Tema 4 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 Tema 3: MEDIS DE CULTIU, SÈRUM I ADDITIUS CONDICIONS FISICOQUÍMIQUES DELS MEDIS DE CULTIUS CEL·LULARS temperatura d’incubació Les nostres cèl·lules en la major part dels mamífers creixen al voltant de 37 °C i per tant, per la seva correcta proliferació els incubadors s’han de trobar a aquesta temperatura. Si utilitzem cèl·lules d’aus hem de treballar a una temperatura més elevada (38,5°C) mentre que si ho fem amb insectes ha de ser inferior (20 °C).
És molt important la constància en la temperatura, és a dir, és important mantenir la temperatura dels cultius el màxim de constant possible i degut al treball de la gent en els laboratoris a mesura que traiem o posem cèl·lules això no sempre és possible. Hem de tenir present que si la temperatura puja més del compte això pot ser molt nociu per les cèl·lules (si baixa no és tant nociu com una pujada).
pH Les cèl·lules en cultiu han de mantenir constant el pH. Sabem que les cèl·lules pel seu propi metabolisme produeixen CO 2 i aquest al ser alliberat al medi interacciona amb l’aigua produint bicarbonat i protons i per tant, el medi es va acidificant.
Les cèl·lules de mamífer creixen al voltant de pH 7,2-7,4 tot i que pot ser que hi hagi alguns tipus cel·lulars que puguin créixer en pH més alcalins com els fibroblasts (7,4-,7,7) o a pH més àcid com les línies epitelials (5,5).
Per no haver de mesurar el pH contínuament en el medi el que podem fer és introduir en el cultiu el roig de fenol, un indicador del pH que funciona amb colors (generalment el seu color és vermell). Els cultius es poden tornar alcalins i desestabilitzar-se una mica al sortir fora del incubador (vermell més fosc) mentre que el metabolisme cel·lular provoca una acidificació (taronja/ groc). Quan el cultiu arriba a monocapa observarem també un color ataronjat o groguenc de manera que a la vegada ens indica que hem de subcultivar.
Algunes infeccions també donen un canvi de color perquè els bacteris acidifiquen el medi. Com que aquests creixen en suspensió la contaminació és fàcilment observable ja que el cultiu es torna més tèrbol i adquireix un to groguenc.
El vermell de fenol però, té limitacions ja que quan es treballa en cèl·lules sensibles a determinades hormones com per exemple les cèl·lules d’origen mamari o si fem estudis de citometries de flux ja que es poden donar interferències.
Problemes per mantenir el pH constant   Cultius tancats o Activitat cel·lular que produeix un augment del CO2 i conseqüentment una acidificació del medi o Permeases alliberen protons i àcid làctic Cultius oberts: pèrdua de CO2 del cultiu i per tant, alcalinització d’aquest (bàsic) 1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 Solució pels cultius oberts La solució es posar una pressió de CO 2 més elevada que la que tenim en l’aire per contrarestar aquesta amb un bicarbonat i equilibrar la reacció. Si posem per exemple, 5% de CO 2 conjuntament amb un altre element que no permeti el desplaçament de la reacció cap a la dreta. En algunes clíniques de reproducció assistida no només posen un % de CO2, que serveix per tamponar el medi, sinó que també afegeixen nivells de nitrogen més elevats per desplaçar l’oxigen i per tant ajustar més a les condicions reals de fecundació ja que a l’endometri la concentració d’oxigen és relativament molt baixa i per tant, s’intenten acoblar a les condicions reals. En generals la pressió d’oxigen no es sol modificar.
Si nosaltres posem una pressió de CO2 elevada la reacció es desplaça cap a la dreta i si afegim bicarbonat sòdic la reacció tira cap a l’esquerra per tant, l’equilibri entre el bicarbonat i el CO2 es dóna en funció de la pressió de CO2 (com més elevada és aquesta el sistema té un millor tamponament).
També s’utilitza un tampó anomenat HEPES que funciona molt bé en pH fisiològic però el problema és que arriba a ser tòxic a concentracions superiors a 50 mM i quan treballem a concentracions de CO2 superiors al 5% no cal utiltizar-lo perquè no té cap efecte. En general, la presència d’aquest tampó en medis de cultius sol ser una bona opció ja que millora el tamponament entre els elements anteriors.
Necessitem un incubador en que posem els cultius i que es puguin intercanviar gasos sense que es produeixi la contaminació. És per aquest motiu que la major part dels flascons de cultius tenen un tap de rosca on a la part externa hi ha un filtre i una rosca amb dues posicions que permet que entre els dos tancaments hi hagi un intercanvi de gasos sense una contaminació. Generalment hem de saber que els cultius es poden fer amb el flascó en posició vertical però que és millor en horitzontal perquè augmenta la superfície.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 Osmolalitat És important que les cèl·lules creixin en un medi isotònic en el qual la pressió osmòtica als dos costats de la membrana sigui la mateixa. Alguns exemples d’osmolalitat són el plasma humà (290), plasma ratolí (310) o el d’insecte (360/375).
Sempre hem de tenir medis adequats pel que fa aquest aspecte perquè si existeix una diferència osmòtica les cèl·lules poden patir una sèrie de problemes:  Medi hipertònic: hi ha un pèrdua d’aigua  Medi hipotònic: hi ha un guany d’aigua Els dos aspectes anteriors són molt importants ja que provoquen greus problemes en la cèl·lula. La osmolalitat es pot veure afectada per l’addició del tampó HEPES o drogues dissoltes en àcids i bases fortes i la seva posterior neutralització.
Substrat Les cèl·lules creixen de diverses maneres: Creixement en suspensió Algunes cèl·lules com les línies hematopoètiques o cèl·lules transformades poden créixer sense una adhesió.
Creixement adherides a substrat En el creixement adherit a un determinat substrat cal diferenciar que podem trobar diversos substrats:  Sòlid: com el vidre o el plàstic.
o El vidre és un material que ja té càrregues de manera que és un bon substrat perquè permet la bona adhesió cel·lular. Aquest a més, és un material reutilitzable tot i que el seu principal inconvenient és la contaminació que es pot donar si no es renta correctament.
o El plàstic no té càrregues però pot ser modificat per tal de ser un millor material.
 Semisòlid: com el col·lagen, agar, gelatina...
 Biomatrius: com el col·lagen o la fibronectina. En aquest és molt important controlar la presència de molècules lliures (no adherides al plàstic de la biomatriu) ja que poden ser tòxiques.
Creixement en co-cultius Les cèl·lules mare són cèl·lules que podem mantenir en cultiu sense que es diferencien però potser més tard és interessant que es diferencien cap a un determinat teixit. Per mantenir les cèl·lules indiferenciades però amb capacitat proliferativa es sol utilitzar una altra capa de cèl·lules diferents que és la que subministra els nutrients i els senyals necessaris perquè les cèl·lules mare no es diferencien però si proliferin. Aquestes cèl·lules són les cèl·lules de Feeder layer, que es generen amb un co-cultiu. Hem de tenir present que les cèl·lules mare sense la presència d’aquestes cèl·lules es diferenciarien.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 COMPOSICIÓ BÀSICA DELS MEDIS DE CULTIU Els medis de cultius han de tenir tot allò necessari perquè les cèl·lules creixin:  Aminoàcids: Els medis de cultiu han de tenir tant els aminoàcids essencials (aquells que no sintetitza la cèl·lula) com els no essencials (cisteïna, tirosina i glutamina). La glutamina pot presentar problemes ja que la seva degradació és relativament ràpida (en mesos) transformant-se en amoníac, un producte tòxic per la cèl·lula.
 Vitamines: sodi, potassi, calci, bicarbonat, potassi...
 Sals minerals:  Carbohidrats: Són un exemple la glucosa o el piruvat  Detergents: Aquests permeten que les membranes tinguin més fluïdesa ja que les membranes de les cèl·lules en cultiu es tornen Tipus de medis de cultius Existeixen diferents tipus de medi de cultius que difereixen en aquelles elements que porten:  MEM o medi mínim essencial  DMEM: respecte l’anterior incrementa la concentració d’aminoàcids i afegeix altres elements  Mc Coy’s 5a Media Els medis els podem fer de més simples a més complexes; els simples s’utiltizen amb un afegit de sèrum i els més complexes poden ser utilitzats sense sèrum però amb d’altes molècules. Generalment com més ric és un medi de cultiu més possibilitats té que no necessitem sèrum per fer créixer les cèl·lules.
EL SÈRUM Si agafem el sèrum i mirem la seva composició aproximada veuríem que té molts tipus de proteïnes, factors de creixement i per tant, quan no sabem els requeriments del tipus cel·lular a cultivar afegir el sèrum és una eina útil per tal de no perdre temps d’investigació en conèixer les molècules necessàries pel creixement òptim.
Podem obtenir el sèrum de ramats (sèrum boví), de caballs o vadelles i hem de tenir present que el sèrum fetal és sempre més ric que el sèrum d’un adult, com més gran sigui l’animal menys ric és el seu sèrum. La concentració d’elements varia segons l’edat i segons els ramats per tant, l’obtenció de sèrum depèn també de les èpoques.
La utilització de sèrum té una sèrie d’avantatges:  Sense sèrum hem d’introduir factors de creixement, que són molt cars  Disminueix els costos en general  Permet que en el mateix medi creixin un ampli ventall de cèl·lules  Generalment alhora de congelar és un element que va bé, la presència de concentracions de sèrum elevades afavoreix a una millor viabilitat de les cèl·lules descongelades.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 La seva utilització però, també te una sèrie d’inconvenients:  Si aconseguim reduir la concentració de sèrum la reproductibilitat dels cultius augmenta perquè no estan exposats als canvis de lots de sèrum (recordem que és comercial)  Disminueix la contaminació (hem de saber que actualment les contaminacions estan molt controlades però a vegades els sèrums porten proteïnes del sistema complement que poden afectar al medi de cultiu). A més hem de saber que podem desactivar les proteïnes del sèrum exposant-les durant un cert temps a 56°C.
 Proporciona un aspecte tèrbol al cultiu perquè generalment conté proteïnes (no suposen un problema la seva presencia) MEDIS LLIURES DE SÈRUM  Medis lliures de proteïnes (PF Media): Aquests medis contenen derivats proteics hidrotlitzats (peptones) però no proteïnes intactes.
 Medis químicament definits (CD Media): contenen unes poques proteïnes totalment caracteritzades ja que coneixem els requeriments nutricionals dels cultius.
SOLUCIONS SALINES CONSIDERACIONS ALHORA DE SELECCIONAR I PREPARAR UN MEDI DE CULTIU Objectius inicials a definir  Cal definir el que volem del medi, que volem que facin les cèl·lules?  Seleccionar el medi de cultiu tenint en compte diferents aspectes de la nostra mostra a preparar. Les cèl·lules en medis sense proteïnes són més sensibles a l’estrès que quan creixen en medis amb sèrum  Cal sembrar un nombre mínim de cèl·lules 5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 Consideracions importants 1.
La preparació del medi no ha d’inactivar els nutrients essencials 2.
Cal controlar la qualitat de les condicions de cultiu: aigua, atmosfera...
3.
Cal utiltizar sempre reactius de la màxima puresa ja que si hi ha contaminats aquests poden ser tòxics en medis sense sèrum 4.
Si preparem medis complexos les solucions estoc s’han de combinar just abans de la filtració. Les solucions inestables (com les de Glutamina) s’han d’afegir just abans del seu ús.
GUIA BÀSICA PER OPTIMITZAR UN MEDI DE CULTIU Si tenim una línia cel·lular nova és millor que creixi en el medi original. Si volem modificar el medi, cal fer una bateria de medis per veure quin va millor.
1.
Testar diferents medis 2.
Modificar-los suplementant amb sèrum (també podem provar diferents) o hormones 3.
Escollir el medi i barreja que millors resultats hagi donat 4.
Provar d’afegir glucosa, especialment si les cèl·lules han de créixer a densitats elevades 5.
Provar de suplementar el medi amb més glutamina, vitamines, aminoàcids...
6.
Variar la osmolalitat 7.
Testar l’efecte de l’addició d’insulina i transferrina 8.
Comparar el creixement cel·lular al llarg de 5 passes entre el medi original i el nou medi 9.
Congelar cèl·lules en medi vell que ens servirà com un estoc de reserva. Congelar també en el medi nou desprès de 2/4 passes.
ADAPTACIÓ A MEDIS LLIURES DE SÈRUM Adaptació seqüencial Aquesta adaptació es vasa en anar subcultivant les cèl·lules alhora que anem disminuint progressivament la quantitat de sèrum en el medi de manera que, seqüencialment el medi anirà perdent el sèrum.
La primera subcultivació l’elaborem en un medi que tingui 75% de sèrum, la segona amb 50% de sèrum, la tercera on hi hagi 25% de sèrum i en la última ja no tenim presència de sèrum.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 Adaptació mitjançant un medi condicionat Entenem per medi condicionat aquell en el qual ja han crescut les cèl·lules abans. Les cèl·lules creixen en un medi de cultiu i en el següent medi utilitzem el 50% del medi anterior (en el que ja havien crescut i que té sèrum) i e 50% d’un medi nou sense sèrum. En la següent subcultivació utilitzem un 50% del medi anterior (que tenia 50% de medi amb sèrum) i així successivament. Aquest mètode ens permet que el nivell de sèrum cada vagada sigui més petit fins que arribem a un medi que no té sèrum.
Les cèl·lules en cultiu produeixen i secreten una sèrie de factors autocrins i paracrins que formen part del medi i per tant, quan subcultivem aquests no es perden en la seva totalitat (com en l’altre mètode d’adaptació) sinó que una part es recuperen de manera que aquest mètode generalment dóna millors resultats.
Podem trobar cèl·lules a les quals els hi costi molt l’adaptació i per tant, els percentatges han de ser més petits perquè el canvi sigui menys pronunciat. De vegades el procés pot ser molt lent i durar entre 1 i 6 mesos.
Exemple real Es tracta d’un exemple d’una casa comercial que produeix anticossos i aquesta va elaborar una sèrie de cultius amb sèrum i sense sèrum per valorar dos paràmetres diferents:  Capacitat de les cèl·lules de proliferar: En medis lliures de sèrum (groc) i en medis amb sèrum (blau) la taxa és molt similar, les dues rectes són molt similars. A mesura que incrementem el número de dies de cultius i anem subcultivant les cèl·lules presenten un creixement lineal. Podríem dir que no hi ha diferència entre els medis.
 Producció d’anticossos: Ens fixem que les cèl·lules que creixen en medi lliure de sèrum (blau) i en medi amb sèrum (vermell). La producció en el medi sense sèrum és més elevada que la producció en medi amb sèrum.
Observem els paràmetres anteriors en els següents gràfics: En l’origen dels cultius cel·lulars quan enfoquem un cultiu per un determinat objectiu hem de tenir molt clar que volem aconseguir per tal de buscar el medi més adient i econòmic. Si el que busquem és la producció hauríem d’escollir el medi lliure de sèrum tot i que hauríem de fer un balanç entre els costos i la producció. També és necessari testar els anticossos per saber si realment són funcionals, és a dir, si reconeixen i s’uneixen a la molècula d’interès.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T3 CONSIDERACIONS FINALS 1.
Comparar si el medi en pols és més econòmic. Si modifiquem el medi per adaptar les cèl·lules sense sèrum cal que valorem si ens surt a compte. En general podem modificar les condicions de cultiu sempre que sigui rentable.
2.
Si cal, afegir antibiòtics, malgrat que es preferible treballar sense ells. La recomanació general és treballar sense antibiòtics en el medi perquè els estem contaminant i generant interferències ja que interactuen amb la cèl·lula.
L’avantatge de treballar amb aquests és que si tenim una infecció ràpidament es posarà de manifest de tal manera que molts cops s’introdueixen en el cultiu per seguretat (barreja de penicilina i estreptomicina) 3.
Utilitzar material de plàstic i vidre especialitzat per cultius. Si cal rentar el material ho elaborem sempre acuradament per evitar contaminacions. Molts cops es preferible utilitzar amb material de plàstic d’un sol ús.
4.
Tenir molta cura amb l’aigua perquè és un factor crític quan es treballa en medis sense sèrum 5.
Sempre que sigui possible establir corbes dosi – resposta pels diferents components a testar 6.
Definir clarament l’objectiu final, que pot ser: a.
Producció: testar el títol de proteïnes produïdes b.
Millora del creixement: testar el número de cèl·lules c.
Activitat del producte: testar la producció de producte actiu 8 ...