cosa por separado sino que actúan todas a la vez para maximizar o minimizar los estados de hetero o eucromatina.
A todo ello hay que añadirle un tercer factor.
b3) Presencia de variantes de histonas Todas las histonas presentan variantes que les permiten realizar funciones específicas. Son histonas que forman parte de los nucleosomas igualmente y que realizan funciones concretas en regiones concretas.
• • Variantes de la H3 o H3.3 – Variante presente en regiones con gran actividad transcripcional.
o CENP-A – Variante presente en los nucleosomas que forman parte del centrómero además de estar presente también en ña unión del cinetocoro.
Variantes de la H2 o H2AX – Variante presente en las cadenas de DNA que se están reparando tras una rotura de la doble cadena. No es una histona que esté en regiones completas sino que se encuentra repartida por todo el DNA en diferentes intervalos.
o H2AZ – Variante relacionada con la expresión génica y la segregación cromosómica.
o macroH2A – Variante relacionada con la represión transcripcional y en la inactivación del cr X.
Concepto de epigenetica La epigenetica son aquellos mecanismos que regulan la actividad de un gen, que modifican su expresión sin cambiar la secuencia de nucleótidos. Las modificaciones covalentes de histonas, la metilación de citosinas, entre otras son formas diferentes de epigenetica.
El cromosoma mitótico: grado de condensación máximo Hasta ahora hemos visto como se organizaba la cromatina en el cromosoma interfasico, ahora pasaremos a estudiar cómo se organiza un cromosoma mitótico.
El punto final del proceso de condensación es ese paso de la fibra de 300nm a la estructura que todos conocemos del cr metafasico, grado de máxima condensación. Como los estudiados anteriormente todos estos modelos no son definitivos ya que muchos de ellos son hipótesis creadas a partir de observaciones experimentales.
Existe una teoría que profundiza en el modelo del solenoide que afirma que la fibra de 300nm con esqueleto proteico se enrolla de nuevo en modelo solenoide.
Otras teorías hablan de otro modelo denominado Modelo mini band que afirma que la fibra de 30nm se estructura alrededor de una matriz nuclear. Este modelo ha sido observado en células de pollos.
Si ponemos como ejemplo el cr22 observamos que si estuviera estirado como doble cadena de DNA mediría unos 15mm, en el núcleo interfasico ocupa unos 0,015mm aproximadamente (hablamos de que se encuentra mil veces compactado). Si ese mismo cromosoma lo observamos condensado en metafase y vemos que mide 2µm (en este caso la compactación es superior a las 10.000 veces).
Esta condensación facilita la separación de las dos moléculas de DNA en las cromatidas, el hecho de que este el cromosoma condensado a la vez también es un método de protección para evitar que este se rompa.
¿Cuáles son las moléculas que determinan el grado de condensación máxima? Aparte de las modificaciones de histonas encontramos otras modificaciones en la estructuración de la fibra de 300nm, existe un esqueleto proteico en el que se unirá la fibra de 30nm. Al estudiar cr metafasicos y los tratamos como núcleos interfasicos, observaremos restos que nos recuerdan a la forma de un cromosoma. Estos restos proteicos fueron identificados como Topoisomerasas II, Condensinas y KIF4.
Al estudiar cómo se organizan estas moléculas proteicas a lo largo del cromosomas vemos representada el dibujo de la derecha, vemos dos ejes diferenciados.
De todas estas moléculas proteicas la más estudiada y que más conocemos a día de hoy son las condensinas.
Condensinas Son las moléculas que claramente producen el grado máximo de condensación del DNA. Son toda una familia de proteínas que presentan una estructura común. Estas condensinas forman una red que mantiene el DNA altamente organizado durante la fase M del ciclo celular.
Las condensinas de eucariotas contienen dos proteínas llamadas Smc2 y Smc4 que forman parte de una familia proteica mayor encargada del mantenimiento de los cromosomas. En uno de los extremos de las dos Smc, estas se unen formando un dominio funcional que actúa como de bisagra (tiene capacidad de movimiento lo que permite que la parte globular se abra y se cierre). En el extremo opuesto de la región “bisagra” hay un dominio de naturaleza globular que tiene activitat ATPasa (hidroliza ATP ya que depende de este). Hay presencia de kleisinas que son moléculas del dominio globular que modulan la activdad ATPasa.
¿Cuál es la disposición de las condensinas en el cromosoma? Al realizar observaciones con técnicas fluorescentes como inmunoFISH (anticuerpos que reconocen la condensina) se obtienen evidencias de que las condensinas se encuentran a lo largo de todo el cromosoma en un eje central. Ello también refleja que la estructura de dichas condensinas es intuitiva en favor de la función que realizan.
Esta estructura se inicia espontáneamente, ante la presencia de ATP, y comienza a organizar el DNA y demás componentes de la fibra cromatinica de una forma coordinada junto con otras moléculas de condensinas. Se organizan formando un eje longitudinal a lo largo de todo el cromosoma.
El modelo de condensación observado en el laboratorio con DNA y condensinas purificadas consiste en que las condensinas se unen por el dominio bisagra y exponen el dominio globular con actividad ATPasa y serian este último dominio los que engancharían el DNA y lo irían condensando. Si observamos una cromatide durante la mitosis vemos que se sitúan como libros en una librería obteniendo una condensación máxima; las condensinas forman un eje central y alrededor de él se sitúan los loops de fibra de DNA.
Existe un artículo científico del año pasado que propone que en un cromosoma in vivo no existe ninguna de las fibras estudiadas anteriormente. Solo existe la fibra de 10nm y el resto de cosas que hemos visto a lo largo del tema son artefactos creados a partir de las propias técnicas de observación.
En esencia lo que se dice el artículos es que el cr metafasico está formado por un eje y que se observa una fibra de 10nm i a veces de 30nm. Pero que las moléculas que realmente organizan la cromatina son las condensinas, no solamente cuando los cr deben condensarse para la mitosis sino que a lo largo de todo el ciclo celular. A la hora de la mitosis la observación es errónea ya que todo esta compuesto por fibra de 10nm muy muy condensada y por ello nos parece que sea de 30 o 300nm, pero en realidad son fibra de 10nm mega apiladas.
3.3.- Estructura externa del cromosoma eucariotico Los cromosomas presentan morfologías diferentes ante los procesos de división mitótico y meiótico.
a) El cromosoma metafasico mitótico En esta fase cada cromosoma está formado por dos cromatides cada una de ellas conformadas por una sola molécula de DNA. En términos generales se aprecia cierta constancia en la morfología, la medida y el número de cromosomas.
- Morfologia: los cr se clasifican en función de la posición del centrómero. Así se define un brazo p (superior) y un brazo q (inferior).
- Medida: esta es difícil de determinar ya que depende de la técnica que se utilice para observar los cr a causa de la propia técnica se obtienen medidas diferentes no constantes en los mismos cr.
Número: las células somáticas de al mayoría de las especies se caracterizan por presentar un par de cr de cada tipo (dos cr 1, dos cr2 etc…). El número de cromosomas se representa por 2n y las células son denominadas como diploides. El par de cr se conoce con el nombre de cromosomas homólogos.
- En los organismos vivos con DNA no existe correlación entre el número de cr y el contenido de DNA. Hay organismos con muchos cr de pequeño tamaño y otros organismos con muchos menos cr con un tamaño inmenso. Ello es debido a que a lo largo de la evolución el DNA ha sido sometido a mucha presión y reorganización. (en el ppt había más ejemplos, con estos tres de abajo creo que queda claro) Tampoco existe una relación entre el número de cr y el nivel evolutivo en el que se encuentre el organismo.
Técnicas o métodos de estudio de los cromosomas • Complemento cromosómico: conjunto de cromosomas de una célula o un organismo.
• Cariotipo: estudio de las características morfológicas externas (forma, medida y número) que se realiza ordenando los pares de cromosomas homólogos en relación a su medida y forma.
• Ideograma: representación gráfica del cariotipo.
b) El cromosoma metafasico meiótico Los cromosomas durante la meiosis se presenten de forma diferentes dependiendo si nos encontramos en meiosis 1 o 2.
Durante la metafase I los cromosomas se presentan en forma de bivalentes, cada cromosoma (formados por dos cromatidas) emparejado con su homólogo unidos por quiasmas.
Dependiendo del número, la localización de los quiasmas y la longitud de los cr los bivalentes presentan morfologías diferentes.
Durante la metafase II observamos los cromosomas con dos cromatidas muy separadas pero solo tenemos una copia de cada uno (haploidia).
3.4.- Estructura interna del cromosoma eucariótico Un cr funcional está formado por una molécula lineal de DNA que contiene los orígenes de replicación (puntos desde los cuales se inicia la replicación del DNA), un centrómero y dos telomeros. Para la creación de esas dos estructuras (centrómero y telómero) existen secuencias específicas que inducen su aparición morfológica.
En los años 90 hubo un experimento que fue clave para entender cómo se desarrollan los telomeros y centrómeros en las regiones concretas donde deben aparecer para realizar su función.
Partían de un plásmido (secuencia de DNA circular) que contenía genes para la síntesis de leucina (aa esencial, leu+) y se transfirieron a las células de saccharomyces (cel eucariota modelo) donde se vio que algunas cels incorporaron el plásmido.
Posteriormente se cultivaron estas cels con el plásmido incorporado en un medio sin leucina, tan solo las cels con el plásmido correctamente incorporado sobrevivirían. Al observar la descendencia de estas células que asimilaron el plásmido se vio que estas no crecían porque el gen no tenía capacidad de ser transmitido a las generaciones.
En una segunda etapa experimental el plásmido se incorporó con un origen de replicación, o una secuencia de nucleótidos que actuaban como tal. Al repetir todo el proceso anterior con este nuevo modelo de plásmido se observó que una gran cantidad de cels hijas no tenían capacidad de sobrevivir sin leucina pero sí que había un 5-10% de cels que si habían incorporado el plásmido y tenían capacidad de transmitirlo.
Ante la evidencia que con un origen de replicación si que puede ser transmitido un gen incorporado se observó que hacía falta algo más para que la segregación cromosómica se diera de forma más eficaz.
En una tercera parte experimental se incorporó al plásmido una región que podía actuar potencialmente como un centrómero, se llevó a cabo todo el proceso experimental de nuevo y se observó que las cels hijas podían proliferar sin ningún tipo de problema y más de un 90% de ellas presentaban el plásmido.
Una construcción final de esta serie experimental observaron que si se intentaba insertar el plásmido de forma lineal este no era incorporado y no era segregado dando lugar a las células muertas. Esto demostró lo que algunos científicos especulaban sobre la necesidad de la existencia de los telomeros para que moléculas lineales se puedan transmitir como un plásmido lineal en el 100% de los casos.
La importancia de todos los anteriores experimentos fue demostrar que son necesarias regiones en el DNA que se comporten como centrómeros y telomeros para que la segregación se dé de forma adecuada.
• El centrómero: es la región del cr que se asocia con las fibras del huso durante la división celular, facilitando así la migración de las cromatidas hermanas o de los cr homólogos hacía los polos celulares durante la anafase. Se incluye en él el cinetocoro, región específica del centrómero que se asocia con los microtubulos (utubulos) del huso. La mayoría de cr presentan un único centrómero o constricción primaria.
o Organización molecular El centrómero más sencillo de explicar es el S. cerevisiae.
Todos los centrómeros se organizan de la misma manera en ellos, caracterizados por presentar 125pb que están asociados a otras proteínas, en esta región se observan tres dominios funcionales claramente denominados CDE I, II y III.
CDE I y III flanquean el dominio central y su secuencia presenta gran cantidad de variantes de nucleótidos. Por otro lado CDE II es el dominio central que tiene como secuencia una gran cantidad de Adenina y Timina (más del 90%). Cada uno de estos dominios presentan una función determinada.
• • CDE II forma un nucleosoma, uno solo, que se caracteriza por presentar una variante de la H3, la CENP-A.
CDE I y II lo que hacen es situarse en los extremos de este nucleosoma y actúan como centros de reconocimiento de proteínas cinetocoricas (estructura proteica implicada en la segregación de los cr).
En esta segunda imagen observamos lo mismo que en la primera pero con las proteínas del cinetocoro específicas, el círculo azul es CENP-A lo de alrededor es el CDE II. Esto evidencia que solo hay una vez esta secuencia en todo el cr y por eso solo se puede formar un centrómero en ese lugar específico en cada cr normalmente.
El DNA centromerico puede ser muy variable entre especies. La relación DNA centromerico por utubulo entre especies varía entre 1.000 y 10.000 veces.
En el caso del S. pombe (MALPENSADAS) que tiene cuatro pares de cr, se observó que las diferentes regiones centromericas de cada cr de S. pombe eran diferentes y de gran tamaño (hasta 65kb), al analizar las características de los nucleótidos se vio que aunque hubiera diferencias de tamaño se mantenía cierta estructura similar.
Existe una región central llamada CC (no conservada a nivel de secuencia de nucleótidos, ello quiere decir que las diferentes regiones CC de los cuatro cr de S. pombe tienen nucleótidos diferentes). Esta región CC se encuentra flanqueada por regiones B de DNA altamente repetitivo, al lado de B se encuentran otras regiones L y K muy repetitivas también.
Aunque no idénticas observamos en ambos modelos un dominio central que se encuentra flanqueado por otras regiones y aunque son diferentes en cierta manera actualmente se sabe que existen parecidos entre las dos disposiciones de S. cerevisiae y pombe.
AL igual que en S. cerevisiae las regiones CC y B presentan la variante de la H3, CENP-A. Estas regiones presentan una variante de histonas con metilación de lisina K9 H9 que indica heterocromatinización.
En el caso de nuestra querida Drosophila melanogaster, esta presenta diferentes cr con secuencias centromericas diferentes mucho más grandes incluso que las de S. pombe de hasta 420 Kb. Esta secuencia se caracteriza por presentar DNA alfa satélite (altamente repetitivo) que son repeticiones en tándem de 5 nucleótidos, estas regiones están intercaladas por elementos móviles como transposones y pequeñas trazas de DNA no repetitivo.
Esta arquitectura de la Drosophila es extensiva a la mayoría de metazoos.
Estas regiones centromericas al analizarlas observamos que hay dos tipos de cromatina, existen dos tipos de configuración de empaquetamiento de sus nucleosomas.
Existe un tipo caracterizada por presentar la variante de la H3, CENP-A y estas regiones se encuentran intercaladas con otras regiones de nucleosomas que presentan una cola N-terminal de la H3 dimetilada en la lisina4.
Cuando relacionamos la estructura de estas regiones con la función hoy en día somos capaces de encontrar esa relación ya que sabemos que las regiones de CENP-A son las que están directamente relacionadas con la formación del cinetocoro. En cambio la otra región dimetilada está dirigida y orientada hacia el lado interno del centrosoma.
En eucariotas superiores las proteínas de asociación estructuran el cinetocoro. Se trata de complejos multi proteicos que se unen a las fibras del huso, formando por proteínas homologas a las que hemos observado para los otros modelos como el de S. cerevisiae. En esencia los modelos son iguales pero son los factores los que son diferentes. La secuencia de nucleotidos es al que determina el tipo de cromatina i el tipo de centrómero que presenta.
El centrosoma es una estructura constreñida donde las cromatidas hermana están muy cerca las unas de las otras; ello es debido a las elevadas concentraciones de cohesinas en las regiones peri y centromericas.
ESTO DE AMARILLO NO HACE FALTA SABERSELO (NI LA IMAGEN DE AL LADO) Vemos que los nucelsomas (círculos A grises) que tienen CENP-A son los que dirigen la formación del cinetocoro, vemos que se organizan en una base llamada CCAN donde se unen proteínas motoras, proteínas kinasasas, proteínas de unión a microtubulos y proteínas del grupo de control.
Los cr pueden presentar diferentes tipos de centrómeros: - - Centrómeros localizados: donde la inserción de los utubulos se encuentra restringida a un segmento del cr. La mayoría de los cr son monocéntricos con centrómero localizado.
Centrómeros difusos: donde la inserción de las fibras del huso se realiza sobre toda la extensión cromosómica. Estos cr que presentan este modelo son denominados cromosomas holocéntricos ya que presentan múltiples centrómeros unos al lado de otros. Es una estructura típica de nematodos, insectos y plantas. Todo apunta a que estos cr presentan regiones de DNA que permiten la diferenciación a centrómero a lo largo de toda su estructura.
Cualquier situación que modofique la disposición de los centrómeros son anomalías, las dos más frecuentes son las de los cr dicentricos (aquellos que presentan dos centrosomas) y también tenemos la de cr acéntricos (aquellos que no presentan centrómero).
La misdivisión es cualquier tipo de división celular en la que a veces los cr se rompen por la mitad (las dos moléculas de DNA se rompen formando dos cr) este fenómeno provoca la aparición de dos cr telocéntricos.
• Telomeros: son secuencias localizadas en los extremos de los cr de eucariotas importantes en la replicación y en el mantenimiento de estos. Los telomeros son regiones en tándem repetitivas de G y T, tienen una mono cadena rica en T y otra mono cadena rica en G.
Se trata de una secuencia repetida en los extremos con repeticiones que varían en función de la especie.
Esta riqueza y repetición de G y T en estas secuencias en tándem es variable en tamaño en diferentes especies, normalmente varia entre 300 y 8.000pb pero existen especies como el S. cerevisiae que tan solo presenta entre 60 y 100pb.
Función de mantenimiento de los cr Una característica común de todas las secuencias telomericas es que estas repeticiones forman una mono cadena rica en G (llamada G-rich strand) que sobresale en una región 3’ OH (la medida de este extremo protuberante también es variante entre especies).
En la imagen (A) vemos un telomero tal y como se observaron en los extremos de los cr; observamos una estructura en forma de bucle o lazo. A día de hoy se conoce que proteínas forman parte y que funciones realizan, esta estructura terminal se denomina t loop y se presenta muy conservada a lo largo de las especies. Es ese extremo protuberante rico en G el que se enrolla formando el loop que se inserta dentro de la doble hélice de DNA desplazando la mono cadena.
Se trata de una estructura altamente heterocormatinizada y por lo tanto, muy resistente. A su vez es rica en proteínas de reparación del DNA y proteínas de union a cadena simple de DNA entre otras. Así se obtienen secuencias unidas muy fuertemente a proteínas que forman estructuras circulares que: Protegen los extremos de exonucleasas Evitan la fusión entre cr Asocian los telomeros a dominios específicos dentro del núcleo Existen diferentes tipos de proteínas que realizan la función de coger el DNA, modificar su estructura y procesarlo; uno de ellos son las helicasas por ejemplo. Es necesario que este extremo protuberante se una específicamente a una región y desplace la doble cadena, para ello toda una serie de enzimas como las que vemos en la imagen deben actuar. Todo ello es debido a que si quedara abierto un extremo abierto de la doble cadena de DNA la cel la reconoce como un fragmento de DNA roto.
Una de las proteínas implicadas es POT-1 Para la formación del loop T hacen falta proteínas estructurales que estabilizan el loop a lo largo de toda su estructura como son TRF1 y TRF2. Esta estructura cerrada tiene función de mantenimiento evitando que los extremos abiertos del DNA quede expuesto a exonucleasas que lo digieran, se evita así también la fusión de cr ya que sino serien cr con extremos abiertos con alta capacidad de fusionarse y por último el loop T tiene además de todo esto función de asociación o anclaje de los cr al interior del núcleo interfasico en su dominio o región en el interior del núcleo.
Función en la replicación de cr lineales Cuando la replicación llega al extremo de un cromosoma, la cadena adelantada lo hará de forma normal (5’ 3’), sin embargo la retardada, cuando llegue al final y elimine el ‘‘primer’’, dejará un hueco sin que se pueda sintetizar en sentido 5’ 3’ ya que no hay ningún extremo OH libre.
Este problema lo solucionará la telomerasa (ribo nucleoproteína). Esta presenta una pequeña cadena de RNA que será complementaria al final de la cadena adelantada y la hará haciendo mayor. Una vez aumentada de tamaño, en la cadena retardada ya podrá entrar un ‘‘primer’’ y terminar de sintetizar la cadena retardada por la DNA polimerasa. Este extremo añadido por la telomerasa formará los T loops (o loops T).
La telomerasa es un gran complejo proteico que forma parte de la región intrínseca del loop T; esta telomerasa por complementariedad de bases se une a los extremos y actúa como un “primer” para sintetizar más nucleótidos al largo de toda la secuencia. Ello permite que se forme otra secuencia de DNA y ayuda a que en cada división la longitud telomerica no se vea reducida. Si no existieran secuencias específicas para ello en el telomero esta telomerasa no podría actuar.
Pero no todas las células del organismo presentan telomerasa, la mayoría de las células somáticas no la presentan actividad telomerasa (telomerasa -). Por ello un alto porcentaje de las divisiones celulares implican un acortamiento del telomero (cosa que ya hemos estudiado que está implicado en el envejecimiento celular). Se sabe que hay tres grandes tipos de cels que son telomerasa +, como son las cels germinales primordiales, las cels madre y en algunos tipos de cels cancerígenas (con alta proliferación).
Toda esta actividad telomerasa está regulada por la TRF1 y TRF2.
TODAS ESTAS COSAS QUE DIGO YO DE TELOMERASA + O – LAS DIGO YO, EL PROFE NO DIJO ESO Cromomeros: se trata de partículas discretas de cromatina que presentan grados de enrollamiento variable a lo largo del eje longitudinal. Si cogemos un cr metafasico y lo teñimos uniformemente veremos que existen zonas más oscuras que otras. Las zonas más teñidas son los cromomeros, se trata de un concepto puramente citológico de observación al microscopio.
Existe cierta relación entre estos cromomeros y lo que comúnmente se conocen como bandas cromosómicas.
Regiones organizadoras del nucléolo: algunos cr presentan constricciones secundarias (regiones constreñidas aparte del centrómero) normalmente ocupan una situación subterminal en los brazos del cr. Estos segmentos más distales (hacia fuera) se denominan satélites. Estos segmentos de DNA que conectan el satélite con el resto del cr contienen los genes que codifican para RNA ribosómico. Esta observación en el cr interfasico organiza el nucléolo y por ello reciben este nombre. Es decir, algunos cr presentan genes para RNA ribosómico en constricciones secundarias. Ello es debido a cómo se organiza al cromatina es estos genes, hay centenares de copias de estos genes que se organizan así y que las observamos al microscopio.
3.5.- Arquitectura nuclear y territorios cromosómicos Los cromosomas ocupan territorios discretos en el núcleo interfasico y es una fibra altamente organizada. Esto se consigue mediante uniones entre los cr (telomeros, centrómeros, segmentos de DNA altamente repetitivo) y la envoltura nuclear.
- Evidencias indirectas de ello: o Gran cantidad de intercambios entre cr homólogos en enfermedades acompañadas de roturas cromosómicas.
o Algunos tipos de intercambios entre cr no homólogos se observan con más frecuencia que otros como la translocación entre los cr 9 y 22 que causa el cr Philadelphia. Probablemente ello es uno de los más claros indicativos de que estos dos cr están cercanos entre ellos habitualmente.
- Evidencias directas de ello: o Estudios de localización cromosómica utilizando técnicas de hibridación in situ fluorescentes (FISH) en ella se observó claramente esa disposición espacial y territorial concreta de cada cr.
En embriones de Drosophila se observó cómo existen dos regiones de cr2 y que en todas las cels estudiadas esos cr2 suelen encontrarse en localizaciones periféricas del núcleo.
En células de la raíz de plantas (cels altamente proliferativas) y en ellas se identificaron los centrómeros de un color y los telomeros con otro marcador diferente; aquí se apreció una orientación denominada Rabl donde vemos que todos los centrómeros y todos los telomeros están en la misma disposición en el interior del núcleo.
• Factores que determinan la distribución de los cr o Una de las primeras imágenes que demostraron que cada cr ocupa un lugar en el núcleo se vio en cels de pollo, en ellas se observó que los cr grandes (macro cromosomas) ocupaban esta disposición donde hay dominios con colores diferentes y concretos y que cada uno está relacionado con el cr al que corresponde. En todos los casos se observa la presencia de esos dominios.
Sabemos que los cr se distribuyen en función de su densidad génica, los más ricos en genes tiene tendencia a situarse en el interior del núcleo. En linfocitos humanos vemos como el cr 19 (muy rico en genes) se encuentra mucho más interiorizado que por ejemplo el 18 que es menos rico en genes. Ello sucede en muchos otros tipos de células.
Otro parámetro que nos permite conocer cómo se distribuyen los cr es la morfología de ellos mismos. Los más grandes se sitúan en la periferia, pero los pequeños se sitúan más hacía zonas centrales. Esto tiene más que ver con fuerzas físicas que con fuerzas biológicas, distribuye elementos de diferentes medidas en una esfera. Es una simple reordenación física sin explicación biológica.
• Factores que determinan las secuencias dentro de cada territorio o Los territorios cromosómicos no son iguales en todos los tipos celulares. Si el cr 18 esta al lado del 2 en linfocitos humanos, en las cels de musculo humano no están al lado del 2 pero si que sigue en ambos casos cerca de la periferia.
Aquí abajo vemos dos cr1 en metafase, el brazo p se identifica de rojo y los brazos q de verde. Cuando cogemos estas mismas sondas y miramos núcleos interfasicos vemos 2 territorios diferenciados pero dentro de cada territorio el brazo p y q están claramente diferenciados igualmente (foto segunda fila la primera) Foto arriba en medio se hibridan los extremos telomericos en verde y el resto de rojo y ello se vio que (foto abajo) se ven dos territorios diferenciados y dentro de ellos se ven dos señales diferenciadas de verde, esto indica que a nivel de dominios o bandas de diferentes cr hay una organización. No existe una mezcla de la cromatina sino que cada trozo tiene su lugar.
El cr X de mamíferos en algunas especies se inactiva para realizar al compensación de dosis. En la tercera columna de fotos vemos que en el cr X inactivo y en cada uno de ellos (activo/no activo) y en ellos vieron cómo se localizaban los genes que se expresan (pero solo en el X activo) en el Xa se vio que estaban en la periferia del territorio del gen X, pero estos mismos genes en el Xi estaban en el interior del territorio del gen X. la distribución de los diferentes tipos de cromatina depende de su expresión. Los genes trasncripcionalmente activos se sitúan en la periferia del territorio de su cr, y los inactivos al revés.
Ello indica que hay una organización del territorio en función de: Actividad transcirpcional Tiempo de replicación. La fase S es asincrónica, no se da instantáneamente y parece ser que las regiones que se replican antes o después del genoma influye también en su posición.
El contenido de G y C determinan la posición en la región del territorio FOTO RESUMEN DE TODO LO VISTO HASTA AHORA ¿Todo el núcleo es cr? La presencia de los territorios cromosómicos liga con otro concepto como el del compartimiento cromosómico.
Podríamos decir que los territorios cromosómicos son estructuras porosas como una esponja que permite la entrada y salida de substancias para que se den las diferentes reacciones necesarias en el núcleo.
Hay muchos datos que nos indican que en el núcleo no solo hay cromatina. En estas imágenes observamos cómo se estudiaron los núcleos interfasicos, se cogieron diversos planos de observación viendo cómo se distribuía la histona H2B. La identificaron marcándola con un fluorocromo de color verde para ver que región del núcleo quedaba teñida. Así los cr quedaban teñidos y lo que no era cr no quedaba teñido.
En la imagen apreciamos que lo que presenta un color blanco es cr y lo más oscuro no. las dos regiones circulares son los nucléolos donde hay RNA ribosómico. A partir de aquí se quiso detectar que eran las siguientes regiones oscuras.
Al estudiarlo vieron que parte de esas regiones oscuras era o correspondian al factor de splicing 30 que madura el DNA. Se observó que esta por todo el núcleo en diferentes regiones.
Posteriormente superpusieron ambas imágenes y así se confirmó que las regiones sin cromatinas es donde encontramos los factores de splicing.
En conjunto vemos que existen compartimientos para cr y otros para todas las funciones básicas que se dan en el núcleo (transcripción, traducción, maduración y reparación).
Modelo CT/IC En el 2001 se propuso el modelo CT/IC que lo que hace es explicar cómo se distribuyen los cr y cuáles son los factores que lo regulan y que recogen toda la información que hemos visto anteriormente. Este modelo afirma que en su conjunto el núcleo se organiza como territorios porosos especializados en contener o almacenar cr, regiones donde se da al replicación de estos y regiones de splicing entre otras. Se trata de una organización mucho más lógica y coherente que las que afirmaban que todo se encontraba disperso.
Este modelo nos dice que en si es dinámico y que solo se puede explicar si los territorios tienen capacidad de movimiento y no son estáticos. Ya que un gen se puede expresar en un momento u otro y cada dominio de cara cr debe tener capacidad de movimiento para exponer o expresar dichos genes.
Un experimento posterior que profundizaba más en este modelo CT/IT (Chromosome Territories / Interchromatin Compartment) muestra el dinamismo de los cr y la forma en que exponen los genes. Utilizando determinadas drogas sobre cultivos celulares que provocan la una expresión mayor o menor de determinados genes se observó que los genes A, B y C presentaban regiones diferentes. Al añadir la droga determinada para activar el gen A y C e inactivar el gen B.
Al analizar y mirar al microscopio lo que observaron es que en el momento inicial cada gen está en su territorio pero al avanzar el efecto de la droga cada gen sale de su territorio y se desplaza a regiones del núcleo que seguramente serán especializadas en su expresión y transcripción; en cambio el gen B inactivado se ve que se dirige más a regiones cercanas a la membrana nuclear.
Este gen B se dirige a otra zona para que no se exprese porque en su territorio habitual se podría expresar a un nivel muy bajo por eso se desplaza a otra región cercana a la membrana nuclear.
...