Biología molecular (2011)

Apunte Español
Universidad Universidad de Alcalá (UAH)
Grado Biología Sanitaria - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2011
Páginas 108
Fecha de subida 27/10/2015
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1. ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
2. REPLICACIÓN DEL DNA
3. RECOMBINACIÓN
4. PAPEL DEL RNA
5. TRANSCRIPCIÓN
6. PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES
7. TRANSPORTE Y LOCALIZACIÓN DE MENSAJEROS
8. tRNA y aa-tRNA SINTETASAS
9. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE RIBOSOMAS
10. TRADUCCIÓN
11. ELONGACIÓN Y TERMINACIÓN ALTERNATIVA
12. VIDA MEDIA Y DEGRADACIÓN DE mRNA
13. PLEGAMIENTO, MODIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN
DE PROTEÍNAS
14. MODIFICACIONES COTRADUCCIONALES Y
POSTRADUCCIONALES

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BIOLOGÍA MOLECULAR 1. ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 2. REPLICACIÓN DEL DNA 3. RECOMBINACIÓN 4. PAPEL DEL RNA 5. TRANSCRIPCIÓN 6. PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES 7. TRANSPORTE Y LOCALIZACIÓN DE MENSAJEROS 8. tRNA y aa-tRNA SINTETASAS 9. ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE RIBOSOMAS 10.
TRADUCCIÓN 11.
ELONGACIÓN Y TERMINACIÓN ALTERNATIVA 12.
VIDA MEDIA Y DEGRADACIÓN DE mRNA 13.
PLEGAMIENTO, MODIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNAS 14.
MODIFICACIONES COTRADUCCIONALES Y POSTRADUCCIONALES ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos son polímeros de unidades nucleotídicas conectados con enlaces covalentes (fosfodiester). Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales en cantidades similares:  Azúcar, en concreto una pentosa. En el caso del ADN es la 2-desoxi-Dribosa y en el caso del ARN es la D-ribosa.
 Ácido fosfórico.
 Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas. Las pirimidínicas derivan de la pirimidina contienen dos átomos de nitrógeno y constituyen un anillo heterocíclico plano; las purinas se forman por la unión de una pirimidina con un imidazol y constituyen un anillo no del todo plano. Las bases púricas son la adenina y la guanina. Las bases pirimidínicas son la timina, citosina y uracilo.
Ambos tipos de bases son insolubles en agua (carácter aromático). Debido a la presencia de dobles enlaces las bases nitrogenadas dan espectros de absorción características en ultravioleta.
La unión de la base nitrogenada a la pentosa se realiza a través del carbono 1’ de la pentosa y los nitrógenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosídico. La unión del nucleósido con el ácido fosfórico se realiza a través de un enlace de tipo éster entre el grupo OH del carbono 5’ de la pentosa y el ácido fosfórico. Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de polinucleótidos. Los nucleótidos se unen entre sí mediante enlaces fosfodiéster en las posiciones 3’ del carbono de un nucleótido y el 5’ del siguiente para formar largas cadenas de polinuclóetidos.
Los ácidos nucleicos presentan papeles biológicos muy diferentes.
El ADN es el componente primario de los cromosomas y es el portador del mensaje genético. El ARN es el producto de la transcripción del mensaje genético presente en el DNA; también el material hereditario en algunos casos. Las proteínas ejecutaran las acciones codificadas en los ácidos nucleicos.
NIVELES ESTRUCTURALES La estructura primaria viene determinada por el orden del polímero lineal formado por la unión de numerosos nucleótidos mediante enlaces fosfodiester. Es similar en ADN y ARN. La estructura secundaria es la disposición espacial relativa de los nucleótidos que se encuentran próximos en la secuencia. Las estructuras de orden superior son aquellas producidas por el superenrrollamiento y asociación con proteínas básicas o por el plegamiento tridimensional.
Estructura primaria Presenta unidireccionalidad (extremo 3’ y 5’). Los residuos de azúcar unidos mediante enlace fosfodiester constituyen el esqueleto flexible de la molécula. No contiene información, pues sólo reside en la heterogeneidad de las bases. Estas se unen al C1’ por enlaces glucosídicos. Pueden llegar a girar.
Las propiedades que presentan en solución a pH fisiológico: - Son moléculas hidrofílicas; se comportan como ácidos polianiónicos ya que los grupos fosfatos se encuentra ionizados.
- El ADN genómico se encuentra generalmente estabilizado gracias a su interacción con proteínas cargadas positivamente (histonas, poliaminas,…).
- Las soluciones de ADN son viscosas debido a la relativa rigidez de la molécula.
El DNA es químicamente muy estable gracias a la falta de grupos hidroxilo libres; el RNA es más reactivo.
Propiedades físicoquimicas Hidrólisis Absorción en ultravioleta La ƛ de absorción de los ácidos nucleicos es 260 nm, frente a los 280 nm de proteínas.
Estructura secundaria Chargaff demostró que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguían algunas reglas. Estas reglas se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hélice y son las siguientes:  La composición de las bases no cambia con la edad, estado nutricional ni el ambiente  La proporción de adenina es igual a la de timina. La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad.
A=T   A/T = 1 La proporción de guanina es igual a la de Citosina. G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad.
G=C  G/C = 1  La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad.
(A+G) = (T+C)   (A+G) / (T+C) = 1 Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido: existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas.
Para establecer la estructura secundaria también fue útil el estudio por difracción de rayos X del ADN (M. Wilkins y R. Flanklin).
 Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4 Å. Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje.
 El diámetro del polinucleótido es de 20 Å y está enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 Å se produce una vuelta completa de la hélice.
 Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente.
Fueron Watson y Crick los que elaboraron el modelo de doble hélice.
 La molécula de ADN está compuesta por dos cadenas polinucleotídicas enrolladas en forma de hélice dextrógira, alrededor de un mismo eje, constituyendo una doble hélice. Presentan un enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas como si fuera un sacacorchos.
 El esqueleto de uniones azúcar-fosfato está localizado en el exterior de la molécula con las bases proyectadas hacia el centro, ocupando planos perpendiculares. Las bases pueden girar sobre el enlace glucosídico (conformación anti y syn).
 El diámetro de la doble hélice es de 20 Å.
 La complementariedad de bases entre las dos cadenas es la siguiente: A con T y G con C, unidos por dos y tres puentes de hidrógeno respectivamente.
 Las dos cadenas tienen polaridad opuesta, es decir, son antipolares: una va en dirección 3’OH y la otra de 5’P a 3’OH.
 La doble hélice da una vuelta completa cada 34Å que equivale a 10,5 pares de nucleótidos, por tanto cada par de bases están separadas 3,4Å.
 No hay ninguna restricción en la secuencia de bases de una cadena. Sin embargo, una vez que se especifica la secuencia de bases de una cadena, la secuencia de bases de la cadena complementaria queda determinada automáticamente.
 Se distinguen varias fuerzas: puentes de hidrógeno entre bases de distinta cadena, fuerzas hidrofóbicas entre las bases de la misma cadena y las interacciones con el agua.
- Se distinguen un surco menor y un surco mayor como consecuencia de la geometría de las bases. Son zonas de interacción con proteínas las cuales reconocen esta secuencia. Estas proteínas serán importantes en procesos de regulación.
- Es un polianíon a pH fisiológico. Los residuos P están ionizados a pH fisiológico.
La estructura de Watson y Crick se conoce también como forma DNA B. Hay diferentes conformaciones:  El ADN-A es también una doble hélice dextrógira más corta y ancha y se da en condiciones de baja humedad. Tiene un mayor número de bases por vuelta (11). El plano de las bases es más oblicuo. La encontramos en ARN de doble hélice o ADN-ARN. No está claro si el DNA se dispone así in vivo.
 El ADN-Z es una doble hélice levógira alargado y fino. Tiene determinadas regiones ricas en G-C-G-C…. Participa en la regulación de la expresión génica y la recombinación.
Las variantes en la estructura secundaria se forman como consecuencia en la presencia de palíndromos (secuencias repetidas de secuencia de DNA). Estas repeticiones tienen el potencial de formar estructuras conocidas como estructuras cruciformes. El apareamiento de las bases ha de ser intracatenario. Estas estructuras no son tan estables como el DNA duplexo debido a los bucles formados por las regiones no apareantes. Sirven como sitios de reconocimiento para proteínas específicas de unión a DNA, relacionadas también con la regulación de la expresión génica; también son zonas diana para enzimas de restricción.
Otra variante es el DNA tríplex o H-DNA. Es poco habitual cuando hay secuencias en el DNA ricas en (C-T)n y (AG)n. Presentan enlaces atípicos ya que implican átomos diferentes a los clásicos de Watson y Crick entre átomos de nitrógeno N7 y N1. Participa en la regulación de la expresión génica. Se están desarrollando oligonucleótidos sintéticos para impedir la expresión génica.
Desnaturalización y renaturalización La desnaturalización implica la rotura de la doble hélice. Esto sucede cuando varía de forma brusca el pH, cuando varía la fuerza iónica, por la presencia de agentes desnaturalizantes o la temperatura.
x pH: por encima de 10 o debajo de 2,3 provocan o una desprotonización o una protonización excesiva destruyendo los puentes de hidrógeno.
x Agentes desnaturalizantes: Que haya solutos pequeños en el medio que formen puentes de hidrógeno con las bases. A muy alta concentración pueden competir con los pares de bases. Ej.: formamida y urea.
x Temperatura: por encima de 80º aunque depende de la composición propia de hélice.
x Fuerza iónica: a menor fuerza iónica menor temperatura de fusión. Los iones suprimen la repulsión electrostática entre los grupos P cargados negativamente. Estabilizan la hélice.
*Efecto hipercrómico: aumento relativo de la absorbancia a 260nm en un 40% cuando el ADN se encuentra desnaturalizado.Esto se debe a que las bases están expuestas al exterior.
Una vez restauradas todas las condiciones se puede producir la renaturalización.
Esta es más rápida si las dos hebras no se separaron del todo al desnaturalizarse; si se separaron del todo el proceso más lento.
Estructuras superiores Las estructuras superiores vienen dadas por el superenrrollamiento de las cadenas sobre sí mismas. Estos superenrrollamientos pueden presentar o no ramificaciones.
En el ARN las estructuras superiores son tridimensionalmente variadas. En ambos casos, la condensación se completa asociándose a proteínas.
El significado biológico del superenrrollamiento permite que dos zonas lejanas en el DNA se aproximen y facilita la compactación del DNA.
Una molécula con la misma secuencia puede estar en estado relajado o en diferentes estados de enrollamiento. La conformación de DNA circular cerrado se considera una forma relajada.
Como consecuencia del cierre de la molécula, las hebras ya no se pueden separar y decimos que tienen un número de enlace, índice topológico o linking number. Este número determina el número de veces que las hebras se entrecruzan. Cuando L>0 se dice que hay un enlace topológico.
Este índice varía cuando participan las topoisomerasas (cuando se separan hebras), que pueden actuar disminuyendo o aumentando en 1 el número de vueltas. En ambos casos obtenemos unas estructuras tensas. Estas tensiones se liberan con los superenrrollamientos. De esta forma aparecen dos topoisómeros.
Las formas relajada y tensa pueden separar o aislar por ultracentrifugación o electroforesis (sedimentan o migran más rápidamente). Encontraremos DNA con diferente numero de enlace por la acción de la topoisomerasa I (Da lugar a topoisomeros diferentes en incrementos de uno).
Sobre la doble hélice podemos obtener: - Infraenrrollameinto: girando a la derecha - Sobreenrrollamiento: hacia la izquierda. Aumenta la torsión.
Cuando se produce sobreenrrollamiento aumenta el número de vueltas (nº bases por vuelta disminuye). Esta conformación tiene una tensión estructural que se libera girando sobre sí misma hacia la izquierda tendiendo a la situación original. Si se produce un infraenrrollamiento, disminuye el número de vueltas (aumenta el número de bases por vuelta). Esta conformación tiene una tensión estructural que tiene que ser liberada girando sobre sí misma hacia la derecha.
W o retorcimiento es el número de vueltas superhelicoidales.
T o torsión es el número de vueltas de hélice que tiene la molécula completa.
L= T + W Las topoisomerasas catalizan los cambios en el número de enlace (cambian el estado topológico del DNA). Son importantes en la replicación de DNA. Según su modo de acción se clasifican en dos grupos: - Tipo I: escinde una hebra de DNA rompiendo el enlace fosfodiester.
Engloba una de las hebras; la hebra intacta pasa a través del corte y se ligan los extremos de la hebra rota.
- Tipo II: escinde las dos hebras. Deshace dos vueltas y las vuelve a sellar.
Algunos antibióticos o agentes quimioterapéuticos inhiben las topoisomerasas. Ej.: doxorrubicina, agente antitumoral que inhibe la topoisomerasa II en eucariotas.
REPLICACIÓN DEL DNA La replicación es el proceso que consiste en hacer una copia de la molécula de ADN para conservar la información genética de generación en generación. La molécula de ADN está formada por dos cadenas complementarias. Los nucleótidos están unidos a través de las bases nitrogenadas por puentes de hidrógeno (dos entre A-T y tres entre G-C). Esta cadenas son antipararelas: en un extremo una cadena tiene 3OH y en el otro un 5P y la otra al revés. El DNA se duplica una sola vez en cada ciclo celular en la fase S. En eucariotas tarda de 6-8 horas, y en E. coli 45 min.
Para explicar este proceso se propusieron tres hipótesis:  Hipótesis semiconservativa: formulada por Watson y Crick. Esta replicación consiste en la separación de las dos hebras, cada una de las cuales sirve de molde para formar las nuevas hebras. En las hebras hijas se conserva una de las cadenas parentales y otra es de nueva síntesis. Así, obtenemos dos moléculas iguales entre sí y a la molécula de partida. En 1957, experimentos realizados por Meselson y Stahl confirmaron esta hipótesis.
 Hipótesis conservativa: tras la duplicación quedan dos hebras antiguas y dos hebras nuevas formando una doble hélice.
 Hipótesis dispersiva: se propone que las hebras están formadas por fragmentos distintos de ADN antiguo y ADN recién sintetizado.
Semiconservativa Conservativa Dispersiva Experimento de Meselson y Stahl Cultivaron bacterias (E.coli) en un medio con nitrógeno pesado (N15) como fuente de nitrógeno durante varias generaciones (1415). De esta forma las bacterias tenían un ADN que pesaba más que las bacterias crecidas en un medio con N14. Esto permitía separar por centrifugación isopícnica las moléculas de ADN pesadas de las ligeras. El experimento consistió en pasar bacterias cultivadas en N15 a un medio con N14 durante el tiempo de duplicación de las bacterias. Tras una replicación, se extrajo una alícuota y se centrifugó: el resultado fue una banda menos densa que la que salía en las de N15. Tras una segunda replicación, se extrae una alícuota y se centrifuga: se observa una banda igual que la anterior y otra aún menos densa. Al hacer esto una tercera vez, se observan dos bandas igual en la misma posición que en el anterior pero con la más cercana al borde del tubo en una proporción 3:1. Esto sugirió que eran moléculas híbridas, lo que descartaba la hipótesis conservativa. Si se dejaba que se dividieran más veces, la proporción de ADN híbrido disminuía, lo que descartaba la hipótesis dispersiva y confirmaba la hipótesis semiconservativa.
Características:  La replicación es semiconservativa.
 Comienza en secuencias denominadas orígenes de replicación. El origen es unifocal en procariotas y multifocal en eucariotas.
 Es bidireccional en eucariotas y procariotas: a partir del origen de replicación se sintetizan cadenas hacia los dos lados. La replicación es unidireccional en DNA mitocondrial, cromosoma bacteriano y algunos plásmidos.
 La elongación se produce en dirección 5’3’.
 Las cadenas de nucleótidos nuevas son complementarias y antiparalelas a sus cadenas molde.
 La replicación es semidiscontinua.
El proceso de replicación es un proceso de polimerización llevado a cabo por las ADN polimerasas. La molécula de ADN duplexo se separa en sus dos cadenas, y las ADN polimerasas van leyendo las cadenas molde en sentido 3’5’ mientras que se va sintetizando la cadena en sentido 5’P3’OH. Se van añadiendo desoxiribonucleósidos trifosfato complementarios. La copia de la hebra parental 3’5’ se sintetiza de forma continua y se denomina hebra conductora. La hebra parental 5’3’ se va a copiar de forma discontinua mediante fragmentos de 10002000 nucleótidos (fragmentos de Okazaki). Esta hebra se denomina hebra rezagada o retrasada. Una vez sintetizados se unen por acción de la DNA ligasa.
MAQUINARIA MOLECULAR La replicación no solo requiere de la acción de una DNApolimerasa sino que intervienen otras enzimas diferentes. Toda esta maquinaria necesaria recibe el nombre de sistema DNAreplicasa o replisoma. Entre ellas podemos encontrar: ADN helicasas: se desplazan a lo largo del DNA rompiendo los puentes de hidrógeno entre las dos hebras complementarias y separándolas para que sirvan de molde. La apertura o desenrollamiento de la doble hélice en el sitio de origen de la replicación depende de la hidrolisis de ATP. Al romper los puentes de hidrogeno se produce un superenrrollamiento negativo que provoca una tensión topológica.
En E.coli es la DnaB; en eucariotas el complejo MCM.
Proteínas de unión a cadenas simples (SSB): se unen a las cadenas simplexas. Las protegen y evitan que se produzcan estructuras secundarias. Permite que se mantengan separadas ambas hebras y se inicie la formación de la horquilla de replicación.
SSB en E. coli y RPA en eucariotas.
Topoisomerasas: relajan la tensión topológica que ha sido creada por la acción de las helicasas. Las topoisomerasas cortan la hebra variando el número de enlace.
ARN polimerasa: sintetizan fragmentos pequeños y cortos de ARN que actúan de cebadores de la reacción de polimerización. Estos son fragmentos RNA de 1-60 nucleótidos complementarios al DNA molde.
En el caso de E.coli es DnaG y en eucariotas las primasas junto con la subunidad α de la DNApol. En E. coli sintetizan 1 cebador por segundo.
ADN polimerasas: añaden nucleótidos en dirección 5’3’ a una cadena ya empezada. La cadena molde determina el orden de incorporación de los nucleótidos.
Es necesario un grupo –OH libre, que lo aporta el cebador. Los sustratos son los dNTPs y el cofactor magnesio. La polimerasa cataliza la formación de un enlace fosfodiester en una reacción irreversible (reacción endergónica y exergónica) acoplada a la hidrólisis de PPi.
La DNApol III es la encargada de la replicación y la I y II ejercen tareas auxiliares.
La actividad de la DNApol requiere una hebra desapareada que actúe como molde y una cadena cebadora que aporte el extremo –OH. Los nucleótidos entrantes irán siendo seleccionados por el apareamiento de bases. La incorporación es un ataque nucleofílico sobre el grupo α fosforilo del dNTP para formar un enlace fosfodiester y provocar la liberación de PPi.
La actividad exonucleasa 3’5’ la presentan todas las polimerasas (elimina nucleótidos en el extremo 3’); la actividad exonucleasa 5’3’ solo la presenta la polI (elimina nucleótidos en el extremo 5’). La DNApol III de E.coli presenta 10 tipos de subunidades. Las actividades de polimerización y de corrección de pruebas residen en las subunidades α y ε. Forma dímeros para la hebra retardada y la continua.
En E.coli DNApol I elimina los cebadores RNA y los reemplaza por DNA. Se queda una mella en la cadena azúcarP que será sellada por las enzimas DNAligasas.
En eucariotas encontramos DNApol α, ε, δ, β y ϒ.
Ligasas: empalma entre sí los distintos fragmentos de la hebra de crecimiento discontinuo. Es necesario AMP. En bacterias el AMP proviene del NAD (cofactor); en ciertos virus y eucariotas se utiliza ATP en lugar de NAD.
1. Adenilación de la ADNligasa. El grupo AMP transferido a un residuo de lisina de la enzima.
2. Activación del 5’P de la mella. En un segundo paso el grupo AMP es transferido al 5’P de la mella 3. Desplazamiento del AMP y sellado de la mella. En una tercera reacción el grupo 3’OH ataca el P desplazando AMP y formando un enlace fosfodiester para sellar la mella.
Comparación procariotas-eucariotas Proceso: La replicación comienza gracias a la acción de una enzima llamada primasa que cataliza la formación de un RNA cebador. La polIII inicia la síntesis de DNA en el extremo del cebador y prosigue en dirección 5’ 3'. Una hebra se sintetiza de manera continua pero la otra necesita de la creación de fragmentos de Okazaki.
Estos fragmentos en bacterias tienen una longitud de 1000-2000 nucleótidos; en eucariotas 150-200. Deberán unirse para formar una hebra continua. Para ello habrá que eliminar las cortas secuencias de RNA, reemplazarlas por DNA y unir los fragmentos.
La polimerasa I es la encargada de ir eliminando los nucleótidos del RNA cebador y reemplazarlos por DNA.
Los cebadores de la cadena retrasada se elimina con actividad exonucleasa 5’3’. Este hueco se rellena por la ADN polimerasa I (actividad polimerasa 5’3’) utiliza el extremo 3’ del fragmento de Okazaki contiguo. Posteriormente actúa la DNA-ligasa para unir los dos fragmentos de Okazaki en una sola hebra.
REPLICACIÓN EN E. coli Iniciación. El cromosoma circular de E. coli tiene un solo origen de replicación (oriC). La secuencia oriC es una secuencia de 200-300 pares de nucleótidos. Los tetrámeros y monómeros de proteína DnaA se unen a cada una de las repeticiones de 9 pares de bases en oriC formando una estructura similar a un nucleosoma. Esta unión tiene como resultado la separación de las dos cadenas de la doble hélice dentro de la disposición en tándem de repeticiones AT ubicadas en un extremo de la secuencia oriC. La proteína DnaB entra procedente del complejo DnaB-DnaC y con su actividad helicasa continua el desenrollamiento de la doble hélice y desplaza DnaA. Las proteínas SSB, en tetrámeros, se unen a las cadenas sencilla previniendo que se reanille el DNA.
Elongación. DnaB se mueve en dirección 5’3’ a lo largo de la hebra molde y va a hidrolizar 2ATP por cada par de bases separado. Para que progrese la horquilla de replicación es fundamental la interacción proteína-proteína entre DnaB y DNApol III.
Terminación. La replicación termina en el momento en que las horquillas se encuentran.
REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS La replicación de los cromosomas nucleares se produce en la fase S; en mitocondrias en cualquier momento. Al igual que en las bacterias en las células eucariotas hay diferentes tipos de DNApol (α, ε, δ, β y ϒ).
DNApol α. En la replicación de los cromosomas nucleares interviene la DNApol α en asociación con al DNApol δ. La DNApol α tiene cuatro subunidades, dos de las cuales tiene actividad primasa. Esta enzima es inadecuada para la síntesis fiel de DNA al carecer de actividad exonucleasa. Participa en la síntesis de cebadores RNA.
DNApol δ. Los cebadores crecen gracias a la DNApol δ. Esta DNApol presenta dos subunidades: una subunidad catalítica y una subunidad asociada al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA). Tiene además actividad correctora de pruebas y una alta procesividad.
DNApol ε. La función de la polimerasa ε no está muy clara. Además de ejercer tareas de reparación a veces sustituye a la DNApol δ.
DNApol ϒ. La DNApol ϒ se encarga de replicar el ADN mitocondrial.
Iniciación. Podemos distinguir varias fases: 1. Formación del complejo pre-RC. El complejo de reconocimiento del origen (ORC) es un complejo proteico de múltiples subunidades que se une a varias secuencias dentro de los orígenes de replicación. ORC interacciona y es regulado por diferentes proteínas implicadas en el control del ciclo celular.
Entre ellas tenemos: Cdc-6 y Cdt-1 que se unen al ORC permitiendo la entrada del complejo de mantenimiento de cromosoma (MCM). Este complejo es una helicasa en forma de anillo. La velocidad de la horquilla de replicación es 50 nucleótidos/seg.
2. Formación del complejo de iniciación activo. A la cadena sencilla se une la proteína A de replicación (RPA) que impide el reanillamiento. Se produce la síntesis de los cebadores asociada a la actividad primasa de DNApol α. La DNApol δ añade el resto de nucleótidos de la cadena.
Elongación. El factor de replicación C (RFC) elimina la DNApol α y ensambla el PCNA. La DNApol δ se unirá a PCNA añadiendo nucleótidos para la síntesis de la hebra nueva. La hebra retardada la síntesis de cebadores se produce por la DNApol α (10-20 nucleótidos) y posteriormente por la DNApol δ.
Terminación. La RNAasa H1 elimina los ribonucleótidos del cebador excepto uno. El complejo FEN1/RTH1 presenta actividad exonucleasa por lo que elimina este único ribonucleótido que quedaba. La mella es unida por la DNAligasa: une los fragmentos de Okazaki de la cadena de DNA añadiendo nuevos desoxiribonucleótidos.
RECOMBINACIÓN El término recombinación se utiliza para denominar cualquier proceso que implica rotura y reunión de polinucleótidos, es decir, intercambio físico de DNA. Es una forma de reorganizar el material genético.
Las funciones de la recombinación son: reparación, regulación de la expresión de genes, segregación ordenada de los cromosomas durante la división celular y mantenimiento de la diversidad genética.
Hay diferentes formas: - Recombinación homóloga o general. Se produce entre segmentos de moléculas de DNA que comparten homología de secuencia extensa. Se puede dar en diferentes cromosomas o en el mismo cromosoma. Es responsable del entrecruzamiento durante la meiosis y la reparación del DNA.
- Recombinación especifica del sitio. Se produce entre moléculas de DNA con regiones cortas de similitud de secuencia de 20-200pb. Es responsable de la inserción de genomas de fago en cromosomas bacterianos.
- Transposición. Transferencia de segmentos DNA de una posición del genoma a otra. No es un tipo de recombinación, sino un proceso en el cual se da recombinación.
RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Significado biológico En procariotas y eucariotas tiene como significado la reparación de varios tipos de lesiones.
A parte de la reparación del ADN la recombinación homóloga también es responsable del entrecruzamiento durante la meiosis (mejora diversidad genética).
En eucariotas además asegura la segregación ordenada de los cromosomas durante la meiosis. Una célula germinal premeiótica tiene dos copias de cada cromosoma, que son replicados durante la fase S. En la primera división meiótica cada cromosoma se alinea en el ecuador de la célula apareándose con su homólogo. La sinapsis permite la recombinación genética.
En la década de los 60-70 algunos investigadores como Holliday, Meselson y Radding explicaron algunos fenómenos donde intervenía la recombinación.
El modelo de rotura bicatenaria explica la recombinación homóloga.
1.
Las dos moléculas homólogas se alinean. La recombinación homóloga se inicia con un corte bicatenario. La exonucleasa recorta las cadenas cortadas de forma que quedan segmentos protuberantes.
2.
Uno de los segmentos invade la molécula de DNA homóloga y se crea una unión de Holliday. Esta puede migrar migrar a lo largo del heterodúplex si la cadena invasora es extendida por una DNA pol.
3.
Para completar el heteroduplex la otra cadena rota también se extiende.
4.
La ligasa une los hiatos. En este punto el heteroduplex presenta dos uniones de Holliday.
5.
Se escinden las uniones de Holliday y dependiendo donde se produzca el corte tenemos productos no recombinados y productos recombinados. Se llaman productos no recombinados si son cortados de una manera donde el DNA que flanquea el sitio de corte no es recombinada; serán productos recombinados si son cortados de otra manera donde el DNA flanqueante es recombinado.
Maquinaria molecular RecBCD (proteína mrxen eucariotas). Es una helicasanucleasa que inicia la recombinación desenrollando el DNA (helicasa) y procesa la rotura del DNA. Degrada la doble hélice hasta encontrar una secuencia denomina chi (5’ GCTGGTGG-3’). A partir de esta secuencia aumenta la degradación de la hebra con extremo 5’ y disminuye la degradación de la hebra con extremo 3’. Se para a una determinada distancia de la región chi (extremos protuberantes).
RecA (RAD51 en eucariotas). Es una recombinasa o proteína de intercambio de cadena. Interacciona con el DNA monohebra formando un filamento helicoidal dextrógiro alrededor de esa hebra de DNA. Cataliza la invasión de la doble hélice intacta y poder así formar el bucle D. Se pueden aparear las secuencias homólogas y se forman las uniones de Holliday. Esta recombinasa requiere de la presencia de ATP.
1. RecA forma un filamento sobre el extremo protuberante 3’.
2. El DNA duplexo se incorpora al complejo.
3. Se forma una triple hélice.
4. Va a desplazar una de las cadenas de la doble hélice.
5. Se produce la separación de la cadena desplazada.
RuvA. Es un tetrámero que se une específicamente a las cuatro hebras del intermediadio de Holliday. A su vez recluta a RuvB.
RuvB. Es una ATPasa que se activa en forma de hexámero. Se une a extremos opuestos de intermediario de Holliday y actúa como un motor de desplazamiento. El consumo de ATP hace que RuvB haga girar el DNA y así migre el intermediario de Holliday.
RuvC. Es una resolvasa, una endonucleasa que reconoce de forma específica los intermediarios de Holliday y permite su separación.
RECOMBINACIÓN ESPECÍFICA DE SITIO Es el intercambio de material génico entre dos DNAs con una secuencia corta común, denominada sitio de recombinación. Los sitios de recombinación son reconocidos por recombinasas. Mediante este tipo de recombinación se consigue la integración del fago ƛ en E.coli.
TRANSPOSICIÓN No es un tipo de recombinación sino un proceso que suele utilizar recombinación.
No se necesita homología de secuencia. Es la transferencia de un segmento de DNA de una posición del genoma a otra. La nueva localización se elige al azar.
Constituye la principal fuente de mutación dentro del genoma. Puede ser: replicativa y conservadora.
La característica típica es que el segmentos transferidos están flanqueado por repeticiones (directas, invertidas,…). Es necesaria una enzima, denominada transposasa.
Hay diversos tipos de elementos transponibles que se pueden dividir en dos categorías: transposones de DNA o transposones de RNA (retrotransposones).
- Transposones de DNA. Se pueden transponer en forma replicativa donde el transposón original se mantiene en el lugar y aparece una nueva copia en otra parte del genoma. En ellos se encuentra el gen que codifica su propia transposasa. En la transposición de modo conservador el transposón original se traslada al nuevo sitio mediante un proceso de corte y pegado. Se da en procariotas y eucariotas.
- Transposones de RNA o retrotransposones. Se transponen de forma replicativa a través de un intermediario de RNA. Son característicos de eucariotas. Hay dos tipos: x Repeticiones terminales largas (LTR) x No repeticiones terminales largas (No LTR). Tienen secuencias de poliA en los extremos 3’. Hay dos tipos: elementos nucleares largos dispersos (LINE) o elementos nucleares cortos dispersos (SINE).
Transposones DNA. Actuación de la transposasa Tenemos el transposón en el cromosoma A dador con las secuencias cortas flanqueándolo. El complejo activo de la transposasa se une a las repeticiones inversas y efectúa cortes romos en el DNA dador y cortes escalonados en el DNA aceptor. Liga el transposon a los extremos de DNA aceptor libre que queda. La DNApol extiende los extremos 3’ cortados. La DNAligasa une los extremos. El cromosoma A dador roto se une por recombinación homóloga.
Modelo del proceso que determina si se da la replicación replicativa o conservativa.
Lo enunciaron Shapiro y col. en 1979.
1. La transposición es iniciada por cortes monocatenarios que aparecen en la molécula a cada lado del transposón y en el sitio diana donde se va a insertar el elemento transponible. En el sitio diana los dos cortes van a dar lugar extremos protuberantes.
2. Tiene lugar el ligamiento de los segmentos protuberantes 5’ a los extremos 3’ libres del transposón, creando una molécula híbrida en la que los dos DNAs son ligados por el transposón. El transposón es flanqueado por dos estructuras similares a una horquilla de replicación.
3. En éstas, la síntesis de DNA copia el elemento transponible y convierte al híbrido inicial en un cointegrado, en el que los dos DNA originales todavía están ligados. Se pueden dar dos situaciones: - Se produce la recombinación homóloga entre las dos copias del transposón, desacoplando el cointegrado. Esto tiene como resultado la separación del DNA original de la molécula diana con una copia del transposón.  transposición replicativa.
- Puede darse el caso de que no se sintetice DNA y se forma una estructura híbrida que se convierte en dos moléculas de DNA separadas.  transposición conservativa.
Transposones RNA El primer paso de la retrotransposición es la síntesis de una copia DNA del retroelemento insertado mediante la DNApol de la célula. El transcrito actúa como molde para la síntesis de DNA dependiente de RNA mediante la acción de la transcriptasa inversa. Se requiere un cebador RNA (ARN transferente) ya que los retroelementos no codifican RNApol. Una vez formado el cDNA por la transcriptasa inversa, es reconocido por la integrasa para producir la recombinación en un sitio nuevo.
PAPEL DEL RNA Es un polinucleótidos mono o polinucleótido, lineal o circular. La mayoría de ellos son una hebra simple y exhiben diversas conformaciones. Las diferencias en los tamaños y conformaciones de los distintos tipos les permiten llevar a cabo funciones especificas en la célula.
El ARN presenta una estructura primaria similar a la del DNA, con dos excepciones: - El componente azúcar tiene un grupo OH en posición 2’.
- La T es reemplazada por U.
Las estructuras secundarias más simples en los RNAs monocatenarios son los tallos y bucles y las horquillas, formados por apareamiento de bases. Este plegamiento puede llegar a formar estructura terciarias más complicadas, como el pseudonudo.
El RNA puede participar en una doble hélice híbrida (RNA-RNA o RNA-DNA) presentando una conformación como DNA A.
Según su contenido de RNA de la célula podemos distinguir: - Codificante. 4% del total. Es el transcriptoma. Da lugar a las moléculas precursoras de ARNm que son transcritas directamente del DNA. Presenta exones e intrones, para ser posteriormente procesado a mRNA. Los mRNA presentan una vida muy breve, bacterias unos pocos minutos y en eucariotas unas pocas horas.
- Funcional. No forma parte del transcriptoma pero cumple funciones esenciales dentro de la célula. algunos se presentan como precursores (prerRNA y pre-tRNA). Otros son: rRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, miRNA y iRNA.
*Transcriptoma: transcritos de genes que codifican proteínas.
CLASES rRNA Presente en todos los organismos es el más abundante (80% del total en bacterias). Forma parte de los ribosomas.
El RNA en ribosomas presenta funciones catalíticas (ribozimas) y estructurales en la síntesis de proteínas.
tRNA Es el más pequeño de los RNA, con unos 75nt de media. Presente en el citoplasma de todos los organismos. Son moléculas pequeñas que participan en la síntesis de proteínas. Su función es transportar aminoácidos específicos hasta los ribosomas, donde, según la secuencia especificada en un ARNm, se sintetizan las proteínas.
Actúan como adaptadores porque deben intereaccionar de forma específica con ácidos nucleicos (mRNA) y aa.
Presentan una estructura secundaria característica con tallos y bucles. En su extremo 3’ tienen la secuencia -CCA que permite la unión de aa (extremo aceptorindependiente del aa).
mRNA En procariotas dentro de una secuencia nucleotídica podemos encontrar la información para la síntesis de varias cadenas polipeptídicas  RNA policistrónico.
En eucariotas el RNA codifica únicamente para un polipéptido  RNA monocistrónico.
Formación: Tenemos el segmento de DNA con el gen A. Actuará la RNApol para dar lugar a un transcrito primario mucho más grande que el RNAmaduro (hnRNA). En él, encontramos una cola de poliA en el extremo 3’ proporcionándole estabilidad.
Este se transportará al citoplasma, donde tendrá lugar el splicing y la participación de las partículas snRNP. Finalmente, tenemos un RNAmaduro que mediante la traducción da lugar al a proteína.
snRNA Presentan de 100-200 nucleótidos. Aparecen fundamentalmente en el núcleo de eucariotas formando complejos estables con proteínas específicas formando las partículas ribonucleoproteícas pequeñas nucleares (snNRP) Participan en el procesamiento del RNA.
snoRNA Participan en las modificaciones de los rRNA, como las metilaciones.
miRNA Presentes solo en eucariotas. Son RNA pequeños que regulan la expresión de genes individuales. Su maduración la llevan a cabo fundamentalmente dos endonucleasas: Drosha y Dicer.
A partir de los genes que codifican información para miRNA se produce el pri-miRNA. Este es reducido hasta un precursor 70-80 nt, el pre-miRNA, por un complejo proteico que contiene Drosha y DGCR8. El pre-miRNA se transportará al citoplasma gracias a una exportina. La enzima Dicer lo modificará para producir un miRNA casi maduro apareado con un corto complemento de RNA (hebra sense). La helicasa separa las dos hebras, eliminando el complemento. La hebra sense se degrarará, mientras que la antisense (mi-RNA maduro) se unirá a complejos proteicos como el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Después se une a mRNA diana: - Si la complementariedad entre el miRNA y su diana es casi perfecta, el mRNA diana es cortado.
- Si la complementariedad es parcial se bloquea la traducción del mRNA diana (se inhibe).
siRNA Presente sólo en eucariotas.
TRANSCRIPCIÓN DEL DNA Es el primer paso en la expresión de los genes. Consiste en la síntesis de una molécula de RNA a partir de una secuencia molde (una de las hebras DNA).
La transcripción es menos precisa que la replicación. Error cada 10.000 nt incorporados.
Por convenio la transcripción comienza en posición +1. El producto es el hnRNA.
Una sola de las cadenas da lugar a una molécula de ARNm (transcripción). Este ARN sirve de intermediario para transportar la información del gen y llevarla hasta los ribosomas, donde, a partir de esta información se sintetizan las proteínas (traducción).
Podemos definir que la información del ADN se puede transmitir de tres formas distintas (dogma central de la Biología molecular): -De una molécula de ADN a otra de ADN: replicación.
-De una molécula de ADN a una de ARN: transcripción.
-De ARNm a la proteína: traducción.
Se creía que este flujo es unidireccional (de ADN a proteínas). Este esquema central de flujo de la información pronto fue modificado, ya que en algunos virus cuyo material hereditario es ARN, la información se conserva o mantiene mediante replicación del ARN. Además, también se comprobó que la información no va siempre del ADN hacia el ARN (ADN ARN), en algunos casos la información puede fluir del ARN hacia el ADN (ARN→ ADN), es decir sintetizar ADN tomando como molde ARN, teniendo lugar el fenómeno de la transcripción inversa.
TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS Procariotas Una de las hebras de DNA sirve de molde para la síntesis de ARNm. Conforme se va sintetizando, comienza la traducción. Todo se produce en el citoplasma.
Eucariotas Comienza la transcripción en el núcleo por la cual obtenemos a partir de una hebra de DNA, un hnRNA que será procesado para formar el ARNm maduro. Este será transportado al citosol donde se iniciará la síntesis de proteínas.
RNApol La transcripción se va a llevar a cabo mediante RNA polimerasas. Añaden nucleótidos en función de la cadena molde de ADN.
(NMP)m + NTP3  (NMP)m+1 + PPi Implican un ataque nucleofílico del grupo 3’–OH del primer nucleótido al fosfato α del segundo NTP, formándose un enlace fosfodiester. Esta acoplada a la hidrólisis de PPi para asegurarse la energía para llevar a cabo el proceso.
Sintetizan siempre RNA en sentido 5’3’. No requiere cebador (reacción autoiniciadora).
En procariotas solo hay un tipo y se encarga de la transcripción de todos los ARN.
En el caso de E. coli la ARN polimerasa está formada por cinco subunidades (2α,1β, 1β’ y 1ω).
En eucariotas hay tres tipos cada una de las cuales se encarga de la transcripción de un determinado tipo de ARN. A nivel funcional son diferentes ya que trabajan un grupo diferente de genes, los RNA sintetizados son diferentes. La más estudiada es la ARNpol II que es la que participa en la transcripción de genes de codifican proteínas.
Las tres polimerasas tienen subunidades en común y subunidades específicas. Por ejemplo, la ARNpolimerasa II está formada por 12 subunidades. Estructuralmente los tres tipos son bastante similares entre sí. Presentan dos grandes subunidades RPB1 y RPB2. En RPB1 está presente el domino C terminal (CTD) esencial para que la RNApol funcione. Presentan diferente sensibilidad a la a-amanitina: polI es resistente mientras que PolII es la menos resistente. La sensibilidad indica que bloquea la elongación de la cadena RNA.
ESTADIOS DE LA TRANSCRIPCIÓN La ARN polimerasa reconoce el promotor y se une a él para iniciar la transcripción. Los promotores, se localizan en el extremo 5´ del sitio de iniciación de la transcripción. El promotor indica a la maquinaria cual de las dos cadenas de ADN se va a transcribir y la dirección de la transcripción. La transcripción empieza donde acaba el promotor. El terminador es una secuencia de ADN que indica a la maquinaria de la transcripción que debe acabar de transcribir. Sí se transcribe.
A cada par de bases en un promotor se le asigna un número positivo o negativo que indica su posición río (o corriente) arriba o abajo a partir del sitio de iniciación de la transcripción, a este sitio, se le llama +1 (no hay cero). El ARN es sintetizado en dirección 5´ 3´, consecuentemente, el promotor está río arriba. Los nucleótidos en dirección 3’ están aguas abajo. Los nucleótidos aguas abajo también lleva signo más; aguas arriba tendrá signo negativo.
Para sintetizar la nueva cadena necesita ribonucleótidos. Durante la transcripción, los ribonucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiester y la cadena crece en dirección 5’3’ siguiendo el molde de la cadena de ADN. La ARNpolimerasa no necesita cebador. Siempre se añaden nucleótidos en 3’ (crece en sentido 5’ 3’). Se forma un heterodúplex: unión de la cadena que se está sintetizando y el ADN que sirve de molde.
Dos estadios principales.
1. Iniciación de la transcripción.
2. Síntesis y procesamiento de RNA.
La hebra no molde, también denominada con sentido, positiva o codificante, tiene es la misma secuencia que el RNA. La hebra molde de DNA, es negativa y no codificante, o sin sentido.
1. INICIACIÓN La iniciación es la fase más compleja y durante ella se lleva a cabo la regulación de la transcripción. Se produce la síntesis de los primeros nucleótidos y se forma la burbuja de transcripción que avanza junto con la ARN pol. El fragmento separado es la burbuja de transcripción y consta de entre 8-10 nucleótidos. Se forma una doble hélice hibrida con ARN y ADN corta y transitoria debido al avance de la burbuja.
Elementos que participan en la iniciación: El objetivo de esta fase es la formación de un complejo de iniciación de la transcripción. Para que este se construya es necesario tener unas secuencias determinadas y correctas en el DNA denominadas promotores. Estas son secuencias dianas que marcan el inicio de la transcripción. La unión del RNA pol a los promotores se puede producir de forma: - Directa.
- Indirecta. A través de varias proteínas, la cual se une al ADN y posteriormente a esta se une la ARN pol. Esta forma se lleva a cabo en eucariotas y arqueobacterias. Son complejos. Estas se ensamblan al promotor junto con la ARNpol.
Promotores basales son elementos muy próximos al origen de la transcripción y determinan el punto de inicio. Es el sitio al que se ensambla el complejo de iniciación. Cada una de las RNApol reconoce un tipo diferente de secuencia promotora.
Elementos proximales se encuentran dispersos pero próximos al origen y van a determinar la frecuencia de inicio de la transcripción. No son considerados promotores como tales. Se distribuyen entre -50 a -200.
Elementos distales se encuentran próximos entre sí pero alejados del origen de la transcripción. Regulan la eficacia del inicio de la transcripción. Pueden estar separados por varios miles de pares de bases.
Hay proteínas activadoras y represoras de la transcripción. Estas presentan un dominio de unión a DNA y otro dominio de activación o de represión (dependiendo del caso).
Formación del complejo de iniciación: Lo primero que debe ocurrir es la unión de TFIID a la caja TATA. TFIID está formado por: TBP (proteínas de unión a TATTA) y TAFs (factores asociados a TBP). La subunidad TBP reconoce la caja TATA del molde de ADN y se une a ella.
Una vez unido el TFIIB, se unen el resto de los componentes de la maquinaria basal. Se produce un cambio conformacional en el aparato de la transcripción basal (se suelta alguno de los factores de transcripción) para que la transcripción se inicie.
Para que se separe la doble hélice al comienzo de la transcripción es necesario un factor conocido como TFIIH que presenta una actividad helicasa y quinasa. Es TFIIH quien empieza a desenrollar y a continuación continúa el desenrollamiento la ARN pol. Es necesaria también la presencia de topoisomerasas para que no se produzcan tensiones y se dé el superenrollamiento.
Tras la unión de la RNApol a la secuencia promotor este complejo promotor cerrado se convierte en un complejo promotor abierto. Por último, la RNApol se aleja del promotor. Este último paso es complicado, pues algunos intentos de lograr el “despeje” del promotor no son eficaces y dan lugar a transcritos truncados que van a ser degradados poco después de la síntesis. La etapa de iniciación finaliza cuando el complejo de transcripción ya es estable y funciona activamente. La iniciación en eucariotas es más complejo que en procariotas, ya que se ven involucradas una cantidad mayor de proteínas.
Ensamblaje in vitro del complejo de iniciación.
Los factores de transcripción indicados anteriormente y la ARNpol II se unen secuencialmente al DNA de la caja TATTA para formar el complejo de iniciación.
TFIID se une a la caja TATTA como una silla de montar. TFIIA y TFIIB estabilizan la unión de TFIID a la caja TATTA, incorporándose cuando esta unión ya se ha producido. TFIIF se une a la ARNpol II y se incorpora al promotor. TFIIE estabiliza la horquilla de transcripción. TFIIH, que presenta actividad helicasa y quinasa, se une por lo que ya está formado todo el complejo. Dicho complejo es cerrado. La actividad helicasa del TFIIH sirve para desnaturalizar el promotor y la actividad quinasa para fosforilar. La hidrólisis de ATP proporciona la energía necesaria para desenrollar el DNA mediante el factor TFIIH. En la subunidad más grande RNApol II encontramos un dominio C terminal. Su fosforilación lleva a la polimerasa a abandonar el complejo de iniciación y comenzar a sintetizar RNA.
2. ELONGACIÓN En ella participan trece factores diferentes. La elongación solo tiene lugar cuando la CTD está fosforilado. La fosforilación de ese dominio conlleva el paso de un complejo iniciación a un complejo de elongación.
RNA pol invierte horas en transcribir un solo gen siendo la velocidad de 2000 nucleótidos por minuto. Esta ARNpol hace pausas por lo que sintetiza a una velocidad discontinua. TFIIS estimula el ritmo de la elongación y disminuye los tiempos de paradas; además estimula una actividad RNAasa inherente a la RNA pol II para corregir nucleótidos que se encuentran mal incorporados.
3. TERMINACIÓN El punto exacto de la terminación es difícil de determinar. La terminación está ligada al procesamiento del extremo 3’ (cola poli A).
Es necesario un corte en el mRNA para generar un extremo 3’–OH donde puedan unirse las adenosinas.
Entre los elementos que participan en la poliadenilación encontramos: - CPSF o factor específico de poliadenilación y corte (señal de poliA). Se une a la secuencia AAUAAA. La secuencia AAUAAA define la posición donde ocurre la adición de las adenosinas.
- CstF o factor estimulador de corte (señal de poliA). Se una a una secuencia rica en GU.
- PoliA polimerasa. Se une al sitio de unión a poliA (CA).
- Proteína de unón a poliadenilato (PADP). Ayuda a la polimerasa a agregar adenosinas.
Durante la terminación CPSF está unido al complejo de elongación de la RNApol II en el CTD (dominio carboxilo terminal). En cuanto es transcrita la secuencia señal CPSF se une también a ella. Esto modifica la interacción entre CPSF y CTD de manera que se favorece la terminación de la transcripción respecto a continuar con la elongación.
En la terminación de la transcripción una fosfatasa va a reciclar la acción de la polimerasa: defosforila la ARNpol II en el carboxilo terminal para poder iniciar la transcripción (fosforilada no se da la iniciación).
PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES Las células eucariotas convierten el transcrito primario inicial (sintetizado por RNApol II) en un mRNA funcional.
Los tres eventos que tienen lugar después de la transcripción son: - Formación de la caperuza 5’.
- Corte y poliadenilación del extremo 3’.
- Corte y empalme del RNA.
El procesamiento transcurre en el núcleo a la vez que el precursor de mRNA se transcribe. El mRNA funcional es transportado al citoplasma.
Tras el inicio de la transcripción se forma la caperuza 5’. Esta es una caperuza de 7-metil-guanilato en el primer nucleótido del primer exón de un gen.
La transcripción termina en el extremo 3’ del sitio poliA localizado en el extremo 3’ del último exón. Se añaden residuos de adenosina (unos 250 en mamíferos). En el caso de que sean transcritos cortos con pocos intrones el corte y empalme (splicing) sigue al corte y la poliadenilación. Para transcritos con muchos intrones, estos suelen ser eliminados del RNA naciente mediante splicing durante su transcripción.
Tenemos un RNA funcional donde la caperuza y la cola de poliA van a ser retenidas.
MODIFICACIÓN DEL EXTREMO 5’: ADICIÓN DE LA CAPERUZA Una vez transcrito el ARNm (pre-ARNm) se produce la modificación del extremo 5’. Esta modificación consiste en la adición de un nucleótido y su posterior metilación. Este extremo es reconocido por una serie de proteínas formando la caperuza. La caperuza ayuda al transporte de mRNA y es reconocida por los ribosomas para que se una a ellos. También se encarga de proteger el extremo 5’.
En todas las células animales y células de plantas superiores presentan dos características: - Hay una unión 5’5’ del 7-metilguanilato al nucleótido inicial de la molécula de mRNA.
- Una unión de un grupo metilo al 2’-OH de la ribosa del primer nucleótido.
El segundo nucleótido también va a estar metilado en vertebrados.
El mRNA naciente presenta un grupo trifosfato en su extremo 5’. En eucariotas, cuando el RNA naciente alcanza una longitud de 25-30 nucleótidos se va a añadir a sus extremos 5’ las 7-metil-guanosina.
Las siguientes dos primeras reacciones son catalizadas por una enzima dimérica formadora de la caperuza. Esta enzima se asocia al dominio CTD de la RNApol II (asociación específica). Por un lado presenta actividad fosfohidrolasa, que cataliza la salida del Pϒ, y actividad guanililtransferasa, que utiliza como sustrato GTP. Así se transfiere GMP al extremo formando la estructura guanosina-5’-5’trifosfato. Las enzimas metiltransferasas transfieren grupos metilo de la S-adenosil-metionina a la posición N7 de la guanina (guanina-7metiltransferasa) y a los O2 de la ribosa (2’-Ometiltransferasa).
MODIFICACIÓN DEL EXTREMO 3’: ADICIÓN DE LA COLA DE POLIA Exclusivo de los transcritos mRNA eucariontes. Las histonas carecen de cola de poliA. Va asociada a la terminación de la transcripción.
Para que se pueda añadir la cola de poli-A es necesario un corte en la parte que ha sintetizado de más la ARN polimerasa. Este corte se produce 11-30 nucleótidos hacia el extremo 3’ de una secuencia consenso AAUAAA en la región 3’ no traducida. Tras el corte, se añaden las adeninas (100-250) por un proceso de poliadenización.
Entre los elementos que participan en la poliadenilación encontramos: - CPSF o factor específico de poliadenilación y corte (señal de poliA). Se une a la secuencia AAUAAA. La secuencia AAUAAA define la posición donde ocurre la adición de las adenosinas.
- CstF o factor estimulador de corte (señal de poliA). Se una a una secuencia rica en GU.
- PoliA polimerasa. Se une al sitio de unión a poliA (CA).
 Modelo de corte y poliadenilación en los mRNA en mamíferos.
Alrededor del sitio donde se produce el corte hay dos señales consenso una en cada dirección. Una de estas secuencias es reconocida por la proteína CPSF (AAUUAAA) y la otra (rica en U) por CstF. Estas proteínas interaccionan entre sí y producen un plegamiento.
A estas dos proteínas se unen factores de corte y una poliadenilato polimerasa (PAP).
- La unión de los factores de corte I y II (CSI y CSII) ayudan a estabilizar el complejo. Una vez cortado, los factores de corte son liberados y el fragmento 3’ es degradado. El producto de corte del mRNA es degradado rápidamente.
- La polimerasa de poliadenilación añade adenosina al extremo 3’ del nuevo mRNA (10-30 nt de la señal de poliA). Las PAP añaden lentamente unos 12 residuos de adenosina al grupo –OH. La proteína de unión a poliA (PABII) une la cola de poliA e incrementa la velocidad de poliadenilación. Tras la adición de 200-300 residuos de adenosinas envía una señal a PAP para que se detenga la poliadenilación. No se sabe quién determina la longitud de la cola de poliA.
SPLICING El splicing se da en el núcleo y consiste en la eliminación de intrones y empalme de exones. Un splicing fallido puede dar lugar a enfermedades, como la B-talasemia. El RNA maduro es exportado al citoplasma.
Dentro del pre-mRNA encontramos tres secuencias consenso que participan en el proceso.
x La primera se sitúa al lado del sitio de corte y empalme en 5’ (secuencia consenso 5’) está bastante conservada y generalmente empieza por GU.
x Al lado del sitio de corte y empalme de 3’ encontramos la secuencia consenso 3’. Casi todos terminan en AG.
x La tercera secuencia importante para el corte y empalme está en el punto de ramificación, localizado entre 18-40 nucleótidos aguas arriba de la secuencia consenso 3’. Está no está demasiado conservada, pero es rica en pirimidinas.
El corte y empalme ocurre dentro de un gran complejo conocido como empalmosona, formado por varias moléculas de RNA y muchas proteínas. Los RNA componentes son RNA nucleares pequeños (snRNA) asociados a proteínas y formando partículas ribonucleoproteicas pequeñas (RNP).Estas proteínas hacen al RNA accesible.
En eucariontes encontramos 7 tipos de intrones.
*Los dos primeros se encuentran en genes que codifican proteínas.
La química del splicing conlleva dos reacciones de transesterificación: 1. El mRNA se corta en el sitio de corte y empalme 5’ de manera que se libera el exón 1. El extremo 5’ del intrón se pega al punto de ramificación del propio intrón. El grupo –OH en posición 2’ del azúcar de la A del punto de ramificación ataca al grupo P que forma parte del enlace fosfodiester del sitio de corte y empalme 5’. Se forma un nuevo enlace 5’-2’ fosfodiester que une el primer nucleótido del intrón con la adenosina. El intrón ha formado un bucle con una estructura en lazo.
2. Se hace un corte en el sitio de corte y empalme 3’ y la unión entre los dos exones. La rotura de este enlace es también por transesterificación. El grupo –OH terminal del exón 1 interacciona con el P de AG-3’. El enlace que mantiene conformado al lazo se rompe y el intrón lineal se degrada. El mRNA cortado y empalmado se dirige al citoplasma y se traduce.
EDICIÓN DE RNA Fue descubierta a mediados de los 80. Consiste en una modificación química de los nucleótidos de los RNA, que conlleva a modificaciones en las propiedades de codificación del transcrito (alteración de la secuencia de aa de la proteína).
Se da antes del splicing. Es un proceso muy poco frecuente en eucariotas superiores, pero muy difundido en mitocondrias de protozoos y plantas y en cloroplastos.
*Ej.: gen ApoB. La alipoproteína B100 tiene un procesamiento normal en el hígado.
El cambio se produce en células epiteliales intestinales, donde, por edición se forma una proteína de menor tamaño, la alipoproteína B48. Una vez generado el ARNm se produce la edición mediante la acción de una desaminasa. Se produce el cambio de un nt en la posición 6.666 (CU) generando un codón de paro (CAAUAA) y con ello una proteína truncada.
También lo encontramos en el encéfalo, ahí se produce un cambio Aiosina.
Tras la transcripción y splicing obtendremos un mRNA maduro donde tenemos: caperuza, cola poliA, y dos regiones no traducidas (5’-UTR y 3’UTR). Estas regiones están implicadas en el control de la traducción (5’-UTR) y en diferentes aspectos del metabolismo de RNA (3’-UTR), como exportación nuclear, localización citoplásmica, eficacia traduccional y estabilidad del mRNA.
TRANSPORTE Y LOCALIZACIÓN DE MENSAJEROS Una vez completado el procesamiento de un mRNA en el núcleo, este permanece asociado con proteínas hnRNP específicas del complejo ribonucleoproteico mensajero (mRNP). Los diferentes elementos que se unen al mRNA localizan en el extremo 3’-UTR y forman a menudo estructuras tallo-bucle. Del núcleo, debe ser transportado al citoplasma a través de los poros nucleares.
Estos están constituidos por estructuras octogonales denominadas complejo del poro nuclear (NPC). En vertebrados lo constituyen 100 proteínas diferentes denominadas nucleoporinas. Presenta ocho filamentos hacia el nucleoplasma para formar una estructura en cesta (cesta nuclear). Los iones, pequeños metabolitos y proteínas globulares de hasta 60kDa pueden difundir a través del canal. Los grandes complejos proteicos y ribonucleoproteicos necesitan de ciertas proteínas transportadoras solubles para moverse a través de los poros de la membrana nuclear.
 Mecanismo propuesto para el transporte de mRNA al citosol.
Se ha identificado una proteína heterodimérica, la proteína transportadora de mRNA. Presenta dos subunidades: una grande y otra pequeña.
- La subunidad grande contiene tres dominios: dominio medio (M), dominio carboxilo (C) y la región N-terminal (N). M y C se unen a secuencias hidrófobas cortas ricas en fenilalanina y glicina de las nucleoporinas FG. N tiene una leve actividad de unión al RNA.
- La subunidad pequeña se une al dominio M. Contribuye también a la unión de la repeticiones FG.
Se propuso que el exportador de mRNA se difunde a través del poro realizando interacciones transitorias a repeticiones FG de nucleoporinas adyacentes a medida que este progresa por el canal. La direccionalidad del complejo podría deberse un gradiente de mRNPs del núcleo al citoplasma.
 mRNA en el citosol Una vez en el citoplasma se añaden otras proteínas. En algunos casos se pueden formar oligómeros mediante interacciones proteína-proteína. En el citoplasma se ensamblan en gránulos o estructuras que contienen diversos mRNPs, subunidades ribosomales y factores implicados en la regulación de la traducción. La localización subcelular del mRNA es un meanismo de regulación ya que determinará donde se sintetizaran los productos proteicos y donde ejercerán su acción.
A principios de los 80 se observó esta distribución homogénea de la distribución de mRNA. Uno de los mecanismos que contribuye a determinar la localización subcelular de mRNAs específicos, es el transporte activo polarizado utilizando el citoesqueleto celular (motores moleculares). Este transporte es el método más rápido para translocar a largas distancias partículas RNPs. Los gránulos de mRNA se unen a proteínas motoras y se transportan mediante los elementos del citoesqueleto a su destino final.
Los elementos cis que participan en esta localización asimétrica de los transcritos se conocen como zip-codes. Estos se localizan en las regiones 3’-UTR de los mensajeros. Estos elemtnos zip reclutan diferentes factores trans que facilitaran el movimiento con los motores moleculares.
*Ej.: Particularmente en las células somáticas altamente polarizadas. En ellas el sitio de transcripción puede estar muy alejado de la posición final de la proteína. Es un proceso muy importante en neuronas maduras e inmaduras.
tRNAs y aa-tRNA sintetasas En el proceso de traducción necesitamos: mRNA, tRNA, aa-tRNA sintetasa y ribosomas fundamentalmente.
tRNA Son moléculas de ARN con un tamaño entre 73-95 nucleótidos. Cada uno se denota con ARNt y un superíndice indicando el aa transportado.
Adapta el mensaje del DNA (4 bases) a los 20 aa de las proteínas. Encontramos desde 30 tRNA (bacterias) hasta 50 tRNA (eucariotas) diferentes. Como el códig genético designa sólo 20 aa, esto implica que todos los organismos tienen por lo menos algunos tRNA de isoaceptación (=diferentes tRNA específicos para un mismo aa). 31+1 es el número mínimo de tRNAs que deben existir.
Todos obedecen a una estructura común. El tRNA establece con el mRNA establece un primer contacto mediante una interacción codón-anticodón. El aa específico será portado por el extremo 3’ de la molécula.
Estructura primaria Tienen un tamaño entre 73-95 nt. Tienen bases normales, pero hasta un 25% son bases raras. Es una única hebra, por lo que presenta extremo 3’ y 5’. Su extremo 5’ esta siempre fosforilado y suele ser una guanina. En el tRNA maduro aparece siempre en el extremo 3’ un triplete común:- CCA El primer tRNA descubierto fue el de la alanina (1965).
Estructura secundaria Forman una estructura en forma de hoja de trébol: la cadena se pliega dando lugar a apareamientos entre sus cadenas. Presenta cuatro brazos y tres bucles; en ocasiones aparece un pseudobucle (3-20 nt).
- Brazo aceptor: está formado por los dos extremos de la cadena. En el extremo 3’ siempre aparecen ACC. Es a esta adenina donde se une el aa correspondiente. Tiene siete apareamientos.
- Brazo TψC: lugar de enlace al ribosoma. Abunda timina unida a ribosa, pseudouracilo y citosina metilada.
- Brazo D: lugar de unión a la aminoacil ARNt sintetasa. Tiene cuatro apareamientos. Abunda dihidrouracilo.
- Brazo anticodon: lugar de reconocimiento de los codones del ARNm. El brazo anticodón presenta tres bases que se encargan de interpretar el código genético. El anticodón está flanqueado por bases que marcan (purina a un lado y dos pirimidinas al otro).
Las dos primeras bases del codón utilizan apareamientos clásicos de Watson y Crick, y la tercera de Hogsteen.
Estructura terciaria Normalmente adopta una estructura de hoja de trébol plegada en forma de L o forma de boomerang.
Su anchura es de 20A y la altura de 76A Presenta dos tramos: en el horizontal tiene el brazo aceptor de aa y el brazo TYC, en la vertical encontramos el brazo D y el brazo anticodón. Esta conformación tiene una mínima energía de bases sobre otras (puentes de hidrógeno y fuerzas de apilamiento de bases).
Maduración Habitualmente se transcriben varios tRNA juntos, como un tRNA precursor grande que luego se corta en trozos que contienen un único tRNA.
Ocurre en el nucleoplasma. El tRNA se sintetiza por la RNApol III en forma de transcrito inmaduro que deberá sufrir una serie de modificaciones.
La RNAasa P corta el extremo 5’ y la RNAasa D el extremo 3’. Se produce una modificación de bases. Tras el corte de los extremos se añaden los nucleótidos – CCA-3’ gracias a la enzima tRNA-nucleotidil-transferasa que los transfiere a partir de los NTP (2CTP y 1 ATP). Debe producirse splicing para eliminar el intrón tipo IV que presenta (endonucleasas y ligasas).
Aminoacil-tRNA sintetasas Son las responsables de cargar el aa correcto en el tRNA correspondiente. Se produce error 1/10.000 aa. La enzima es específica para el aa, por lo que hay 20.
La unión es catalizada por aa-tRNAsintetasa y se realiza en dos pasos: 1. Se produce la activación del aa por unión con ATP que produce aminoacilAMP y PPi. Esta reacción es exergónica (∆H=-32,2 kJ). Se ha formado un aminoacil-AMP. El PPi se hidroliza por una pirofosfatas para formar 2Pi (∆H=-33,4kJ).
2. Unión del aa a su ARNt donde se libera AMP. Esta unión libera AMP. Tiene un balance positivo, por lo que no tiende a ocurrir (∆H=+29kJ). Ocurre puesto que en el balance total.
En general: aa+ tRNA + ATP  aa-tRNA + AMP + 2Pi ∆H= -36,6kJ La unión entre el aa y el ARNt se produce siempre en los tres últimos nucleótidos del brazo aceptor 3’ (ACC), por la unión entre el grupo carboxilo del aa y el grupo hidroxilo del azúcar (A) (enlace ester). Hay dos tipos de aa-tRNA sintetasas dependiendo de si unen por el 2’-OH (grupo I: 10 aa) y las que unen por el 3’-OH (grupo II: 10 aa). Las del grupo uno son monoméricas y las del grupo II diméricas o tetraméricas Estas enzimas son doblemente específicas por reconocimiento molecular: para cada aa (reconocen propiedades de carga, hidrofobicidad, tamaño) y para cada tRNA correspondiente.
Interaccionan específicamente con el brazo aceptor y con el brazo del anticodón (”conocen” e interpretan el código genético).
Son capaces de corregir errores. La aa-tRNA- sintetasa tiene una región donde debe unir aa, ATP y tRNA y una región de edición que hidroliza el aa si es incorrecto.
Si el t-RNA de un aa carga un aa que no le corresponde, el ribosoma no sabe leerlo por lo que la síntesis de proteínas erróneas. Esto se demostró de la siguiente manera: la cisteína se cargo al tRNA cys. Se hicieron modificaciones químicas en la cisteína de tal manera que se convirtió en alanina. El resultado fue una proteína anómala. Las aa-tRNA- sintetasas son las responsables de que el mensaje sea correcto puesto que en etapas posteriores no se va a discriminar.
tRNA-Met: Todas las síntesis comienzan con una metionina. La distinción entre la metionina inicial y las del resto de la cadena la realiza los tRNA.
*Selenocisteina La selenocisteína se considera el aa número 21, se describió en 1996. Está presente en todos los organismos, en proteínas denominadas selenoproteínas, como la glutatión Hay un total de 25 proteínas en eucariotas que contienen este aa.
Su codificación por un codón viola el código genético: UGA es un triplete STOP pero además es traducido por selenocistesina. La incorporación de selenocisteína ocurre vía un mecanismo interesante y único. El tRNA es cargado con serina y depusiste enzimaticametne es selenilado para producir selenocisteinil-tRNA.
ESTRUCTURA Y BIOSÍNTESIS DE RIBOSOMAS Los ribosomas se encuentran en el citoplasma de todas las células, la matriz mitocondrial y el estroma de cloroplastos. Son maquinarias supramoleculares que participan en la síntesis proteica. Son considerados sistemas químicos-mecánicos.
 Coloca en la posición correcta el mRNA.
 Se mueve a lo largo del mRNA en la traducción.
 Son responsables de las interacciones codón-anticodón y de las interacciones con otros factores proteicos asociados a la traducción.
 Catalizan la formación de enlaces peptídicos entre residuos aminoacídicos adyacentes.
 Aumenta la eficacia de la traducción. Si todos los elementos se encontraran en solución libre, la probabilidad de que hubiera colisiones simultáneas de todos los elementos libres sería tan pequeña que la velocidad de polimerización de los aa sería muy baja. La velocidad de la traducción se incrementa con la unión de los distintos elementos que participan y se unen al ribosoma.
*Curiosidades La velocidad de traducción es 3-4 aa por segundo. Las proteínas de 100-200 aa se forman en aproximadamente un minuto.
La proteína más grande conocida, la titina, es una proteína localizada en el músculo.
En su síntesis se tardan 3-4 horas (30.000 aa).
Para obtener información sobre ribosomas se utilizo en un primer momento la ultracentrifugación. Los coeficientes de sedimentación dependen de la masa y de la forma. Los coeficientes de sedimentación de las subunidades separadas no son aditivos. Las dos subunidades diferentes se pueden llegar a disociar a una concentración de magnesio por encima de 1mM.
En E.coli encontramos unos 20.000 ribosomas y representan el 20% del peso seco de la célula. Los ribosomas de E.coli son representativos en lo que la organización estructural del ribosoma se refiere.
1. PROCARIOTAS 1.1.
COMPOSICIÓN Están formados por RNA y proteínas:  rRNA. Entontramos rRNA 16S en la subunidad pequeña (30S) y rRNA 23S y 5S en la grande (50S). Los rRNA muestran un gran potencial para formar puentes de hidrógeno intracatenarios. Presentan estructuras secundarias similares a los tRNA aunque más complejas. Casi la mitad de las bases en el rRNA ribosómico 16S están apareadas. Encontramos regiones pequeñas de doble hélice con regiones de cadena sencilla que generan horquillas. Cada rRNA presenta diferentes dominios: 1 (5S), 5 (16S) y 6 (23S).
 Proteínas. Se conocen hasta 52 proteínas y se denominan dependiendo de su localización: si están en la subunidad grande se denominan L y si están en la pequeña con S. Hay una copia de cada proteína ribosomal excepto L7 y L12 que presentan la misma secuencia pero diferente grado de acetilación en el extremo amino terminal. Sólo una proteína es común a ambas subunidades: S20 y L26. Las proteínas ribosomales son ricas en aa catiónicos (Lys y Arg) y tienen pocos residuos aromáticos. Presentan unos dominios de reconocimiento de rRNA.
El RNA 16S de E.coli se ven marcados en rojos las posiciones donde contacta con la proteína ribosomal S5. Se muestra de forma indirecta el grado de plegamiento adicional que presenta la estructura secundaria de rRNA.
1.2.
PROCESAMIENTO DEL rRNA Las tres moléculas de rRNA en E. coli (23S, 16S y 5S) derivan de un precursor de mRNA 30S. La escisión del precursor de mRNA la llevan a cabo RNAasa III y otras RNAasas. Además de dar lugar a diferentes rRNA también se producen diferentes tRNA.
El modelo tridimensional para el ribosoma de E. coli se dedujo por reconstrucción de imagen. En él se encontró una subunidad pequeña 30S y la grande 50S.
- 30S. Presenta cabeza, base y plataforma. Aparece también una hendidura.
- 50S. Presenta cresta, tallo y protuberancia central.
Cuando se ensamblan aparece una cavidad entre las dos subunidades lo suficientemente grande como para albergar dos o más tRNA y otros factores proteicos necesarios en la traducción. La subunidad pequeña tiene un canal que conduce a la hendidura a través del cual el mRNA pasará.
2. EUCARIOTAS 2.1.
COMPOSICIÓN La subunidad grande (60S) presenta rRNA 5S, 5,8S y 28S; la pequeña (40S) rRNA 18S. El rRNA 5,8S forma una estructura secundaria con el rRNA 28S, uniéndose por apareamiento de bases complementarias.
Presentan los ribosomas en el citosol, matriz mitocondrial y estroma cloroplastos.
Se parecen a los ribosomas procariontes (mitocondrias y cloroplastos) en tamaño, organización, estructura, función….
En masa es 1,7 veces el de E.coli. Su morfología se asemeja a la de ribosomas procariotas.
2.2.
PROCESAMIENTO El rRNA es transcripto por acción de la RNApol I en el nucléolo. Esta produce un transcrito de 45S (pre-rRNA). A este pre-rRNA se unen diferentes proteínas denominándose pre-rRNP (80S). Se producen diferentes cortes y modificaciones en los cuales participan snoRNA. A estos se unen diferentes proteínas dando lugar a snoRNPs.
El pre-rRNP es modificado por metilaciones del grupo hidroxilo 2’. Estas metiltransferasas son ayudadas por los snoRNPs. Estos se colocan en determinados sitios indicando donde actuaran las metiltransferasas.
También se produce conversión de residuos de uridina a pseudouridina por la pseudouridina sintasa. También participan las snoRNPs como indicadores de la posición.
Posteriormente, los snoRNAP participan en el corte del pre-rRNP. Se posicionan en determinadas posiciones donde actúan unas exonucleasas nucleares eliminando las regiones espaciadoras trascritas.
Tanto la síntesis como el procesamiento de rRNA se producen en el nucléolo. Las proteínas ribosómicas y nucleolares se asocian con el pre-rRNA 45S a medida que se va sintetizando para formar el pre-RNP 80S. La síntesis del rRNA 5S se produce fuera del nucléolo en el nucleoplasma (RNApol III). Este no tiene ningún procesamiento adicional. Difunde al nucléolo y ahí se produce el ensamblaje de todos los componentes del ribosoma. Del núcleo sale por el complejo de poro nuclear.
3. TÉCNICAS Por ultracentrifugación diferentes subunidades.
Tratamiento de imágenes obtenidas por criomicroscopía electrónica.
Estudios con cristalografía de rayos X. Obtienen el cristal del ribosoma y obtiene un patrón de difracción de rayos X. Se hace pasar un haz de rayos X a través de un cristal de la molécula estudiada. Nos proporciona información de las dimensiones globales del ribosoma y la localización más o menos exacta de la unión de los tRNA al ribosoma.
El autoensamblaje de las subunidades ribosómicas se da por ensamblaje espontáneo. In vitro se ha visto que con todos los elementos a unas condiciones determinadas de pH se produce en autoensamblaje sin necesidad de más proteínas.
Se ha visto que el rRNA en el ribosoma se constituye como un andamio al cual se unen las proteínas. También se ha visto que en la zona peptiltransferasa se encuentra en el rRNA (ribozima).
Con estudios de cristalografía de rayos X se ha conseguido obtener la localización de los sitios A, E y P.
4. RIBOZIMAS RNA ribosómico. La actividad peptidiltransferasa requerida para la formación de enlaces peptídicos durante la síntesis proteica se asocia a la subunidad 23S y se presume que en eucariotas en al 28S.
El grupo amino del aminoacil-tRNA del sitio A reacciona con el carboxilo C terminal del peptidil-tRNA del sitio P.
FASES DEL PROCESO DE TRADUCCIÓN La alta velocidad de traducción se debe a que todos los procesos necesarios se producen en el ribosoma. El proceso de traducción consta de tres fases: - Iniciación. Durante la primera etapa de la traducción, un ribosoma se ensambla, formando un complejo con un mRNA y un tRNA iniciador activado, el cual está correctamente posicionado en el codón de inicio. Ambas subunidades ribosomales se mantienen separadas. Esta es la fase donde se va a producir una regulación mayor.
- Elongación.
- Terminación.
Encontramos varios factores fundamentales: ribosoma, mRNA, tRNA, proteínas, energía (ATP, GTP),….
En procariotas la traducción está acoplada al proceso de la transcripción. El reconocimiento del sitio de iniciación se produce por interacción del mRNA-rRNA (secuencia Shine-Dalgarno: 5’-UAAGGAGGU-3’). Existen tres factores de iniciación (IF1, IF2 e IF3). El primer aa de la cadena es N-formilmetionina.
En eucariotas la iniciación se produce en el citoplasma, por lo que el mRNA debe ser transportado desde el núcleo. Existen diferentes estrategias para el reconocimiento del sitio de iniciación: traducción Cap-dependiente o traducción Cap-indpendiente (IREs). Existen 9 factores diferentes de iniciación. El primer aa de la cadena es la metionina.
Tienen en común que los ribosomas se encuentran disociados en subunidades antes de la traducción, que la formación del complejo de preiniciación se produce en la subunidad menor, al cual se une el mRNA y posteriormente la subunidad mayor. La iniciación se encuentra mediada por factores.
Existen dos tipos de tRNAMet, el tRNAiMet que reconoce el primer codón AUG del mRNA y el tRNAMet que introduce las metioninas en cualquier parte de la cadena polipeptídica en síntesis. En bacterias a la metionina del tRNAiMet se une un grupo formilo.
PROCARIOTAS 1. INICIACIÓN A la subunidad pequeña se unen tres factores de iniciación para formar el complejo de preiniciación: - IF1. Bloquea el sitio de unión A del ribosoma, impidiendo que se una cualquier aa-tRNA.
- IF2. Presenta actividad GTPasa (GTPasa monomérica). Proveen energía para producir algún cambio y controlan que el proceso se lleve a cabo correctamente.
- IF3. Impide que se reasocie la subunidad ribosomal mayor.
Una vez formado el complejo de preiniciación debe unirse el mRNA y el primer tRNA iniciador (tRNAiMet).
La unión del mRNA mensajero con el ribosoma se produce por complementariedad de bases (bases del extremo 5’-mRNA y bases del rRNA 16S) de la secuencia Shine-Dalgarno. En procariotas los mRNA son policistrónicos, por lo que encontramos varias secuencias de Shine-Dalgarno. Así, se libera IF3 y se permite la unión de la subunidad ribosomal mayor.
Se ha formado el complejo de iniciación. La traducción comienza en el primer AUG presente en las proximidades de la secuencia Shine-Dalgarno. Una vez unido el mRNA a la subunidad menor, se une la subunidad mayor. Para ello debe liberarse IF1 e hidrolizarse IF2.
Esta unión es irreversible hasta que termina la traducción de un mRNA.
2. ELONGACION El primer codón se localiza en el sitio P del ribosoma. El EF-Tu, el EF-Ts, el GTP y el tRNA cargado forman un complejo que entra al sitio A del ribosoma. Después de que el tRNA cargado se ubica en el sitio A, el GTP se hidroliza a GDP y se libera el complejo EF-Tu-GDP. El EF-Ts regenera al complejo EF-Tu-GTP que luego está listo para combinarse con otro tRNA cargado.
Se forma un enlace peptídico entre los aa de los sitios P y A, y el tRNA del sitio P libera su aa.
El aa que porta el ARNt del sitio P es transferido al aa presente en el sitio A, gracias a una de las cadenas de ARN ribosomal que lo forma (peptidil transferasa). El ribosoma se mueve a lo largo del mRNA en dirección 3’, hasta el siguiente codón (translocación), que requiere EF-G y GTP. Como consecuencia el primer ARNt que ocupaba el sitio P se va a traslocar al sitio E (salida). El tRNA que ocupaba el sitio A ahora se encuentra en el sitio P. el sitio A está ahora abierto y listo para recibir otro tRNA. El sitio A tiene que volver a ser cargado, por lo que vuelve a participar el EF-Tu. Entra el ARNt cuyo anticodón sea complementario al codón del sitio A.
El proceso se repite continuamente hasta que en el sitio A hay un codón de terminación.
EF-Tu = EF1A EF-G = EF2 Ribozima =rRNA23S 3. TERMINACIÓN El ribosoma para de añadir nucleótidos cuando encuentra un codón de terminación: UAA, UAG o UGA. Estos codones no tienen tRNA que reconozca los codones de terminación. En su lugar entran factores de terminación: RF1 (UAA o UAG) o RF2 (UAA o UGA). Además encontramos RF3. Los factores de liberación son proteínas con estructura similar al tRNA de manera que cuando el ribosoma llega a un codón de terminación no reconocido por ningún tRNA los factores de liberación se unen al codón junto con RF3-GTP. Este último hidrolizará GTP y se utiliza la energía para romper el enlace entre la cadena polipeptídica y el tRNA del sitio P. Se separan las subunidades ribosomales y estará disponible para llevar a cabo otra traducción.
EUCARIOTAS 1. INICIACIÓN En el caso de eucariotas no hay ninguna secuencia en el mRNA que sirva de reconocimiento del ribosoma. Hay dos mecanismos de iniciación: - 5’cap-dependiente. El ribosoma reconoce el extremo 5’-m7G-cap y se desplaza por el mRNA hasta encontrar el codón AUG iniciación.
Posteriormente se produce la unión de la subunidad mayor del ribosoma. El codón AUG de iniciación se localiza en el interior de la secuencia Kozak (5’ACCAUGG-3’). La secuencia Kozak tiene el codón de iniciación, una purina después del codón y otra purina en posición -3. De todas las posibles combinaciones dentro de la secuencia consenso la más extendida es: ACCAUGG.
- 5-cap-independiente. Existen secuencias internas en el mRNA que permiten la unión directa de la subunidad ribosomal 40S (IREs). A partir de ahí se busca el primer codón UAG. Se descubrió en picornavirus.
En determinadas células, como el virus de la hepatitis C, no aparece un extremo 5’cap. Existen sitios internos (IREs) donde se puede iniciar la traducción independiente de cap. Estos sitios están en medio de una secuencia. En este caso el ribosoma se une a un IRE en concreto. Todavía no se conoce muy bien el mecanismo de reconocimiento por los ribosomas. Son necesarios los mismos factores que en la traducción dependiente del sitio cap. Debe haber al lado del IRE estructuras secundarias para el reconocimiento, además de la secuencia Kozak.
En eucariotas existen 9 factores de iniciación. La traducción comienza con las dos subunidades ribosomales separadas gracias a factores de iniciación: eIF3 unido a la subunidad 40S y eIF6 unido a la subunidad 60S.
A la unidad ribosomal pequeña se une en primer lugar eIF1A y posteriormente eIF2-GTP-Met-tRNAiMet. Toda esta estructura forma el complejo de preiniciación.
El mRNA se une a un complejo de proteínas, el eIF4 (eIF4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B), por el extremo 5’cap (eIF4E es la que se une directamente a la parte metilada). De este modo el mRNA podrá unirse al complejo de preiniciación por la unión de eIF4G al eIF3 y formar el complejo de iniciación.
El complejo de iniciación debe buscar el primer codón AUG. Para el desplazamiento del ribosoma a lo largo del mRNA deben deshacerse las estructuras secundarias de este gracias al eIF4A (actividad helicasa). El rastreo (scanning) necesita de la energía del eIF2-GDP +Pi y ATP. También debe producirse la liberación de los factores eIF1A, eIF3 y el complejo eIF4. Este rastreo se detiene cuando el anticodón tRNAiMet reconoce el codón de inicio (primer codón AUG hacia abajo del extremo 5’). Cuando se localiza el codón AUG (en el interior de la secuencia Kozak) se une la subunidad 60S-eIF6 y se produce la liberación del factor eIF6 y la hidrólisis del eIF5-GTP. eIF5-GTP también se encarga de asegurar que el proceso anterior se ha llevado a cabo correctamente.
En ocasiones la secuencia consenso de la secuencia Kozak no es tan buena, por lo que se produce leakky scanning: el ribosoma continúa con el scanning hasta que encuentra otro UAG. Este proceso lo utilizan sobre todo los virus para formar proteínas estructurales; estas son diferentes dependiendo del scanning (unas comienzan su traducción en el primer codón AUG y otras en el siguiente, dando lugar a dos proteínas de diferente longitud).
2. ELONGACIÓN Consiste en la adición de aa a la cadena polipeptídica. El Met-tRNAiMet se localiza en el sitio P del ribosoma. Entra un complejo ternario, EF1A o EF1α, unido a GTP y al tRNA correspondiente al anticodón del sitio A. Se produce la hidrólisis de EF1A, liberando la energía necesario para producir un cambio conformacional en el ribosoma que hace que el aa-tRNA se una fuertemente al sitio A y se disponga de manera que los extremos 3’ de los dos tRNA se acerquen mucho para formar el enlace peptídico (carboxilo terminal de un aa y el extremo Ntermial de otro, con liberación de agua). Esta unión esta mediada por un rRNA 28S de la subunidad mayor del ribosoma (=ribozima peptidil transferasa). La energía se consigue del enlace rico en energía que une el tRNA con el aa. Una vez ocurrido esto entra EF2GTP a la vez que el ribosoma se une sobre el mRNA la distancia de un codón. Este movimiento es posible gracias a la hidrólisis del GTP de EF2. Este movimiento implica además que el tRNA sin aa pase del sitio P al sitio E, y el tRNA con el dipeptido pase del sitio A al sitio P. De esta manera el sitio puede comenzar de nuevo.
3. TERMINACIÓN El ribosoma para de añadir nucleótidos cuando encuentra un codón de terminación: UAA, UAG o UGA. Estos codones no tienen tRNA que reconozca los codones de terminación. En su lugar entran factores de terminación: eRF1 en eucariotas y eRF3. Los factores de liberación son proteínas con estructura similar al tRNA de manera que cuando el ribosoma llega a un codón de terminación no reconocido por ningún tRNA los factores de liberación se unen al codón junto con eRF3-GTP. Este último hidrolizará GTP y se utiliza la energía para romper el enlace entre la cadena polipeptídica y el tRNA del sitio P. Se separan las subunidades ribosomales y estará disponible para llevar a cabo otra traducción.
En eucariotas sobre todo es imprescindible que la traducción vaya bastante rápido.
Para ello hay dos mecanismos: - El mRNA se traduce simultáneamente por varios ribosomas produciendo múltiples copias de la proteína.
- Los ribosomas se deben reutilizar muy rápidamente. Para ello los extremo 5’cap y el extremo3’ se localizan muy cerca gracias a bucles o estructuras circulares formados en la cadena de mRNA (polisomas o polirribosomas).
Esta aproximación se produce gracias a la unión de las proteínas PABP1 de la cola de poliA y IF4G.
Modelo de control de poliadenilación citoplasmática e iniciación de la traducción. En ovocitos inmaduros los mRNA que contienen el elemento de poliadenilación ciroplásmico rico en U (CPE) tienen colas de poliA cortas. La proteína de unión a CPE (CPEB) media la represión de la traducción a través de la unión con eIF4E (por medio de maskin), las cuales evitan el ensamblaje de un complejo de iniciación en el extremo 5’. La estimulación hormonal de los ovocitos activa una proteinquinasa que fosforila CPEB, haciendo que libere la maskin. El factor de especificidad de corte y poliadenilación (CPSF) se une luego al sitio de poliA e interactúa tanto con CPEB unidad como con PAP. Se alarga la cola de poliA y se unen varias copias de PAPBI. Estas podrán interaccionar con eIF4G que participa con otros factores de iniciación para unir la subunidad ribosómica 40S e iniciar la traducción.
ELONGACIÓN-TERMINACIÓN ALTERNATIVA Estos procesos se producen en un número minoritario de genes. Estos genes requieren que las reglas de decodificación se alteren temporalmente. Estas alteraciones se producen por señales en el mRNA (no se deben a mutaciones).
Son procesos programados por instrucción en el mensajero. Son tres tipos de proceso: 1. Redefinición de codones sin sentido. Codificación traduccional del aa selenocisteína.
2. Cambios de pauta de lectura +1 y -1.
3. Saltos traduccionales en cis.
Son un tipo de regulación en cis: están mediadas por partes de la misma molécula.
REDEFINICIÓN DE CODONES SIN SENTIDO Es una variación importante en el código genético que se produce cuando tiene que tener lugar la síntesis de proteínas que contienen selenocisteína (UGA) o pirrolisina (UAG).
Estos aa están codificados por codones que en condiciones normales son codones de paro.
La pirrolisina es un aa que aparece en proteínas de arqueas. La selenocisteína aparece en gran número de proteínas (glutatión peroxidasa).
SELENOCISTEÍNA La selenocisteína se sintetiza a partir de la serina. El proceso de síntesis comprende las siguientes fases: 1. Activación de la serina dando lugar a Ser-tRNASec.
2. Fosforilación de hidroxilo de la serina para dar lugar a fosfoseril-tRNASec.
Esta reacción esta catalizada por fosfoseril tRNASec quinasa emplea ATP como sustrato para llevar a cabo la fosforilación de la serina.
3. Formación de selenofosfato. Este se forma por acción de la enzima selenofosfato sintetasa que utiliza ATP para transferir el grupo fosfato.
4. Formación de Sec-tRNASec. Condensación del selenofosfato con el fosfoseril-tRNA en una serie de reacciones catalizadas por la selenocisteína sintasa. Esta enzima utiliza como coenzima PLP (piridoxal fosfato).
En bacterias no interviene la fosfoseril-tRNASec quinasa. Sobre la serina activada se une el selenofosfato para formar Sec-tRNASec.
La incorporación de selenocisteína se produce durante el proceso de traducción.
Para la incorporación se requiere: - La secuencia SECIR. Esta secuencia se localiza en el extremo 3’UTR de eucariotas e inmediatamente después del codón codificante en procariotas.
La presencia de esta secuencia hace que el ribosoma no considere el codón como un codón de paro, sino que permita la incorporación de selenocisteína.
Esta secuencia forma apareamientos de bases tallo-bucle no canónicos.
- Proteína SBP2 (proteína de unión a SECIR). Reconoce la secuencia SECIR y se une a ella.
- Factor de elongación específico de selenocisteína (eEFsec).
- La selenocisteína en forma de selenocisteinil-tRNA.
Se forma un complejo entre la proteína SBP2 y la secuencia SECIR que permite el reclutamiento de eEFsec.
Este factor de elongación atrae al selenocisteinil-tRNA y lo posiciona en el ribosoma en el sitio A.
CAMBIOS EN LA PAUTA DE LECTURA El marco de lectura de un mRNA lo marca el codón de inicio. Este tipo de errores son muy pequeños (5x10-5) a la hora que el ribosoma lee el mRNA. Un cambio en el marco de lectura produce proteínas diferentes.
Hay determinadas secuencias o estructuras que hacen que el ribosoma se detenga y cambie el marco de lectura: el ribosoma retrocede (-1) o avanza un nucleótido (+1). Estas secuencias están formadas por: - Secuencias de deslizamiento. Formadas por 7 nucleótidos.
- Estructuras estimuladoras. Son estructuras secundarias en el RNA (tallos, bucles, horquillas, pseudonudos,…).
- Secuencia espaciadora. Entre las secuencias de deslizamiento y las estructuras estimuladoras.
Traducción de la RNA polimerasa dependiente de RNA en coronavirus.
En el sitio P tenemos el peptidil-tRNA y en el sitio A el aa-tRNA correspondiente.
El ribosoma alcanza la secuencia de deslizamiento y se detiene debido a la estructura presente de la estructura estimuladora. El peptidil-tRNA y el aa-tRNA se desprenden y retroceden una base de tal manera que el anticodón AAU apareado antes con UUA, se aparea ahora con UUU. El codón UUG apareado antes con AAC, se aparea ahora con AAA.
El ribosoma continuará leyendo en el nuevo marco de lectura hasta alcanzar un codón de terminación.
 Cambio en la pauta de lectura en el mRNA de dnaX.
Este codifica dos subunidades de la DNApol III de E.coli (subunidad τ y ϒ). La secuencia de deslizamiento está formada por 6A y 1G. El ribosoma llega hasta la secuencia de deslizamiento donde se para gracias a la estructura secundaria y retrocede un nucleótido. De este modo se inicia un nuevo marco de lectura. Este cambio en el marco de lectura provoca la síntesis de una proteína más corta, pues aparece un codón de paro.
Hay muy pocos casos de cambios en el marco de lectura +1.
SALTOS TRADUCCIONALES EN CIS Permiten fusionar la información contenida en dos marcos de lectura dentro de un mismo mRNA.
El ribosoma va leyendo hasta cierto punto donde el ribosoma salta 50 nucleótidos donde inicia de nuevo la incorporación de nucleótidos en un segundo marco de lectura. Se dice que este proceso es muy similar al proceso de despegue de un avión, vuelo y aterrizaje.
Se requiere que los codones localizados en los extremos del a región que se salta sean idénticos o reconocidos por el mismo tRNA (hipótesis de tambaleo). Uno de los codones actúa como sitio de despegue y otro como sitio de aterrizaje. Se requiere además un codón de terminación en el extremo 3’ del primer marco de lectura que se localiza en una estructura secundaria tallo-bucle. Es necesaria una región en el péptido naciente con aa cargados. El peptidil-tRNA se encuentra sobre el codón de despegue; a continuación tenemos un codón de paro. Debido a la estructura tallo-bucle el ribosoma no puede decodificar el codón de paro. La región del péptido con aa cargado facilita el desapareamiento del peptidil-tRNA-mRNA. El tRNA escanea el mRNA hasta localizar en el sitio P el codón de aterrizaje. En el sitio A entra el aa-tRNA correspondiente, se produce la formación del enlace peptídico y la traducción continúa.
Ej.: puenteo en la traducción en el mRNA del gen 60 del bacteriófago T4. Este gen codifica una subunidad de la DNA topoisomerasa.
SALTOS TRADUCCIONALES EN TRANS En la regulación en trans intervienen moléculas externas. Para que termine la traducción es necesario un codón de paro en el sitio A del ribosoma. Para la liberación del ribosoma son necesarios factores de liberación.
Cuando un mRNA carece de codón de terminación (ha sido degradado por nucleasas o la traducción ha sido incompleta) se produce la traducción hasta el final de la molécula de mRNA. Llega un momento en el cual en el sitio A no encontramos ningún codón. En bacterias la liberación del ribosoma puede llevarse a cabo gracias a la unión del RNA de tranferencia y mensajero (tmRNA, RNA 10Sa, SSrA) al sitio A.
Este RNA presenta dos dominios activos: un dominio similar al tallo aceptor del tRNA formado por el plegamiento de los extremos 3’ y 5’; y un dominio con un codón de terminación y un marco de lectura abierto que permite la síntesis de un polipéptido de 10aa. Este tmRNA también puede cargarse con alanina ya que es reconocido por la alanil-tRNA sintetasa aunque no presenta anticodon.
El tRNA cargado con alanina es reconocido por EF-Tu-GTP y lo dirige al sitio A del ribosoma. Una vez colocado, EF-Tu se desprende por la hidrólisis de GTP. En el sitio P encontramos el peptidil-tRNA; en el sitio A el tmRNA cargado con alanina.
El aa entrante ataca al polipéptido en crecimiento dando lugar a la incorporación de alanina a la cadena polipeptídica. Tras la incorporación de la alanina a la cadena en formación la parte del tmRNA que actúa de mensajero se introduce en el canal del mRNA de tal manera que en el sitio A tenemos un codón. Así puede incorporarse un aa-tRNA correspondiente. Esto sucede hasta el codón de paro del tmRNA. Estos 10 aa marcan la proteína como proteína no funcional para que las proteasas celulares la degraden.
Permite degradación de proteínas y recupera proteínas. En el proceso normal no entra debido a su gran tamaño fundamentalmente.
VIDA MEDIA Y DEGRADACIÓN PROGRAMADA DE MENSAJEROS Es un punto de control de la transcripción de mRNA. Hay regulación a nivel de: - La transcripción génica. (núcleo) - La elongación/procesamiento del mRNA. (núcleo) - Transporte del núcleo al citoplasma.
- La localización de los mRNAs.
- La traducción del mRNA.
- La degradación del mRNA.
La vida media de los mRNA bacterianos oscila en torno a los 3 minutos (muy inestables). Esto le permite a la bacteria adaptarse a los distintos ambientes.
En el caso de mRNA eucarióticos, la vida media está en torno a 10 horas (más estables). Esta estabilidad se debe a que los organismos eucariotas viven en ambientes bastante estables, donde llevan a cabo funciones que ejercen durante días, meses e incluso durante toda la vida. Dentro de los organismos eucariotas hay mRNA con una vida media de unos 30 minutos. Estos RNA suelen codificar proteínas reguladoras cuya síntesis se requiere en momentos puntuales y durante un corto periodo de tiempo. Entre estas proteínas tenemos: factores de crecimiento, citoquinas, factores de transcripción (c-fos y c-jun). La síntesis de una proteína y la degradación del mRNA son procesos altamente vinculados. Para la degradación del mRNA son necesarias secuencias específicas (factores que actúan en cis) del propio mRNA. A los factores que actúan en cis, se podrán unir factores que actúan en trans.
VÍA DE DEGRADACIÓN DE mRNAs EN EUCARIOTAS 1. MEDIADA POR CODONES SIN SENTIDO En primer lugar se produce la eliminación del extremo 5’. Una vez eliminada la caperuza, se produce la degradación exonucleolítica desde el extremo 5’3’.
Esta vía es una vía de vigilancia, que nos permite eliminar mRNA procesados incorrectamente. Un mRNA mal procesado, puede ser traducido en una proteína perjudicial para la célula; por ello, es necesario eliminarlos. En el mRNA mal procesado tenemos codones de terminación prematuros.
La determinación de estos mRNA con codones de terminación prematuros se puede realizar gracias a la situación del primer codón de terminación con respecto al último sitio de empalme exón-exón.
- Si el codón de terminación se sitúan hacia 3’ desde el último sitio de empalme exón-exón (por debajo) el mRNA está procesado correctamente, y no sufre este tipo de degradación.
- Si el primer codón de paro se sitúa por encima del último sitio de empalme exón-exón (hacia 5’) el mRNA estará mal procesado. Se procederá a su degradación.
Conforme el ribosoma lee el mRNA los EJC se van desplazando. Cuando aparece un codón de terminación prematura, el ribosoma se detiene al llegar al codón de terminación. El siguiente(s) complejo de unión exónica no se liberan, y las proteínas Upf (1, 2 y 3) son reclutadas por el ribosoma. Estas proteínas facilitan la activación de la enzima eliminadora de capuchón y promueven la disociación del ribosoma.
Esta, es un complejo formado por las enzimas Dcp1 y Dcp2.
Cuando se elimina la caperuza, el mRNA se degrada. La presencia de un P en el extremo5’ permite la actuación de las exonucleasas 5’3’.
Ocurre solo en el citoplasma??. Para eliminar el mRNA es necesario que se produzca la traducción.
2. MEDIADA POR LA FALTA DE CODONES DE TERMINACIÓN Es también un sistema de vigilancia. El mRNA va a traducir hasta el final.
Cuando el ribosoma llega hasta el extremo final de la cola de poliA se detiene, de tal manera que se recluta el exosoma. Este es un complejo proteico formado por, al menos, 10 exonucleasas dispuestas formando un cilindro en cuyo interior se localiza en centro catalítico. Estas exonucleasas degradan el mRNA en sentido 3’5’.
La exonucleasa Ski7 promueve la disociación del ribosoma. Tras la disociación del ribosoma el exosoma comienza a degradar el mRNA.
La proteína que se obtiene de la traducción de este mRNA es una proteína anormal con múltiples residuos de lisina. Estas proteínas son sustratos de proteasas. El exosoma lo podemos encontrar tanto en el núcleo como en el citoplasma. Para eliminar el mRNA es necesario que se produzca la traducción.
3. DEPENDIENTE DE DESADENILACIÓN No es una vía de vigilancia. Es la vía más utilizada por los mRNA procesados correctamente. Cuando determinadas secuencias son reconocidas se procede a la degradación del mRNA.
En primer lugar, ocurre una reacción de desadenilación gracias a desadenilasas (CCR4, CAF1 y PARN –esta última sólo en mamíferos-). La cola de poliA una vez acortada no puede tener una longitud mayor de 30 nucleótidos.
Tras el acortamiento de la cola de poliA, el mRNA puede seguir dos vías: - Eliminación del capuchón y posterior degradación exonucleolítica 5’3’.
Las proteínas PABPI permiten la circularización del mRNA y lo protege de exonucleasas que podrían atacar la cola de poliA. Cuando se acorta la cola de poliA, se restringen los sitios a los cuales se puede unir PABPI, desestabilizando la estructura circular. Así, se favorece la eliminación de la caperuza 5’. Para eliminar el capuchón se requiere un complejo formado por dos enzimas: Dcp1 y Dcp2. Estas son enzimas liberadoras del capuchón que degradan la caperuza separándola del resto del mRNA. Al separar la caperuza, aparece un P en el extremo 5’ sobre el cual pueden actuar las exonucleasas 5’3’.
- Degradación exonucleolítica 3’5’ y eliminación del capuchón. Una vez acortada la cola de poliA interviene el exosoma. Este degrada el mRNA hasta alcanzar la caperuza unida a un nucleótido. La caperuza se unirá a DcpS para eliminar el nucleótido que permanece unido.
Las secuencias presentes en el mRNA determinará el uso de una vía determinada.
4. ESCISIÓN ENDONUCLEOLÍTICA Esta escisión es llevada a cabo por endorribonucleasas (= endonucleasas). Estas cortan el mRNA en sitios internos de la cadena. Para ello, las enzimas deben reconocer una secuencia de escisión endonucleolítica que suele localizarse en 3’UTR. Tras el corte se generan dos fragmentos. Para seguir degradando el mRNA intervienen exonucleasas, tanto 5’3’ como 3’5’. Dgps suele degradar la caperuza una vez degradado el mRNA.
ELONGACIÓN CITOPLASMÁTICA DE LA COLA DE POLI-A En determinadas situaciones la cola de poliA puede alargarse en el citoplasma. Este es el caso de los oocitos inmaduros. Estas células tienen la vía de degradación del mRNA un tanto deshabilitada, de tal manera que acumulan mRNAs cuya cola de poliA no tengan más allá de 30A. Cuando los residuos de adenilato son tan pocos la traducción no se produce ya que disminuye el número de sitios de unión de PABPI.
Esta proteína es necesaria para interaccionar con la caperuza.
Cuando el oocito es maduro se van a necesitar proteínas codificadas por esos mRNAs. Para poder traducirlos es necesario alargar la cola de poliA, permitiendo la estabilización del complejo de iniciación.
ELEMENTOS ACELERADORES DEL ACORTAMIENTO DE POLI-A Y ELIMINACIÓN DEL CAP La vida de los mRNA en eucariotas suele ser prolongada. Ciertos mRNA tienen una vida media muy corta.
La corta vida media se debe a la presencia de secuencias estabilizadoras o desestabilizadoras en el mRNA. Estas se localizan generalmente en el extremo 3’UTR. A estas secuencias se unen proteínas que determinan si el mRNA va a ser degradado o a estabilizar. Por lo general estas proteínas inducen la degradación de mRNA.
Entre las secuencias, podemos destacar la secuencia ARE (elementos ricos en AU).
En esta secuencia encontramos múltiples copias de AUUUA. Las proteínas que se unen a las secuencias ARE (ARE-BP) tienen capacidad de interaccionar con desadenilasas (=poliA nucleasa) y activarlas. También pueden interaccionar con: - El complejo eliminador de la caperuza activándolo y permitiendo que una endonucleasa (Xrn1) degrade el mRNA en sentido 5’3’.
- El exosoma gracias al reconocimiento de alguna de las subunidades de este por parte de las ARE-BP. Una vez eliminada la cola de poliA el exosoma comienza a degradar en sentido 3’5’. Cuando llega a la caperuza interviene DcpS para degradarla.
Una de las desadenilasas presente en mamíferos es PARN. La proteína ARE-BP reconoce la secuencia ARE interaccionando con la desadenilasa. Tras la interacción se recluta el exosoma gracias al reconocimiento de la subunidad PM-Scl75 del exosoma por ARE-BP. Al reclutarse el exosoma, se produce un cambio coformacional que provoca la desestabilización del complejo de inicio. Al desestabilizarse esta estructura, la desadenilasa puede interaccionar con la caperuza activándose. Al activarse puede comenzar a eliminar la cola de poliA. Tras la desadenilación el exosoma se activa y comienza a degradar el mRNA en sentido 3’5’.
MENSAJEROS DE HISTONAS DURANTE EL CICLO CELULAR La unión de histonas a la cromatina forma el nucleosoma. El nucleosoma para duplicarse necesita de la duplicación del DNA y del ensamblaje de nuevas proteínas histonas. La duplicación del DNA y la expresión de genes de histonas están coordinadas. De acuerdo con esto se puede decir que ambos procesos se producen en la fase S del ciclo celular. La degradación de los mensajeros de histonas se produce al final de la fase S del ciclo celular.
Los mRNA de las histonas carecen de cola de poliA. Para evitar que se degraden presentan en su lugar una estructura en horquilla que funciona de manera similar a la cola de poliA. Las proteínas HBP/SLBP contribuyen a estabilizar esta horquilla. A esta proteína se une la proteína SLIP1 que permite la interacción con la caperuza y la circularización del mRNA: se une a eIF4G, que se une a eIF4E unido a la caperuza.
Para la degradación de estos mRNAs debe actuar en primer lugar una enzima llamada TUTasa. Esta añade una cola de poliUal extremo 3’ del mensajero a degradar. Esta cola de poliU es sitio de reconocimiento para el complejo proteico Lsm1-7 que activa a las enzimas eliminadoras de la caperuza (Dcp1/2). La caperuza se elimina y el extremo 5’ queda libre para la acción de la exonucleasa 5’3’ (Xrn1).
También es posible que el exosoma intervenga en la degradación de estos mRNAs degradando en sentido 3’5’.
PLEGAMIENTO, MODIFICACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN LA CÉLULA EUCARIOTA Las proteínas se sintetizan en los ribosomas libres del citosol. Algunas de estas proteínas pueden ser transportadas junto con el ribosoma a la mb del RER gracias a una secuencia de señalización. Después la traducción de estas proteínas se completa sobre el RE. Algunas de ellas se quedarán allí, mientras otras son transportadas al AG donde serán procesadas. Algunas quedarán en él y otras se transportaran a la mb plasmática o lisosomas (vía secretora).
Hay proteínas que se sintetizan en ribosomas libres y así finaliza su traducción.
Una vez liberada la proteína, si no contiene ninguna secuencia de direccionamiento permanece en el citosol; si posee secuencias de direccionamiento a orgánulos serán transportadas hasta ellos (mitocondria, cloroplastos, peroxisomas, núcleo).
Entre los péptidos señal o secuencia señal podemos encontrar: VÍA DE CLASIFICACIÓN DE RE-AG 1. RETÍCULO ENDOPLÁSMICO Las secuencias de envío al RE están constituías por 20-50 aa. Los podemos encontrar en el extremo N-terminal o en el interior de la proteína. Son secuencias que contienen segmentos formados por entre 5-10 aa hidrofóficos. La deleción/sustitución de estos aa lleva a que la secuencia no sea reconocida.
Cada orgánulo posee un conjunto de proteínas receptoras que sólo se unen a tipos específicos de secuencias de señalización, lo que asegura así que la información codificada en una secuencia de señalización determina la especificidad del direccionamiento.
En el momento en que sale del ribosoma la secuencia de señalización es reconocida por el complejo ribonucleoproteico SRP (partícula de reconocimiento de la señal).
Está constituida por 6 proteínas y una molécula de scRNA (300 nucleótidos). Es capaz de reconocer la subunidad mayor del ribosoma y unirse a ella a través de la secuencia señal y a nivel entre la interfase de la subunidad ribosómica mayor y la menor. Como consecuencia la síntesis se detiene temporalmente: se bloquea la unión del factor de elongación.
Todo el complejo es llevado hasta la mb del RE, donde se localizan receptores para la partícula SRP. Estos receptores son proteínas integrales de mb formados por dos subunidades: α y β. Estos receptores tienen capacidad para unir GTP y para disociarlo (GTPasa). Cuando estos receptores tienen unido GTP tienen afinidad por la partícula SRP, uniendo la partícula SRP asociada al ribosoma que porta la cadena polipeptídica en crecimiento.
Como consecuencia se produce la atracción de una proteína receptora del ribosoma (=riboforina o translocón). Esta proteína es un complejo proteico formado por tres subunidades: Sec61 α, β y ϒ. El translocón reconoce la subunidad mayor del ribosoma a la cual se une. Al unirse a la subunidad el canal del complejo proteico se abre, hidrolizando el GTP que porta el receptor. Así, el receptor pierde la afinidad por la proteína SRP, de tal manera que se disocia del complejo.
La cadena polipeptídica en crecimiento comienza a atravesar el canal.
Inmediatamente después de que la secuencia señal salga del translocón es reconocida, gracias el extremo carboxilo terminal de la secuencia, por una peptidasa de señal y que lo corta. Una vez finalizada la traducción, toda la maquinaria de traducción se libera. Tras la liberación el traslocón se cierra.
Estas proteínas recién sintetizadas en el RE no son funcionales. Para ello es necesario: - Agregarles HC en un proceso conocido como glicosilación.
- Plegarse y asociarse (en el caso de varias subunidades).
- Formación de puentes disulfuro.
- Degradación proteolítica.
1.1.
N-GLICOSILACIÓN Se transfiere un oligosacárido común formado por 14 monosacáridos. Este oligosacárido se transfiere al grupo amino de la cadena lateral del aa asparragina.
Este oligosacárido se sintetiza en la mb del RER añadiendo monosacáridos al dolicol-P. Para esta unión los monosacáridos deben estar activados, es decir, unidos a un nucleótido (en el citosol). El primer monosacárido (glucosamina) forma un enlace pirofosfato con el dolicolP. Seguidamente, al monosacárido unido en primer lugar se une otro monosacárido glucosamina, y posteriormente otros 5. En ese momento se produce la traslocación de modo que los monosacáridos paran al lumen del RE. Seguidamente se unen 4 monosacáridos más y finalmente los tres restantes. Cuando se han incorporado los 14 monosacáridos la enzima oligosacaril transferasa que está asociada con el traslocón (3 subunidades). La subunidad que posee el centro catalítico se orienta hacia el interior del RE de tal manera que inmediatamente después de que la cadena polipeptídica abandona el translocón la enzima transfiere el oligosacárido en bloque.
Las enzimas que residen en el citosol no pueden glicosidarse porque la enzima responsable se sitúa hacia el lumen. Una vez transferido el oligosacárido completo se eliminan por lo menos 3 residuos de glucosa. También se puede producir la pérdida de un residuo de manosa. Se cree que el hecho de añadir los tres residuos de glucosa que luego se eliminarán actuarían de señal para indicar que el oligosacárido se ha sintetizado correctamente.
Secuencias topogénicas Las secuencias topogénicas son secuencias que determinan donde deben insertarse las proteínas integrales de mb.
La topología hace referencia al número de veces que una proteína atraviesa la mb plasmática. La aparición en la proteína de secuencia de aa hidrofóbicos determina el número de veces que las proteínas integrales atraviesan la mb. En el interior de la mb estos segmentos forman hélices α que atraviesan la mb.
Según la topología las proteínas se clasifican en 4 clases topológicas: - Tipo I. Atraviesan una sola vez la mb. Contienen un péptido señal en el extremo N-terminal. Son por tanto reconocidas por la partícula SRP y llevadas a la mb del RE. En la mb del RE SRP interacciona con su receptor. El ribosoma es reconocido con el translocón y se produce la apertura del translocón. Continúa la síntesis proteica. La secuencia de señalización una vez entra en la luz del RE es cortada por una peptidasa de señal. Se sigue sintetizando hasta que dentro del translocón aparece la secuencia de detención de transferencia-anclaje. El translocón cambia de forma y se abre hacia la mb, donde queda insertada la secuencia hidrofóbica. Tras la inserción el translocón se cierra y el ribosoma sigue alargando. La cadena polipeptídica puede formar un bucle entre el espacio que queda entre el translocón y el ribosoma.
- Tipo II. Atraviesan la mb una sola vez pero carecen de secuencia señal en el extremo N-terminal. El extremo amino terminal se orienta hacia el citosol.
La secuencia señal se localiza en el interior de la cadena polipeptídica de manera que la proteína SRP reconoce la cadena polipeptídica una vez sintetizada. El translocón reconoce y se une al ribosoma y se abre el translocón e inserta en su interior la secuencia de señalización-anclaje. El extremo N-terminal aparece hacia el citosol. Se apunta que cuando hacia el extremo N-terminal al lado de la secuencia de señalización el número de aa cargado positivamente es mayor que el número de aa cargado positivamente al otro lado de la secuencia aparece hacia el exterior. Se produce un cambio conformacional en el translocón que hace que este se abra hacia la mb e inserta la secuencia topológica en el interior de la mb. El ribosoma continúa alargando. Por detrás de la secuencia topológica la cadena polipeptídica entra en la luz del RE.
- Tipo III. Igual que las de tipo II. El extremo amino terminal se orienta hacia la luz del RE. Igual que el anterior. El número de aa cargado positivamente adyacentes a la secuencia topológica hacia el C-terminal es mayor que el número de aa cargados positivamente adyacentes a la secuencia topológica hacia el extremo N-terminal.
- Tipo IV. Atraviesan múltiples veces la mb del RE. Ej.: receptores con siete dominios transmembrana (receptores acoplados a proteínas G).
Encontramos secuencias de inicio, que permiten el paso del polipéptido a través del translocón hacia la luz del RE, y secuencias stop, que impiden que el polipéptido pase al citosol.
1.2.
PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS Este proceso se produce cuando el polipéptido abandona el ribosoma, cuando se han incorporado unos 30 aa. La mayoría de las proteínas necesitan de proteínas accesorias para poder plegarse, pues se alcanzan estados altamente energéticos durante el plegamiento. Un ejemplo de estas proteínas son las chaperonas.
La proteína Hsp70 lleva a cabo la mayoría del plegamiento de proteínas en eucariotas. Esta proteína une ATP y tiene actividad ATPasa. La chaperona unida a ATP se une a las regiones hidrofóbicas de las cadenas polipeptídicas para evitar agregados de proteínas. Facilita la asociación entre distintas partes del polipéptido, asociación que necesita energía.
La chaperona Hsp40 se une a la cadena polipeptídica y a la Hsp70 estimulando la actividad ATPasa de la proteína Hsp70. Como consecuencia se hidroliza ATP, cuya energía se utiliza para el plegamiento. La proteína Hsp70 unida a ADP pierde la afinididad por la cadena polipeptídica y por tanto se libera.
Para poder reutilizarla es necesario cargarla con ATP gracias a la proteína GrpE.
Así, es capaz de iniciar un nuevo ciclo.
Las chaperonas Hsp60 y Hsp10 se utiliza sobre todo en bacterias, aunque también algo en eucariotas. La Hsp60 está formada por 2 anillos (7 subunidades cada una) que se disponen formando una especie de barril con una cavidad en su interior. En su interior se introduce la cadena polipeptídica a ser plegada. Una vez introducida, se une el ATP (7x) y se producen una serie de cambios conformacionales que hacen que Hsp10 se asocie a la parte superior de la Hsp60. Es ahí, donde tiene lugar el plegamiento gracias a la interacción del ATP con las subunidades de la Hsp60.
1.3.
FORMACIÓN DE PUENTES DISULFURO Los puentes disulfuro ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternario de muchas proteínas. Estos enlaces se forman por enlace oxidativo de grupos sulfhidrilo, existentes en dos residuos de cisteína de la misma o diferentes cadenas polipeptídicas. Esta reacción la lleva a cabo la enzima disulfuro isomerasa y necesita de una molécula con grupos tiol en estado oxidado (ej.: glutatión oxidado). Los grupos sulfhidrilo de la proteína se oxidan mientras la proteína recibe H y se reduce.
2. APARATO DE GOLGI 2.1.
O- GLICOSILACIÓN Se produce exclusivamente en el AG. Los azúcares se unen a un grupo hidroxilo del aa serina o treonina. En general el primer aa que se añade es Nacetilgalactosamina. Como mínimo se unen 10 monosacáridos, a partir de ahí, los que sean. Es una reacción catalizada enzimática por una glicosiltransferasa. Los azúcares deben estar activados (unidos a nucleótidos) para poder unirse a la proteína.
En el AG también se producen otra serie de modificaciones a las proteínas que llegan al RE. Entre estas encontramos: fosforilaciones, eliminación/adición de ciertos monosacáridos, sulfatación, adición de HC,….
2.2.
TRANSPORTE VESICULAR La síntesis de proteínas portadoras de una secuencia indicadora para el RE se completa sobre el RER y las cadenas polipeptídicas recién sintetizadas se insertan en la mb del RE o la atraviesan hacia la luz. Algunas proteínas, permanecen dentro del RE. Las restantes son envueltas dentro de vesículas de transporte que brotan desde el RE y se transportan hasta la región cis del AG. Estas proteínas avanzan hacia la cara trans. Si deben sufrir modificaciones en la región trans, pero pertenecen a la cis, volverán para quedarse.
Las que llegan a la red trans del AG pueden seguir tres vías: - Vía de secreción regulada. Las proteínas se empaquetan en vesículas secretoras que permanecen en el citosol hasta que una señal las hace desplazarse hasta la mb plasmática, fusionarse con ella y finalmente ser exocitadas al exterior. Ej.: insulina.
- Vía de secreción constitutiva: las proteínas se incorporan en el interior de vesículas exocitóticas que se desplazan hasta la mb plasmática donde se fusionan. Ej.: colágeno.
- Vía lisosomal: las proteínas se empaquetan en vesículas de transporte que se transpasón a un endosoma tardío que finalmente vierte su contenido a un lisosoma. Ej.: enzimas ácidas del lisosoma como la bomba de protones, proteasas,….
Gránulos de secreción y activación de pro-proteínas Las pro-proteínas son proteínas que se sintetizan de forma inactiva, sufren una escisión proteolítica para convertirse en proteínas activas. Una vez activadas y liberadas podrán ejercer su función.
Un ejemplo es la activación de precursores de hormonas peptídicas como es el caso de la insulina. La insulina se sintetiza en los islotes de Langerhans en las células beta del páncreas, como una molécula precursora, que es la pre-pro-insulina. Tiene una secuencia señal que permite que esta proteína se pueda a dirigir al RE, donde esta proteína termina su síntesis.
En el interior del RE se produce la formación de puentes disulfuro entre residuos de cisteína y la escisión de la secuencia señal de la pre-pro-insulina, dando lugar a la pro-insulina. Esta continúa siendo una forma inactiva de la insulina. Desde el RE la pro-insulina es transportada al AG donde sufre escisión proteolítica por acción de las endoproteasas PC2 y PC3, liberando el péptido C (afuncional) y la insulina.
La insulina está formada por una cadena A de 21 aa y una cadena B de 30 aa. Se encuentran unidas por puentes disulfuro. La insulina se empaqueta en gránulos de secreción que son activados en función de los niveles sanguíneos de glucosa.
Igual sucede con las enzimas digestivas: tripsina, quimotripsina, carboxipeptidasas A y B,…. Estas proteasas se sintetizan en el páncreas en forma inactiva (tripsinógeno, quimotripsinógeno y procarboxipeptidasas). Cuando el alimento llega al intestino se produce la liberación de colecistoquinina y secretina que se transporta al páncreas y estimulan la liberación de tripsinógeno, quimotripsinógeno y pro-carboxipeptidasas. Estas se vierten al intestino como jugo pancreático donde se activaran. El tripsinógeno pierde un fragmento y se transforma en tripsina que actúa sobre el quimotripsinógeno para transformándolo en tripsinógeno. Este actuara sobre las procarboxipeptidasas para formar carboxipeptidasas.
MODIFICACIONES COTRADUCCIONALES Y POSTRADUCCIONALES. CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL CITOPLASMA Las proteínas se están sintetizando en los ribosomas libres en el citosol. Algunas permanecerán en el citosol, mientras otras se transportan una vez sintetizadas a peroxisomas, cloroplasto, mitocondrias o el núcleo.
Para poder ser transportadas a los distintos orgánulos estas proteínas requieren de una secuencia señal de direccionamiento. Las proteínas que carecen de esta marca permanecerán en el citosol.
PROTEÍNAS ASOCIADAS A LA MEMBRANA PLASMÁTICA Algunas de las proteínas deberán asociarse a la membrana mediante la unión covalente de grupos hidrofóbicos como ácidos grasos (acilación) o terpenos (prenilación).
 Acilación. Se puede añadir: ácido mirístico (14C), palmítico (16C), esteárico u oleico (18C).
- Palmitoilación. El ácido palmítico se une a un residuo de cisteína de la proteína formando un enlace tioester. Ej.: rodopsina.
- Miristilación. El ácido mirístico forma un enlace ester con el extremo Nterminal de la proteína. Las proteínas que sufren miristilación suelen ser proteínas que intervienen en transducción de señales: serina quinasa, treonina quinasa, tiroxina quinasas, proteínas G,.....
 Prenilación. Se pueden adicionar: geranilo (10C), farnesilo (15C) o geranilgeranilo (20C).
- FarnesiloPP reacciona con la proteína ras (gracias a la enzima farnesil transferasa) para anclarse en la mb. Al anclarse en la mb la proteína activa una serie de señales intracelulares que desembocan en un fenotipo canceroso. La enzima de esta reacción se utiliza como diana terapéutica (inhibición su actividad).
PROTEÍNAS NUCLEARES Estas proteínas tienen en su estructura varias secuencias de direccionamiento. En el citoplasma, una importina libre se une a la secuencia de direccionamiento de una proteína carga y forma un complejo que fluye a través de complejo de poro nuclear (interacciones sucesivas con nucleporinas FG). En el nucleoplasma, la interacción de la importina con Ran-GTP provoca un cambio conformacional en la importina de modo que se provoca la liberación de la proteína cargada. El complejo importinaRanGTP vuelve al citosol donde podrán reciclarse ambas proteínas.
PROTEINAS MITOCONDRIALES Tanto mitocondrias como cloroplastos son orgánulos especializados en la obtención de ATP. Estos orgánulos tienen su propio DNA, ribosomas propios y otros componentes necesarios para la síntesis de proteínas. A pesar de producir sus propias proteínas requieren también de proteínas cuyos genes se encuentran codificados en el núcleo. Para ello, estas proteínas a importar requieren de secuencias de direccionamiento.
Las mitocondrias necesitan importar proteínas a la matriz mitocondrial, a la mb interna de la mitocondrial, al espacio intermembrana y a la mb externa. La secuencia de direccionamiento mejor conocida es la secuencia de direccionamiento a la matriz mitocondrial. Esta, es una secuencia de 20-50 residuos localizada en el extremo N-terminal. Es abundante en aa hidrofóbicos, hidroxilados (Ser, Thr), aa básicos cargados positivamente (Arg, Lys), pero carece de aa cargados negativamente (Asp, Glu).
Para dirigir proteínas a la matriz mitocondrial se requiere que las proteínas esten desplegadas, para lo cual se encuentran asociadas una serie de proteínas, como las chaperonas Hsc70 citosólicas. La proteína es reconocida por un receptor de importación (mb mitocondrial externa), produciendo la liberación de la chaperona.
Tras liberarse la chaperona, el receptor transfiere la proteína al translocón TOM o poro de importación general. Todas las proteínas pasan a través de él. Conforme la secuencia de direccionamiento alcanza el espacio intermembrana se une al translocón TIM provocando su apertura.
La apertura del translocón permite que la proteína comience a transportarse a la matriz.
Tan pronto como la secuencia de direccionamiento sale del canal es atacada por una proteasa de la matriz que la elimina.
Conforme pasa la proteína se van uniendo chaperonas Hsc70 de la matriz que provocan la hidrólisis de ATP. Esta energía, ayudada por la fuerza protón-motriz, impulsa el transporte de las proteínas a la matriz. Una vez en la matriz, la proteína adquiere su estructura tridimensional que le proporciona funcionalidad.
Algunas proteínas se pliegan espontáneamente, mientras otras requieren de proteínas para ello.
El transporte a la mb mitocondrial interno requiere de tres tipos de transporte: dos de ellos implican el transporte primero a la matriz y luego a la mb mitocondrial, y el otro directamente a la mb mitocondrial interna.
Al espacio intermembrana 2 tipos: uno implica la matriz y otro directamente a través de TOM.
PROTEÍNAS DE CLOROPLASTOS El transporte de proteínas al estroma de cloroplastos es un proceso similar al que se lleva a cabo para el transporte de proteínas a la matriz mitocondrial. Requiere: - De la proteína en estado desplegado, por la unión de Hsc70.
- Una secuencia de direccionamiento reconocida por un receptor localizado en la mb externa.
- Translocones (TOC y TIC). Similares en función pero no en estructura a los de mitocondrias.
Existen cuatro tipos de transporte a tilacoides.
PROTEÍNAS A PEROXISOMAS No contienen ribosomas ni ADN, por lo todas sus proteínas deben ser importadas.
Las proteínas poseen una secuencia de direccionamiento (PTS1) localizada en el extremo C-terminal. Se caracteriza por poseer los aa Ser, Lys y Leu.
Para su reconocimiento, no es necesario que las proteínas se encuentren desplegadas. La secuencia de direccionamiento de las proteínas es reconocida por el receptor citosólico Pex5. Este receptor, unido a la proteína, es reconocido por la proteína integral de la mb del peroxisoma Pex14. El complejo proteína-Pex 5 es transferido a un grupo de proteínas de membrana con función de translocón. En algún momento, bien durante o tras la translocación de la proteína a la matriz el receptor Pex5 vuelve al citosol. Una vez esta la proteína en la matriz del peroxisoma, la proteína no pierde la secuencia de direccionamiento.
Este proceso requiere energía procedente de la hidrólisis de ATP. Se desconoce cómo se utiliza la energía para transportar la proteína.
DEGRADACIÓN PROGRAMADA DE PROTEÍNAS SISTEMA PROTEASOMA-UBIQUITINA Degrada la gran mayoría de las proteínas citosólicas. El sistema está compuesto por el proteasoma 26S: formado por el proteasoma 20S y dos subunidades proteasoma 19S.
- Proteosoma 20S. Compuesto por 28 subunidades dispuestas en cuatro anillos: 2α situados en los extremos y dos β entre ellos. Cada uno de los anillos tiene 7 subunidades. La actividad catalítica reside en las subunidades β (β5 enlaces peptídicos en el que participa el extremo C-terminal de aa hidrofóbicos, β2 enlaces peptídicos de aa básicos y β1 enlaces peptídicos entre aa ácidos). Las subunidades α anclan el proteasoma 19S.
- Proteasoma 19S. Reconoce y se une al sustrato. Además, presenta actividad ATPasa para desplegar la proteína (introducirse en el proteasoma y para que los enlaces peptídicos sean accesibles).
Las proteínas reconocidas por el proteosomas deben estar ubiquitinadas. La ubiquitina es una proteína globular formada por 76 aa que se localiza en todas las células eucariotas. El marcaje con ubiquitina sucede en tres pasos: 1. Activación de la ubiquitina. La enzima activadora de ubiquitina (E1) cataliza la unión de la ubiquitina a través de su extremo C-terminal a la propia enzima. Esta unión se produce entre el extremo C-terminal de la ubiquitina y al grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína de la proteína E1 (enlace tioester). Este paso requiere energía procedente de la hidrólisis de ATP.
2. Transferencia de la ubiquitina activada a la enzima conjugadora de ubiquitina (E2).
3. Ubiquitinación. La ubiquitina se transfiere al grupo ε-amino (amino de la cadena lateral) de residuos de lisina de la proteína diana gracias a la acción de la ligasa de ubiquitina (E3), formando un enlace isopeptídico.
Para que la degradación por el proteasoma, se requieren al menos cuatro moléculas de ubiquitina unidas a la proteína a degradar (poliubiquitinada). Las señales para la ubiquitinación son: - Naturaleza del residuo N-terminal. Si los residuos N-terminales son de tipos Asp, Arg, Lys, Leu, Phe las proteínas son más susceptibles a ubiquitinación (residuos desestabilizadores). Si en el extremo N-terminal encontramos Ala, Gly, Met, Ser, Thr, Val (residuos estabilizadores) las proteínas son menos susceptibles a la ubiquitinación.
- Secuencias PEST. Son secuencias formadas por entre 10-60 aa ricas en Pro, Glu, Ser y Thr (aa susceptibles de fosforilación).
Las proteínas poliubiquitinadas son reconocidas por el proteasoma 19S de tal manera que se une a ella y la desplega. Este proceso requiere la hidrólisis de ATP.
La proteína desplegada entra a la subunidad 20S produciéndose un cambio conformacional que hace que la actividad proteolítica de los anillos β se active.
Como consecuencia de esta activación la proteína se va cortando dando lugar a una serie de fragmentos peptídicos de entre 7-9 aa. Las proteasas celulares degradaran finalmente estos fragmentos hasta los correspondientes aa. La ubiquitina no se degrada en el proteasoma. Parece que es la subunidad inferior 19S la que cataliza la liberación de la ubiquitina de los fragmentos peptídicos.
DEGRADACIÓN LISOSOMAL Se produce en los lisosomas. Se degradan fundamentalmente proteínas captadas por endocitosis. También se degradan lípidos, glúcidos, ácidos nucleicos,....
Las enzimas encargadas de la degradación de proteínas se denominan catepsinas, con un pH de actuación ácido.
Este pH es mantenido gracias a una bomba de protones localizada en la mb del lisosomal, que requiere energía proporcionada por ATP.
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