Virologia Tema 10 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Virologia
Año del apunte 2015
Páginas 7
Fecha de subida 13/03/2015
Descargas 26

Vista previa del texto

1 TEMA 1 –NATURALESA I MULTIPLICACIÓ DELS VIRUS 2 TEMA 2 –HISTÒRIA DE LA VIROLOGIA.
3 4 5 6 7 8 9 10 TEMA 10 –GENOMA VÍRIC 10.1 SISTEMA DE CLASSIFICACIÓ DE BALTIMORE.
El punt de partida del tema és el sistema de classificació de Baltimore. D’una manera esquemàtica ens representa els diferents tipus de genomes vírics i assenyala l’estratègia de cada genoma per aconseguir, en últim terme, fer RNAm. Distingim 7 tipus de genomes vírics: I DNAds –la cadena negativa del DNA servirà de motlle per fer l’RNAm (positiu). Com les nostres cèl·lules.
II DNAss –la cadena simple (+) fa la seva cadena complementària (-) i a partir d’aquesta es farà l’RNAm.
Atenció: la polaritat de la cadena pot variar. Pertanyen a aquest grup els virus TT.
III RNAds –en aquest cas la cadena negativa de l’RNAm servirà de motlle per a la síntesi de l’RNAm. Pertanyen a aquest grup els rotavirus.
IV RNAss(+) –segons el tipus de virus trobem dues estratègies. En alguns, el genoma es comporta com un RNAm eucariota, té cap, té poli-A, i els ribosomes el poden reconèixer i traduïr. En alguns altres, l’RNAss(+) fa una cadena complementària (-) i aquesta serveix de motlle per a l’RNAm. Els coronavirus tenen un codó d’STOP, però en general tots els RNAm vírics es tradueixen sencers. El poliovirus (picornaviridae) o enterovirus C humà pertany a aquest grup.
V RNAss(-) –serveix directament com a motlle per a la síntesi d’RNAm. Pertanyen a aquest grup el virus de la grip i l’ebola.
VI RNAss(+) amb intermediari de DNA* –utilitzen la transcriptasa reversa per passar l’RNA(+) a DNA de cadena simple (-) i a partir d’aquest sintetitzar la complementària i tenir un genoma de DNA bicatenari. D’aquest DNA es transcriurà la cadena negativa i produïrà l’RNAm codificant. Una part de la població d’aquest RNA anirà a la càpsida un cop formada per integrar el genoma del nou virió. El virus de la sida és un exemple representatiu.
VII DNAds “gapped” o amb forats* – consisteix en un DNAds que és transcrit a RNAm, i aquest serveix, amb ajut de la transcriptasa inversa, per a la síntesi d’un DNA de polaritat negativa. El DNA de polaritat negativa es complementarà amb la seva positiva i deixarà la cadena negativa fragmentada, incompleta. Exemple: virus de l’hepatitis B.
Nota 1: els virus marcats amb un asterisc indiquen que utilitzen la RT, són complexos i els veurem al final de tot.
Nota 2: Tot i que considerem la polaritat de l’RNAm positiva, no tots els RNAss(+) són RNAm. Per exemple, són aquells que no tenen cap o cua de poli-A i no poden ser traduïts.
10.2 DIVERSITAT DEL GENOMA VÍRIC.
Físicament, el genoma víric pot adoptar moltes formes diverses. Pot ser lineal, circular, sencer, fragmentat, etc. Atenció: genoma segmentat no significa que estigui partit o dividit. En el genoma segmentat, tots els fragments estan inclosos dins de la partícula vírica. En els virus amb el genoma partit (com és el cas d’alguns virus que infecten plantes), diferents fragments del mateix van a parar a dins de partícules víriques diferents.
Per infectar, per tant, hi ha d’haver totes les partícules víriques al mateix lloc i al mateix temps perquè sinó no es té el genoma complet. Altres casos de rareses estructurals en el genoma són els genomes “gapped”( incomplets o amb forats), àcids nucleics amb proteïnes unides, híbrids de DNA i RNA units per complementarietat de bases, híbrids de DNA i RNA units covalentment, etc.
Generalitzant, podem dir que el genoma d’un virus DNA és més gran que el genoma d’un virus RNA. Això és així perquè, com hem dit abans, el DNA té “proof reading” i pot autoreparar els errors que es produeixen durant el procés de replicació.
El motiu d’aquesta diversitat és desconegut. Es creu que les primeres formes incials de vida eren RNA, que va evolucionar a DNA perquè aquest representa un avantatge evolutiu molt important: incorpora un sistema de reparació d’errors en el procés de replicació, de manera que no s’acumulen tantes mutacions i el material genètic és més estable. Però l’RNA, pel fet de poder acumular tantes mutacions, ajudava als organismes (en aquell cas virus molt primitius) que el posseïen a evolucionar molt ràpid i tenir una alta probabilitat de que el canvi incorporat fos favorable i els ajudés a adaptar-se millor als canvis de l’entorn.
En quant a la mida dels genomes també trobem una gran varietat: podem trobar diferències de l’ordre de 100 entre la mida en parells de bases de diferents genomes de virus. La pregunta que ens plantegem és: per què hi ha virus que tenen tant de material genètic, si per replicar-se se’n necessiten molt pocs? A més, els virus més complexos no són els que tenen més quantitat de parells de bases.
També trobem virus satèl·lit, que necessiten co-infectar altres virus per replicar-se (per exemple els virus adenoassociats, que necessiten infectar adenovirus per a multiplicar-se). N’és un exemple el virus de l’hepatitis D, que ha de coinfectar amb el virus de l’hepatitis B.
A un virus li interessa tenir el major nombre d’informació genètica compactada en el menor espai possible.
Una optimització de l’espai s’aconsegueix amb l’ús de varis marcs de lectura. Per exemple, el virus de la sida té 10.000 nucleòtids, i només 3 gens que fonamentalment codifiquen per proteïnes estructurals (gag), proteïnes de replicació polimerases i enzims (pol) i proteïnes de membrana (env). Cadascun d’aquests gens codifica per una poliproteïna que més tard per proteases s’escindirà en proteïnes individuals. Cada ORF (marc de lectura o open reading frame) estarà llegint un gen diferent. Els virus VIH I i II es diferencien entre ells perquè cadascun utilitza un marc de lectura diferent. Altres exemples de complexitat mínima és el virus de l’hepatitis C, que té 7 gens a partir dels quals obtenim 3000 aminoàcids: no hi ha zones sense transcriure, tot s’aprofita! El virus de l’hepatitis B també és d’una senzillesa extrema. Conté un DNAds circular de 2,5kb, i diem que està “relaxat” perquè ambdues cadenes estan obertes. Quan no ho estan, es produeix un superenrotllament. Produeix 4 proteïnes a partir de l’ús de marcs de lectura diferents.
Un exemple de complexitat genòmica màxima és el bacteriòfag T4. Té un genoma DNAds i totes dues cadenes són codificants. En l’esquema, els gens que estan a la part exterior són gens estructurals (proteïnes de la càpsida, GP, etc); els de la part interior són gens no estructurals. Veiem que la majoria de gens estan agrupats topològicament per funcions (per exemple els gens que codifiquen per les proteïnes de la cua es transcriuen junts, estan molt a prop entre ells). Els adenovirus també utilitzen aquest mètode: són DNAds, i ambdues cadenes es transcriuen a RNAm.
El genoma víric, com ja sabem, conté gens no estructurals (enzims de replicació i control del cicle víric, moduladors de la resposta immunitària de l’hoste) i tambés estructurals per fer la càpsida. Però, què NO té el genoma víric? El genoma víric no codifica per a proteïnes que li permetin produïr més proteïnes, tampoc proteïnes essencials per a la síntesi proteica, i tampoc totes les proteïnes necessàries per produïr energia.
Tampoc proteïnes de membrana, ni centromers, ni telòmers. Una excepció són els mimivirus. Són molt grans, comparables a la mida d’un bacteri, i fan moltes proteïnes implicades en la síntesi de més proteïnes com per exemple citocroms. Va donar lloc a una gran discussió sobre si era considerat virus o no, i finalment va ser considerat com a tal i se li va establir una nova família anomenada “mimicking microbe”. Els humans tenim anticossos contra els mimivirus, però no s’ha demostrat que sigui patògen.
10.3 VIRUS DNA En el genoma víric DNA ds distingim els early genes, immediate early genes i late genes. S’anomenen en funció del temps que tarden a transcriure’s. Els early són no estructurals: factors de transcripció, regulació, etc. Els late genes són els que es transcriuen últim i codifiquen per a gens estructurals i proteïnes de la càpsida.
10.3.1 Virus DNA doble cadena Exemples de virus de DNAds són adenovirus (infeccions vàries en humans), herpesvirus, papillomavirus (berrugues), poliomaviridae, i poxviridae (virus de la verola humana). Tots aquests exemples causen patologies en humans.
Per multiplicar-se, la doble cadena s’obre, es sintetitzen les complementàries i s’obtenen múltiples còpies del genoma. L’RNAm es fa a partir de la cadena negativa del DNA. Alguns virus DNA poden utilitzar la maquinària de transcripció de la cèl·lula hoste i no cal que el portin en la seva càpsida.
Poliomaviridae (alerta! No confondre amb el virus de la poliomielitis, que són enterovirus C de la família picornaviridae i tenen RNA). Té el DNA circular. Necessita trasllat al nucli per a la seva replicació.
Papilloma virus. DNA circular. Codifica per a les seves pròpies polimerases però igualment necessita trasllat a nucli.
Poxviridae o virus de la verola humana. Codifica per les seves pròpies polimerases i no necessita trasllat a nucli perquè té la maquinària de replicació, ho fa al citosol.
Herpesvirus. Té una estratègia particular de multiplicació. És virus DNA i com a tal té immediate early, early i late genes. Els primers codifiquen per a proteïnes no estructurals i els últims per a proteïnes estructurals, com ja sabem. En aquesta família de virus, però, els anomenem de forma diferent (alfa, beta, gamma). El virus herpes entra a nucli i es transcriuran RNAm dels gens alfa (immediate early). Aquests gens, traduïts a proteïnes en el citoplasma, tornaran a entrar a nucli per controlar l’expressió d’altres gens vírics. Inhibirà la seva pròpia expressió i activarà la dels early genes. A poc a poc també activarà l’expressió dels late genes. Els beta genes (early genes) faran el mateix que els alfa i acabaran per activar l’expressió dels gens gamma o late. Amb aquest procés d’autoregulació no s’expressaran tots els gens alhora sinó de forma seqüencial i ordenada (es diu que la seva transcripció fa “ones”).
10.3.2 Virus DNA de cadena simple DNA ss. Pot ser de polaritat positiva (parvoviridae, causant de “la cinquena enfermetat”) o negativa (circoviridae, virus TT). És una cadena simple de DNA que és motlle de la complementària. De les dues, la negativa farà RNAm.
10.4 VIRUS RNA Els virus amb genoma RNA necessiten portar a la càpsida RNA polimerasa depenent d’RNA, doncs la cèl·lula hoste no en té. Aquestes polimerases serviran, a partir del motlle de RNA, fer missatgers i més còpies de genoma.
10.4.1 Virus RNA de doble cadena Com per exemple els reovirus i rotavirus. Els seus RNA són segmentats. La cadena negativa de RNA servirà de motlle per fer la +: aquesta pot servir de RNAm o bé per fer d’intermediari per a fer cadena complementària i fer més còpies del genoma.
10.4.2 Virus RNA cadena simple polaritat positiva+ Com per exemple els virus de la família picornaviridae, entre els quals hi ha el virus de la polio o enterovirus C humana. Causa la malaltia de la poliomilelitis. Dins d’aquest grup també hi ha els Rhinovirus, causants del refredat comú, Calicivuridae i Astroviridae causen gastroenteritis, Coronavirus. Arteriviridae i flaviviridae fan hepatitis C i febre groga. Togaviridae produeix rubèola.
Els RNA d’aquests virus són com RNAm, amb un cap i un poliA. Els picornavirus no tenen el cap, sinó un IRES (internal ribosomal entry site, que és equivalent al cap).
La seva estratègia de replicació consisteix en que la cadena positiva serveixi alhora de RNAm i de motlle per a la negativa, que serà l’intermediari per resintetitzar la cadena positiva. Els coronavirus utilitzen una estratègia diferent.
Exemple de traducció en picornavirus. L’RNAm és reconegut pels ribosomes i fan una poliproteïna gegant, que serà escindirà de forma seqüencial i ordenada per proteases endògenes i exògenes. La proteïna es tallarà en tres blocs, cadascun d’aquests serà tallat en blocs més petits, que ja seran les proteïnes que faran la funció que els pertoca. Els talls en la cadena es produeixen de forma espontània, per la pròpia seqüència (cis) i també poden ser produïts per proteases (trans).
Exemple de la replicació de coronavirus. Entren a la cèl·lula, i el seu genoma queda nu al citoplasma. El primer qu fa és traduïr-se, però sols un trosset petit del genoma que codificarà per a la RNA polimerasa. Amb aquesta sintetitzarem la cadena complementària negativa de l’RNA. La cadena negativa servirà d’intermediari de replicació o bé també pot servir de motlle perquè a partir de transcripcions parcials es faci RNAm. A partir d’aquest es farà la traducció.
10.4.3 Virus RNA de cadena simple amb polaritat negativa.
Els paramixovirus són causants de malalties humanes com el xarrampió o les galteres. Rhabdoviridae és el virus de la ràbia: té l’aspecte característic d’una bala. El filoviridae tenen forma de fil, alguns d’ells són tan importants com el virus de l’Ebola o la febre de Marburg (febres hemorràgiques). Els ortomixovirus són els virus de la grip.
Dins d’aquest gènere, hi ha dos tipus: els de genoma segmentat i els de genoma no segmentat. El virus de la grup (orthomixovirus), per exemple, és segmentat; dins del no segmentat hi trobem rhabdoviridae i paramixoviridae.
Exemple de Rhabdoviridae. L’estratègia de replicació consisteix en què l’RNA- replica a una cadena de RNA+ que servirà alhora de RNAm i de motlle per a fer altre cop una còpia de la negativa. Per això els virus RNAss() necessiten portar la RNApol a la càpsida. Primer la cadena RNA(-) donarà a varis RNAm que codificaran per proteïnes, entre elles la proteïna N. La proteïna N farà que quan l’RNA(-) s’uneixi a la maquinària transcripcional, fent que la RNApol vírica faci la cadena complementària RNA+ sencera que serà intermediari replicatiu.
Exemple del virus de la grip. El virus de la grip també és RNAss (-). Com ja sabem, els virus RNA necessiten una RNA polimerasa depenent de RNA. El virus de la grip és una excepció: va a nucli i n’aprofita la maquinària.
Els segments de RNA+ complementaris que farà serviran de motlle per a fer RNAm, que sortiran al citoplasma, i d’altres seran utilitzats com a intermediaris de replicació per donar lloc a més cadenes negatives. El virus de la grip té 8 segments, cadascun d’ells dóna lloc a un RNAm que dóna en últim terme una proteïna o vàries, si hi ha splicing alternatiu.
Què passa quan dos virus de genoma segmentat (com per exemple el virus de la grip) de diferents variants infecten una mateixa cèl·lula? Doncs que pot produïr-se l’anomenat “antigenic shift”. Ambdós virus entraran a la cèl·lula, es replicaran, faran les seves proteïnes, i aleshores s’ensamblaran les càpsides. En el moment d’ensamblatge, però, poden barrejar-se vàries proteïnes de cada virus i donar lloc a una combinació antigènica diferent. Aquests virus provoquen pandèmies perquè al modificar tan ràpidament la seva estructura no dóna temps a generar vacunes ni fàrmacs eficients contra aquests. El que anomenem “antigenic drift” són petits canvis mutacionals que es van donant al llarg del temps i no produeixen canvis tan bruscos.
Els virus ambisense en general es col·loquen al grup de virus amb RNA de cadena negativa. Les famílies més comuns són els arenavirus i els bunyavirus. Els arenavirus tenen dos segments de genoma RNA de polaritat negativa. La cadena S té doble polaritat, és a dir, una zona és + i l’altra -. Quan el virus infecta l’hoste la part negativa servirà per fer de motlle per a fer RNA+. Aquesta cadena només farà dues proteïnes: una estructural i l’altra no, que venen codificades en la zona negativa. Es traduïrà primer la zona que codifica per a la proteïna N. Gràcies a ella es podrà sintetitzar una còpia d’aquesta cadena, ja que és com una RNApolimerasa depenent de RNA. Aleshores tindrem un RNA amb la polaritat invertida: la part negativa ara codificarà per fer RNAm d’una proteïna estructural, i a partir d’aquesta es farà la càpside on s’hi encabiran les còpies de genoma que hem produït.
10.4.4 RNA doble cadena positiu amb intermediari de DNA o Retrovirus.
Utilitzen la transcriptasa inversa. Els virus de la família retrooviridae funcionen així, i pertanyen a ella patògens humans com HTLV i VIH. Són RNA de polaritat positiva que no es tradueixen. Amb la transcriptasa inversa generen a partir d’aquest RNA la complementària de DNA negativa. A partir d’aquesta, la mateixa transcriptasa inversa farà de polimerasa i sintetitzarà la cadene complementària. Aquest DNA de doble cadena, per una banda, farà RNAm que es traduïrà i farà proteïines i per altra banda produïrà nous genomes, que s’encapsidaran a dins de la partícula vírica.
Exemple del virus de la sida. El VIH entra a la cèl·lula hoste (en verd, el genoma: dues còpies d’una cadena de RNA+: és diploide!). Dins de la partícula vírica hi ha la transcriptasa inversa i amb aquesta fa el DNA de doble cadena. Aquest fragment de genoma és el que anomenem provirus. Aquest provirus es circularitza, entra a nuclei i s’insereix en el genoma de la cèl·lula hoste. Llavors la cèl·lula el transcriurà com si fos un gen propi: tenim còpies senceres del genoma que sortiran a citoplasma i entraran a la partícula vírica. En funció de l’ORF que s’hagi utilitzat (n’hi ha 3) tindrem un RNA missatger diferent que codificarà per a diferents proteïnes. En concret són poliproteïnes que després es fragmentaran.
Es creu que els virus de VIH són més resistents als rajos UV perquè tenen dues còpies del genoma, i pot haver-hi recombinació entre les dues cadenes de RNA si es donés el cas que hi hagués una mutació. Amb això puc obtenir un híbrid de les dues cadenes i puc transcriure sense problemes.
10.4.5 Virus amb genoma de doble cadena de DNA incompleta.
L’exemple més representatiu és el virus de la hepatitis B i forma part de la família dels hepadnaviridae. És un DNA circular relaxat, perquè les dues cadenes estan obertes. La seva estratègia per fer RNAm consisteix, en primer lloc, completar la seva doble cadena de DNA. La cadena negativa farà RNAm que es traduïrà a proteïnes.
La replicació, en lloc de ser semiconservativa, consistirà en fer un RNA+ que servirà d’intermediari de replicació. Actuarà sobre aquest la RT i així obtindrem DNA de doble cadena a punt per encapsidar.
Exemple de la hepatitis B. El virus de la hepatitis B porta la seva pròpia polimerasa (RNApol i DNApol, és un complex enzimàtic que fa moltes funcions) que també fa la funció de transcriptasa inversa. El virus entrarà a la cèl·lula, i el genoma DNA incomplet entrarà dins de nucli. Un cop dins, la polimerasa completarà la cadena de DNA superenrotllat que ja està tancada. Aquest no s’integrarà al genoma hoste, i és anomenat “pregenoma”. Aquest s’integrarà dins de la càpsida vírica, juntament amb la polimerasa. Abans de sortir a l’exterior, la polimerasa farà el genoma madur del virus.
10.5 INFECTIVITAT I EXPERIMENTS DE GENÈTICA REVERSA.
A la taula que tenim del genoma RNA tenim representada l’estratègia per fer RNAm i sintetitzar proteïnes o poliproteïnes. També tenim en una columna representada la infectivitat del virus. Entenem com a primera part del procés infectiu el fet que l’RNAm es tradueixi. Si agafem el genoma d’un virus infectiu completament nu i els transfectem directament a una cèl·lula hoste, aquesta donaria lloc a gran nombre de partícules víriques. Aquests virus, per tant, no necessiten portar la seva polimerasa ni codificada al genoma ni físicament a la càpsida. Un exemple és el picornavirus.
Amb els virus infectius, si transfecto la cèl·lula amb el genoma RNA nu es traduïrà. Si ho faig amb el DNAc també passarà el mateix. Si al DNAc in vitro faig una transcripció i llavors a partir d’aquest RNA infecto les cèl·lules també obtindré en últim terme partícules víriques (és el que anomenem clons infecciosos).
Com hem de procedir si volem saber la funció d’un gen en un virus (genètica reversa)? Agafo el genoma, faig el DNAc, muto el gen, n’obtinc l’RNA+, transfecto una cèl·lula hoste i miro què li passa en absència o canvi d’aquest gen. No transfectem amb DNAc directament, ens interessa tenir-lo en la forma més salvatge possible.
En el cas de l’RNA- no és així; no és infectiu. Primer s’ha de transcriure i necessiten una DNApol depenent de RNA. Quan transfectem amb un genoma RNA-, ambisense, retrovirus o RNAds nu no es produïran partícules víriques. Necessiten a la seva càpside la polimerasa. En el cas de l’RNAambisense, la proteïna N intervé en la replicació però necessita una DNApol depenent de RNA per acabar de completar el procés. El genoma dels retorvirus no és infectiu i necessita transcriptasa reversa. Però l’intermediari replicatiu DNAds sí que ho és: si transfectem l’hoste aleshores sí que obtindrem partícules víriques. Quan volem fer experiments de mutagènesi amb aquests tipus de virus, cotransfectem el genoma amb la mutació col·locada juntament amb la RNApol que necessita.
10.6 GENOMA DEFECTIU.
Quan es recuperen virus post-infecció pot ser que hi hagi un virió al qual li falti un tros de genoma. És comú en virus RNA, doncs fan molts errors. Si ens trobem amb un cultiu amb una MOI alta, varis virus infectaran una mateixa cèl·lula. Aleshores aquesta produïrà virus amb genoma normal i virus amb genoma defectiu. El primer farà de “helper” i a partir d’ell es sintetitzaran les partícules per fer la càpsida i encabir-hi qualsevol dels dos tipus de genoma.
...