Tema 6 Ingeniería de proteínas (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 20
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 6 Aplicaciones biomédicas de la ingeniería de proteínas La idea principal de la ingeniería de proteínas es o bien aprovechar las proteínas nativas tal cual o emplear las proteínas modificadas para aplicaciones médicas o industriales.
Las MODIFICACIONES que se hacen sobre las proteínas nativas pueden ser modificaciones químicas o hacerse mediante ingeniería genética.
Modificaciones químicas Consisten en añadir algún tipo de modificación post-traduccional para modular las propiedades farmacocinéticas de la proteína.
Es bastante frecuente añadir una molécula de polietilenglicol o PEG a la proteína. El polietilenglicol hace que aumente el volumen hidrodinámico de la proteína, lo que conlleva a un descenso de la eliminación en el riñón y con ello, al aumento de la vida media del fármaco en el organismo. En cierto modo, la PEGilación mimetiza una glicosilación, siendo más fácil de introducir químicamente que la glicosilación.
La PEGilación también hace que la proteína sea más resistente a la digestión proteolítica. Además, el PEG se trata de una molécula altamente polar, por lo que, al añadirla a la célula estamos aumentando la solubilidad de la proteína.
Esta modificación también hace que sea más difícil que se puedan desarrollar anticuerpos para la proteína, es decir, la hace menos inmunogénica.
Como podemos ver en la imagen, el polietilenglicol consta de varias subunidades de etilenglicol. Sobre esta estructura básica podemos encontrar distintas variaciones, resultando moléculas de diferente tamaño. Por ejemplo, podemos añadir el grupo reactivo NHS-éster, que reacciona con los grupos aminos de las proteínas, quedándose enganchado.
1 Ingeniería de proteínas En algunos casos, para modificar la proteína se hacen glicosilaciones aunque este proceso resulta más complicado que la PEGilación. También se ha probado añadiendo algún ácido graso.
TIPOS DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS EN EL MERCADO En el año 2011 había, aproximadamente, 250 compuestos peptídicos o proteicos aprobados para su uso terapéutico. Estas proteínas terapéuticas pueden clasificarse en tres grupos: - Proteínas recombinantes - se trata de proteínas que pueden presentar diferentes modificaciones que modifiquen sus propiedades. (Como máximo, pueden estar modificadas químicamente). Estas modificaciones pueden ser la PEGilación y la glucosilación antes comentadas, por ejemplo. Un ejemplo es la insulina, que puede ser la insulina nativa (con secuencia idéntica a la de la proteína en humanos) o estar modificada para mejorar sus propiedades. También se lleva a cabo con hormonas de crecimiento.
Cuando la proteína está modificada, hablamos de engineer protein.
Se trata del grupo más numeroso.
- Anticuerpos - están recibiendo mucha atención últimamente - Proteínas de fusión a Fc - en principio son proteínas quiméricas con la región Fc de las inmunoglobulinas conjugada con un péptido que les da propiedades farmacológicas.
HISTORIA DE LA PRODUCCIÓN DE LA INSULINA La insulina en cifras: En el mundo industrializado hay un requerimiento anula de 4,600kg de insulina.
Hay 180 productos de insulina (de marcas) disponibles en el mundo.
El mercado mundial de insulina fue valorado en 4,500 millones de dólares americanos en 2002. Se esperaba que este mercado alcance los 7900 millones de dólares en 2007.
Novo Nordisk, Lilly y Aventis representan las mayores empresas productoras de insulina del mundo.
La insulina fue descubierta por Banting y Best (1921) que realizaron extractos de islotes de Langerhans siendo capaces de curar perros diabéticos. Un año más tarde, después de llevar estudios de seguridad en ellos mismos, se administró por primera vez a pacientes.
En 1922, surgieron las primeras preparaciones comerciales de insulina (Eli Lilly), que procedían de purificaciones de origen porcino o bovino. Presentaban principalmente tres problemas: - Grado de pureza, problema que fue resuelto poco después con la llegada de la cromatografía.
- Disponibilidad - Inmunogenicidad 2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Estos dos últimos problemas no fueron resueltos hasta los años 70. Fue mediante la biología molecular como se consiguió resolver estos dos problemas. En 1960 se obtuvo la secuencia de la insulina humana y se observó que había tres aminoácidos de diferencia respecto a la insulina bovina y tan solo un aminoácido de diferencia con la insulina porcina (A por T en la posición B30).
En 1978 fueron capaces (Genentech) de clonar el gen humano y producir la proteína heterólogamente en E. Coli.
Una vez resueltos los problemas respecto a la obtención, los esfuerzos se centraron en modificar la secuencia de la insulina para modular las propiedades farmacocinéticas (modular el tiempo que la proteína se encuentra activa una vez ha entrado en el organismo).
En la tabla podemos ver ejemplos de insulinas recombinantes humanas que han sido aprobadas para uso médico general (en los Estados Unidos).
Como podemos comprobar, a partir de 1996 encontramos las primeras proteínas modificadas (engineered).
Problemas de las insulinas humanas El páncreas produce insulina en forma monomérica (aunque en realidad los monómeros consisten en dímeros de cadenas). En las preparaciones de insulina (producidas in vitro), los dímeros oligomerizan, formando hexámeros. En parte esto se debe a la concentración en la que se encuentra la insulina en las preparaciones comerciales (10-3 M), mucho mayor a la concentración en condiciones fisiológicas ( que es de 10-10 M).
3 Ingeniería de proteínas Cuando inyectamos la insulina en un paciente, los estados monómero y oligómero se encuentran en equilibrio. Poco a poco, los oligómeros se van disociando, dando lugar a más monómeros (que son la forma activa de la insulina). La velocidad a la que se produce la disociación de los oligómeros determina el tiempo que tarda en hacer efecto la insulina y lo duraderos que sean sus efectos.
Es posible modular estos procesos de oligomerización y disociación  se han desarrollado estrategias químicas y estrategias que requieren la modificación de la estructura primaria.
Estrategias químicas Por ejemplo, se pueden incluir compuestos que favorezcan la formación de los oligómeros, como el Zinc. Cuando añadimos Zn, este se encuentra quelado en la parte central de los oligómeros, estabilizando esta forma de la proteína. (Podemos ver el Zn en la imagen anterior en la que se representan los oligómeros  es el átomo que se encuentra en el centro del complejo). Así, mediante la estabilización de los complejos, conseguimos retardar el efecto de la insulina.
Otra estrategia es la adición de protaminas, polipéptidos básicos que favorecen la formación de los complejos, retardando el efecto de la insulina.
Estrategias que implican modificar la estructura primaria El objetivo es modificar aminoácidos de la secuencia de la insulina humana para variar las propiedades farmacocinéticas. Podemos crear o bien insulinas rápidas (fast-acting insulines) o insulinas lentas (slow--acting insulines).
En las fast-acting insulines se modifican los aminoácidos que contribuyen a la oligomerización, para acelerar el proceso de disociación.
A la hora de sintetizar slow-acting insulines se tiende a favorecer la precipitación o a favorecer la unión de la insulina a otras moléculas.
Una de las más utilizadas es la insulina Lispro. Presenta una pequeña modificación en la estructura primaria de la cadena B: se ha invertido la posición de una prolina y una lisina.
De entrada, esta modificación provoca un cambio conformacional. La diferentes disposición de este aminoácido polar hace que no puedan producirse una serie de interacciones hidrofóbicas que estabilizan el oligómero ya que se ven desfavorecidas. Esto implica que el oligómero no se forme tan fácilmente (la presencia de una lisina en lugar de una prolina hace que la oligomerización no esté a favorecida), lo que se traduce en una absorción más rápida de Lisprot respecto a la insulina normal y en unos efectos más rápidos.
Hablamos por tanto de una insulina rápida.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Dentro de las insulina lentas podemos encontrar Glargina que también tiene una modificación en la estructura primaria. En este caso, la Glargina presenta modificaciones tanto en la cadena A como en la cadena B. En la cadena A se ha cambiado el aminoácido del extremo C-terminal: se ha cambiado una Asparagina por una Glicina. En la cadena B se han añadido dos Argininas en el extremo C-terminal.
Estas modificaciones provocan un aumento del punto isoeléctrico de la proteína que tenderá a precipitar a pH corporal. Se trata de una precipitación reversible, que sirve para crear una especie de depósito de insulina en el organismo, que se va disolviendo poco a poco.
Otro ejemplo de insulina lenta es el Levemir. En este caso se ha añadido un ácido graso a la lisina 29 de la cadena B. Este ácido graso se une a la albúmina (una proteína que transporta ácidos grasos en la sangre), que hace que aumente la vida media de la proteína en plasma - cuanto más volumen tenga una proteína, acostumbra a tener una vida media en plasma más larga. La insulina se va liberando poco a poco (tiene un efecto de hasta 24h).
En la siguiente tabla podemos ver los efectos farmacocinéticos que tienen estas modificaciones. Podemos ver cómo, en insulinas nativas, se puede conseguir una acción más rápida o más lenta en función de la proteína. La tabla indica el inicio de los efectos, cuándo se produce el pico de actividad y cuánto tiempo dura el efecto. Al trabajar con insulinas rápidas, como Lisprot, hacemos que los efectos comiencen antes. En función del tipo de paciente, interesará más una farmacocinética u otra.
PROTEÍNAS DE FUSIÓN A Fc (Fc fusion proteins) Fc se trata de una región propia de los anticuerpos.
Como ya sabemos, los anticuerpos tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Además, podemos distinguir dos regiones Fab (encargadas del reconocimiento del antígeno) y dos regiones Fc, encargadas de unirse a las proteínas del complemento y a determinadas células . Los anticuerpos son de las proteínas más estables que hay, ya que, por ejemplo, aguantan muchas temperaturas.
Lo que se busca es aumentar la estabilidad de las proteínas con potencial terapéutico dentro del plasma. Para ello, la idea es fusionar la proteína de interés con la región Fc de los anticuerpos , creando una proteína quimérica (que consiste en la proteína terapéutica con -normalmente- un par de dominios de la Ig). Así conseguimos que sea más estable dentro del torrente sanguíneo.
De momento, solo habrá alrededor de 5 o 6 fármacos que empleen esta idea.
Lo que mejor ha funcionado de momento es cuando se han intentado crear antagonistas, por ejemplo de interleucinas y de señalizadores del sistema inmune. Se ha fusionado Fc a dominios de algún receptor de citoquinas.
5 Ingeniería de proteínas Se ha hecho por ejemplo para crear un antagonista de la citoquina TNF. Ésta tiene un receptor que, cuando se une a TNF desencadena toda una serie de respuestas. Hay muchas células diana que tienen este receptor. La idea es que, en determinadas situaciones patológicas interesa evitar la señalización por TNF - por tanto, interesa crear un fármaco antagonista que neutralice TNF. Para eso, se ha creado una proteína de fusión con algunos dominios del receptor de TNF - fármaco Etanercept, indicado para artritis reumatoide, psoriasis,… es decir, indicado para enfermedades autoinmunes en las que hay inflamación implicada. Con este antagonista se consigue evitar la inflamación.
Otro ejemplo de proteína de fusión a Fc, es el fármaco Rilanocept, un antagonista de la citoquina interleuquina 1 (IL-1).
El receptor de la interleuquina 1 está formado por dos cadenas entre las cuales queda atrapada la interleuquina (como puede verse en la imagen). Los dominios que más intervienen son el dominio carboxiterminal de cadena llamada RAcP y el aminoterminal de la cadena RI, que son los que quedan en contacto con el exterior.
En lugar de la totalidad del receptor, a la región Fc de la de inmunoglobulina, se han fusionado solamente estos dominios, consiguiendo una proteína de fusión con una muy elevada afinidad por la interleucina 1. Este compuesto tiene una gran vida media, de aproximadamente 8,6 días, por lo que permite inyectarlo una vez a la semana.
*Es preciso destacar que las proteínas terapéuticas deben inyectarse (no pueden administrarse por vía oral).
Mediante la aplicación de esta misma esta estrategia, también se han desarrollado agonistas Por ejemplo, Romiplostin, que incluye un trozo de trombopoyetina fusionado a la región Fc. Como ya sabemos, la trombopoyetina es una hormona que estimula la formación de plaquetas. La formación de plaquetas se ve alterada en casos de trombocitopenia (situación patológica caracterizada por un número bajo de plaquetas). El problema principal cuando se inyecta la trombopoyetina tal cual es que el organismo acaba desarrollando anticuerpos contra la proteína inyectada, por lo que ésta es eliminada rápidamente de la circulación. Por tanto, se aplica la estrategia de fusionar a la región Fc a fragmentos de la tromoboyetina, logrando que no se produzcan anticuerpos contra ella  así se consigue aumentar la vida media de la proteína.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV *Terminologías empleadas para hablar de proteínas: A veces, estas moléculas son conocidas por los nombres que se les ha dado en alguna casa comercial como Peptibodies o Mimetibodies.
Algunas de estas proteínas, que cogen diversos dominios del receptor en lugar de emplear el receptor completo, con intención de atrapar la molécula (para neutralizarla), podemos encontrarlas bajo el nombre de Traps.
Anticuerpos La idea es inyectar anticuerpos en el organismo que consigan neutralizar a un agente patógeno o incluso a una célula cancerígena. Existen diversas estrategias: se pueden emplear tal cual o pueden ser modificados. Por ejemplo, se puede modificar la región Fc para mejorar aún más la estabilidad (Fc Engineering).
Otra opción es crear conjugados de anticuerpos y fármacos (Antibody-drug conjugates o ADCs).
Mediante este sistema, estaremos utilizando el anticuerpo para enviar el antígeno a una célula concreta, que expresa una determinada proteína.
También podemos crear lo que se conoce como anticuerpos biespecíficos: se construye un anticuerpo en el que, cada brazo, reconozca un antígeno diferente.
Por último, empleando anticuerpos también podemos producir single domain antibodies, nanobodies o nanocuerpos.
A continuación, vamos a ir explicando todas estas aplicaciones de los anticuerpos (en mayor profundidad).
Fc engineering Como ya se ha comentado, consiste en alterar la región Fc del anticuerpo para modular sus propiedades. Se hace esto por tres razones principalmente:  Para aumentar la unión a los receptores de Fc  Para aumentar la capacidad del anticuerpo de unir proteínas del complemento .
 Para aumentar la vida media del anticuerpo Una de las acciones efectoras de los anticuerpos es la unión y activación de macrófagos. Se ha observado que, introduciendo determinadas modificaciones en la secuencia Fc (unas modificaciones concretas), aumenta la afinidad de los receptores (de los macrófagos, células NK, …) por estas proteínas.
Este aumento de la afinidad conlleva un aumento de la respuesta de los macrófagos contra el antígeno, así como de otras células que tienen receptor para el anticuerpo, como las Natural Killer. Es decir, mediante ciertas modificaciones en la región Fc de la Ig podemos lograr una respuesta más eficiente.
7 Ingeniería de proteínas Estas modificaciones pueden ser mutaciones en la secuencia o modificaciones químicas (glucoengineering: eliminar la fucosa del carbohidrato).
También es posible, mediante las modificaciones pertinentes, aumentar la capacidad del anticuerpo de unirse a las proteínas del complemento. Estas proteínas son proteínas plasmáticas que pueden unirse a anticuerpos y promover la lisis o inducir la fagocitosis de bacterias u otros agentes patógenos.
Una de las diferentes vías de activación del complemento se produce mediante la proteína C1 y se inicia por la unión de esta proteína a las inmunoglobulinas. Se ha observado que, determinadas modificaciones en la cadena pesada de los anticuerpos aumentan la afinidad por C1, aumentando la eficiencia natural del sistema del complemento.
Además, se conoce que una serie de mutaciones en Fc permiten aumentar la afinidad de las inmunoglobulinas por el receptor FcRn presente en células endoteliales y monocitos. Las Ig pueden ser endocitadas directamente o bien pueden interaccionar con este receptor y ser endocitadas (es decir, se endocita el complejo receptor + Ig). Cuando la Ig es endocitada sin el receptor, será degradada junto con los antígenos en el lisosoma. En cambio, cuando la Ig se endocita unida al receptor, éste puede rescatar al anticuerpo del endosoma, evitando que sean degradados. El hecho de hacer que las inmunoglobulinas sean tengan mayor afinidad por los receptores FcRn, hace que aumente su vida media, ya que, preferencialmente serán endocitadas junto con el receptor, que permite su reutilización.
Anticuerpos biespecíficos La idea es crear un anticuerpo sintético en el que cada lado reconozca un antígeno diferente.
Como ya sabemos, los anticuerpos reconocen al antígeno gracias a la región Fab.
El objetivo de esta idea es crear aproximaciones terapéuticas imaginativas, como las que vamos a ver a continuación: Por ejemplo, tenemos un anticuerpo que por un lado reconoce BACE-1 y por el otro, reconoce al receptor de la transferrina (Anti-BACE1, Anti-TfR). El objetivo de este anticuerpo biespecífico es neutralizar la β secretasa o BACE1, involucrada en el desarrollo de las placas amiloides características del Alzheimer. La proteína APP o amiloid precursor protein es cortada por dos proteasas, dando lugar a un producto con tendencia a formar las placas amiloides - una de estas proteasas es la β secretasa.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Una forma de evitar que tenga lugar la proteólisis de esta proteína y que, por tanto, se formen los productos que formarán las placas amiloides es inhibiendo las proteasas que cortan la proteína precursora amiloide. Se pensó que esto podía llevarse a cabo sintetizando anticuerpos que reconozcan a estas proteínas. El problema es que estos anticuerpos difícilmente llegarán a su objetivo, ya que la proteína diana se encuentra en el cerebro y debe atravesar la barrera hematoencefálica. La solución a este problema se encontró en el anticuerpo biespecífico: la virtud de emplear el receptor de la transferrina es que, prácticamente todas las células tienen, incluso las neuronas (y otras células presentes en el encéfalo), por lo que posibilita que nuestro anticuerpo atraviese la barrera hematoencefálica. Cuando el anticuerpo se une con el receptor de la transferrina, el receptor cumple la misma función que con la transferrina  la transporta al otro lado de la membrana plasmática. Así, el anticuerpo consigue atravesar la barrera hematoencefálica.
La afinidad del anticuerpo por el receptor no debe ser demasiado alta ya que, una vez ha atravesado la barrera, debe desengancharse del receptor de la transferrina.
Hay mucha gente trabajando sobre esta idea.
También se ha planteado crear un anticuerpo biespecífico que pueda reconocer por un lado un antígeno típico de una célula tumoral y por el otro lado, alguna proteína de la superficie de un linfocito T. Además, como se trata de un anticuerpo tenemos triple especificidad, ya que la región Fc es capaz de reconocer al receptor de Fc, presente en macrófagos, células dendríticas, células Natural Killer y otras células accesorias del sistema inmune. Gracias a esta triple especificidad mejoramos la respuesta citotóxica de los linfocitos T frente a las células tumorales.
9 Ingeniería de proteínas Se han desarrollado múltiples formas de producir anticuerpos biespecíficos: Por lo general, el anticuerpo biespecífico está formado en principio por cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (como el resto de anticuerpos). En este caso, una cadena pesada y una ligera corresponden a un anticuerpo y la otra cadena pesada junto con la otra cadena ligera corresponden al otro anticuerpo. La idea es expresar cada una de las cadenas en una cepa u organismo diferente. Una vez se han expresado las proteínas de forma diferencial, se mezclan para que se produzca la combinación. Pueden seguirse distintas estrategias para garantizar que la combinación entre las cadenas sea la correcta: Un ejemplo para conseguir el apareamiento correcto es la técnica o estrategia denominada Knobs-into-holes (KiH), que consiste en alterar las cadenas pesadas. Se modifica un dominio de las cadenas pesadas para generar una protuberancia que sea complementaria a un agujero que se encuentre en la otra cadena pesada. La idea es impedir que se mezclen dos cadenas que no corresponda y se consigue introduciendo aminoácidos (o modificando los aminoácidos que hay) para crear la protuberancia. En el ejemplo de la imagen se ha cambiado un aminoácido por un triptófano. En este mismo ejemplo se ha llevado a cabo una triple sustitución (se han sustituido tres aminoácidos) para crear un agujero hidrofóbico que permite que encaje el triptófano. Además, en algunos casos, pueden añadirse dos cisteínas cerca del agujero, favoreciendo la formación de un puente disulfuro entre las dos cadenas pesadas- así, la correcta unión de las cadenas se ve aún más favorecida.
Antibody-drug conjugates (ADCs)/Conjugados entre anticuerpos y fármacos La idea es inyectar dentro del organismo un anticuerpo que reconozca un antígeno concreto conjugado con un fármaco. Tenemos por ejemplo un anticuerpo capaz de reconocer un antígeno característico de una célula tumoral. Este anticuerpo será conjugado con un fármaco o un compuesto tóxico y después, será inyectado en el organismo. El anticuerpo, junto con el fármaco, viaja hasta encontrar el antígeno al que reconoce. Una vez se produzca la interacción, el antígeno podrá ser endocitado y será degradado en los lisosomas. Durante este proceso de degradación, se cortarán los enlaces que lo mantenían unido al fármaco o a la toxina, que será liberado produciendo daño en la célula (célula tumoral). Así, la toxina se concentra en las células tumorales, evitando que se produzca mucha toxicidad global.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Esta idea ha sido probada con distintos fármacos y también se ha probado conjugando un radionucleótido al anticuerpo, para llevar a cabo una forma de radioterapia más localizada. El principal problema es que el isótopo radioactivo no perderá su actividad una vez ha acabado con la célula diana. Mientras que los radionucleótidos pueden causar daño en las células vecinas y son más difíciles de controlar, resulta más fácil inactivar las toxinas, que no tienen una vida media tan elevada como la de los isótopos radioactivos.
Single domain antibodies (sdAb) o Nanobodies Se trata de derivados de los anticuerpos que presentan fundamentalmente los camélidos (llamas y camellos) y parece que también algunos peces. Estos animales tienen unos anticuerpos algo particulares: no tienen cadenas ligeras, tan solo se componen de cadenas pesadas. Es decir, están formados por dos cadenas pesadas idénticas.
El lugar de reconocimiento del antígeno o parátopo solo depende por tanto de una cadena polipeptídica y esto supone una gran ventaja a nivel de ingeniería de proteínas (y a nivel de jugar con los anticuerpos): será mucho más fácil expresar uno de estos anticuerpos en una bacteria ya que solo es preciso expresar una cadena polipeptídica.
También es más fácil el proceso de producir anticuerpos contra proteínas concretas.
Es el dominio variable de los anticuerpos el que interacciona con el antígeno - la interacción se produce en una zona concreta de los anticuerpos. En esta región concreta del anticuerpo hay tres zonas que acumulan la máxima variabilidad entre unos anticuerpos y otros  región hipervariable. Las regiones hipervariables acostumbran a presentar protuberancias. Estas zonas del anticuerpo se conocen como regiones CDR o complemetary determining region y hay tres por dominio - en el caso de los anticuerpos humanos, hay tres por cada cadena pesada y tres por cada cadena ligera (6 en total). Los nanobodies solo tienen tres CDR. El hecho de que solo haya tres CDR en la unión antígeno-anticuerpo hace que, en comparación con las 6 CDR de los anticuerpos convencionales, los nanobodies tiendan a poder reconocer ciertos dominios o cavidades que no son reconocidas por los anticuerpos normales. Es decir, como son más pequeños, pueden entrar mejor por ejemplo en el surco del sustrato, lo que los hace más eficientes en la inhibición de enzimas.
11 Ingeniería de proteínas Para generar estos anticuerpos, normalmente se emplean linfocitos purificados de estos animales y se amplifica, por PCR, la región correspondiente a los genes que codifican para las inmunoglobulinas. Como los linfocitos tienen todo el repertorio de antígenos que pueden ser reconocidos por el animal, se crea una biblioteca de clones que codificarán para todas las variantes de inmunoglobulina que pueda producir el animal.
Las regiones variables de las inmunoglobulinas se clonan en un plásmido especial, denominado phagemid. Se trata de plásmidos de bacteriófagos que pueden desarrollarse en bacterias y que contienen proteínas para la cápsida del fago. El dominio variable se clona en el phagemid, seguido de diferentes secuencias, unas de las cuales codifica para una proteína de la cápsida del bacteriófago.
Las bacterias se transforman con los plásmidos y comienzan a producir bacteriófagos que tendrán el phagemid y las proteínas de la cápsida, que se habrán sintetizado con un dominio del nanocuerpo enganchado. Es decir, los bacteriófagos expresarán los nanocuerpos en su superficie.
Obtendremos una mezcla de fagos que expresan todo el repertorio de anticuerpos que tenía el animal. Se pone en contacto la mezcla de bacteriófagos con el antígeno que nos interesa para seleccionar los fagos: se añade la proteína de interés (antígeno de interés) sobre un soporte físico sobre el que se añade la mezcla de fagos. Aquellos fagos que expresan en su superficie el anticuerpo que reconozca a la proteína de interés quedarán inmovilizados en el soporte, mientras que los demás no quedan enganchados (se van al realizar lavados). Los fagos que expresan el anticuerpo que buscamos se aíslan y, de ellos se vuelve a obtener el plásmido que se expresa en E. Coli. A partir del mismo plásmido, amplificamos el gen (en las bacterias).
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Este método presenta una gran efectividad, ya que se trata de una única cadena.
Este sistema de seleccionar proteínas (que interaccionan con proteínas) expresándolas en la superficie de bacteriófagos se llama Phage Display.
Una de las grandes ventajas de emplear este método es que ya sabemos seguro que el antígeno in vitro reconoce al anticuerpo.
El hecho de tener una sola cadena facilita realizar modificaciones sobre el anticuerpo, y permite emplear estos anticuerpos para aplicaciones diversas. Por ejemplo, se pueden neutralizar proteínas con los nanobodies. Será más complicado si se trata de una proteína intracelular: en este caso las células se transforman con un plásmido. Realizar esto in vitro es relativamente fácil, pero in vivo es más complicado de llevar a cabo, por lo que es difícil la aplicación. terapéutica.
También se pueden añadir radionucleótidos o proteínas verdes fluorescentes al nanobody permitiendo localizar antígenos.
Otra posibilidad es enganchar dos dominios diferentes, provocando la unión de dos moléculas de antígeno. Así, en cierta manera habríamos obtenido un anticuerpo biespecífico (pero se trata de un nanocuerpo).
Se ha planteado que una forma de evitar las infecciones por rotavirus es tener en la flora intestinal lactobacilos que expresen un nanobody unido a una proteína de membrana. Así, se podría neutralizar el virus (mediante la unión al nanocuerpo).
Muchas de estas ideas no pueden llegar a ser efectivas o no se aprueban para su aplicación en humanos, aunque muchos investigadores están planteando emplear los nanobodies para aprovecharnos de ellos.
13 Ingeniería de proteínas Proteínas y péptidos que permiten cruzar barreras Se trata de un campo que actualmente se encuentra en expansión. La idea es hacer que un péptido atraviese la barrera hematoencefálica o bien que entre dentro de la célula. Se han desarrollado maneras de hacer llegar proteínas y péptidos al interior de las células.
Cell Penetrating Peptides (CPPs) Son pequeños péptidos que tienen la capacidad de atravesar membranas celulares sin necesidad de receptores específicos. No está claro cómo consiguen que atraviesen la membrana aunque sí se sabe que la mayoría de esos péptidos son ricos en aminoácidos básicos (con carga positiva) y también aminoácidos hidrofóbicos. Parece importante que los péptidos tengan cierto carácter anfipático, es decir, que además de una parte con carga positiva, tengan aminoácidos hidrofóbicos. Parece que los aminoácidos básicos se unen a las cabezas polares de los fosfolípidos y a proteoglicanos, mientras que los aminoácidos apolares se unen a las regiones apolares de los lípidos de membrana, facilitando la translocación.
Normalmente se clasifican en tres grupos: - Naturales: dominios de transducción de proteínas. Se trata de secuencias que encontramos en las proteínas de la naturaleza que permiten atravesar a dichas proteínas la membrana celular. Se ha conseguido determinar e identificar la secuencia responsable de que esto ocurra.
Un ejemplo de uno de estos CPPs naturales es el péptido Penetratin de la proteína Antennapedia - en la secuencia abudan los aminoácidos cargados positivamente y también hay bastantes aminoácidos hidrofóbicos.
Uno de los más populares es el péptido Tat.
- Sintéticos. Una vez se conocen las propiedades de los dominios de transducción de proteínas se han diseñado secuencias que intentan reproducirlas. Por ejemplo, el CPP basado en la proteína Tat tiene muchas argininas.
- Quiméricos - se ha probado uniendo dos secuencias naturales para intentar conseguir una mayor efectividad. Por ejemplo, la combinación de galanine y mastoparan.
En la siguiente tabla podemos ver algunos de los CPPs que existen, incluidos los ejemplos que se han ido nombrando y sus secuencias.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Como ya se ha comentado, no está 100% claro el mecanismo por el cual estos péptidos pueden atravesar las membranas, pero se habla de tres mecanismos: - Translocación directa - no mediada por otras proteínas e independiente de ATP - Mediante proteínas que habitualmente facilitan la endocitosis  Mediada por caveolinas  Mediada por clatrinas Translocación directa No está medida por otras proteínas. Dentro de este grupo, se han propuesto tres mecanismos diferentes. Por ejemplo, se plantea que los aminoácidos con carga positiva que interaccionan con los fosfolípidos constituyen una especie de vesícula endocítica en la propia membrana, que permite que el péptido atraviese la membrana (como se muestra en la imagen  A).
Otra teoría es que los aminoácidos con carga positiva forman una especie de poro (B).
La última propuesta dentro de la translocación directa es la translocación adaptativa y se lleva a cabo gracias a los fosfolípidos con carga negativa, que se desplazan al otro lado de la membrana (C).
La idea es que, esta capacidad de atravesar las membranas puede ser aprovechada. Por ejemplo, podemos engancharles alguna molécula para que entre en la célula. Se ha probado a introducir mediante este método fármacos, fluoróforos, … dentro de la célula. Lo más interesante desde el punto de vista de la ingeniería de proteínas es que, con este sistema podemos llegar a introducir proteínas en la célula.
También hay grupos que se dedicar a introducir ácidos nucleicos con objetivos de terapia génica.
Habitualmente, esto se lleva a cabo gracias a virus - se ha intentado crear virus sintéticos en los que los ácidos nucleicos están contenidos en cápsidas que contienen péptidos de este tipo, que nos permiten introducir el ácido nucleico.
15 Ingeniería de proteínas Por ejemplo, TAT fusionado con el péptido BH4 constituye un péptido terapéutico para la ataxia de Friedrich. El péptido BH4 es un dominio de una proteína antiapoptótica, que se ha intentado introducir en las neuronas en casos de esta patología. En el siguiente experimento tenemos un modelo neuronal de ataxia de Friedrich (ganglio de la raíz dorsal) en el que, mediante iRNA se inhibe la expresión del gen de la frataxina  disminuye mucho la viabilidad. Observamos que, cuando añadimos el péptido TAT-BH4, las neuronas son capaces de recuperar el potencial de membrana y de volver a ser funcionales.
Es decir, en este grupo de investigación, han sido capaces de hacer llegar al interior de la célula una proteína antiapoptótica.
Proteínas y péptidos que permiten cruzar la barrera hematoencefálica La barrera hematoencefálica está compuesta por células de tipo endotelial, con una gran permeabilidad selectiva, y astrocitos. En general, la barrera permite que la atraviesen las moléculas de tipo lipofílico, a no ser que dentro de la célula existan mecanismos para expulsarlas de nuevo al plasma. Las moléculas hidrofílicas necesitarán transportadores para atravesarla. En caso de proteínas y péptidos, estos transportadores acostumbran a ser receptores. Si queremos administrar proteínas terapéuticas, por ejemplo para tratar enfermedades neurodegenerativas, necesitaremos que atraviesen la membrana. Como se trata de moléculas polares, en principio tendremos problemas para ello.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Se han desarrollado diferentes aproximaciones para enviar al cerebro estas moléculas terapéuticas.
Por ejemplo, se utilizan receptores como el de la transferrina, el receptor de la insulina o los receptores relacionados con los LDL, que en principio permiten transportar proteínas necesarias para la actividad del cerebro (transferrina, insulina).
La estrategia que se sigue es fusionar la proteína de interés con alguna proteína reconocida por estos receptores. En el caso del receptor de la transferrina, se envían las nanopartículas recubiertas de transferrina, que interaccionará con el receptor facilitando la entrada de la partícula con ella.
También pueden usarse anticuerpos anti transferrina: la partícula que queremos que atraviese la membrana se unirá junto con el anticuerpo a la transferrina.
Otro ejemplo, son las moléculas o partículas conjugadas con anticuerpos anti-insulina.
Los receptores de LDL (LRP) también se usan mucho, ya que son receptores de más amplio espectro.
En algunos casos, se han fusionado pequeñas moléculas terapéuticas y también se han fusionado péptidos y proteínas pequeñas  se ha logrado que atraviesen la membrana hematoencefálica.
Interacción proteína-ligando y su relación con el diseño de fármacos Un ligando es una molécula que se une a una molécula diana determinada, en este caso una proteína. Suele ser una unión muy específica  la especificidad viene determinada por una serie de condicionantes geométricos y también por una serie de interacciones que establecen con el ligando los aminoácidos que lo rodean. Estas interacciones favorecen que el ligando se sitúe de manera correcta, es decir, que quede bien ligado. Son de tipo no covalente: interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas (son interacciones débiles).
Hay intereses en el conocimiento de la interacción proteína-ligando: en primer lugar, interesa conocer la interacción y el mecanismo de acción. Por otro lado, conocer bien esta interacción permite que podamos variar algunos de sus aminoácidos para modular la interacción y cambiar sus propiedades.
Desde el campo de la farmacología, nos interesa conocer esta interacción ya que nos puede hacer conocer el mecanismo de acción de fármacos y diseñar fármacos.
Diseño de fármacos A la hora de desarrollar un fármaco podemos encontrar dos estrategias diferentes.
- En primer lugar, podemos descubrir que un compuesto tiene un efecto fisiológico sobre el organismo. Es decir, se descubre antes el efecto que el mecanismo por el cual se produce (como ocurrió en el caso de la aspirina). Una vez se conoce que un compuesto tiene un efecto, nos interesamos en conocer cómo actúa.
- Por otro lado, tenemos una proteína de la que sospechamos que, si la inhibimos o activamos, obtendremos un efecto fisiológico que puede resultar beneficioso para alguna patología concreta. Por ejemplo, sabemos que si inhibimos enzimas que intervienen en la replicación y la transcripción, encontraremos dianas antiproliferación, por lo que se buscan compuestos capaces de inhibir estas proteínas.
17 Ingeniería de proteínas Esto puede llevarse a cabo experimentalmente, probando qué compuesto inhibe a una proteína concreta, o bien se puede intentar hacer in silico: si conocemos la estructura tridimensional de la proteína a inhibir, podemos desarrollar compuestos capaces de inhibirla.
Primer ejemplo de diseño de fármacos basado en estructura: Desarrollo de inhibidores de la proteasa del VIH El virus del VIH se aisló y purificó en el año 1984 y al año siguiente ya se había pensado que una forma de inactivar el virus era inactivando la proteasa, es decir, se definió la proteasa como diana molecular.
Diversos grupos se lanzaron a obtener la estructura de la proteasa, a partir de la cual se intentó diseñar compuestos que pudieran entrar en su lugar de unión y actuar como fármacos.
En el centro de la proteasa queda una cavidad donde se localiza el centro activo. Unos investigadores fueron capaces de desarrollar un compuesto orgánico que mimetizaba los péptidos y que inhibía la proteasa, el saquinavir.
Este caso es un ejemplo de cómo, con relativa velocidad se pasó de aislar el virus a sacar un fármaco al mercado para neutralizarlo. Este descubrimiento generó grandes expectativas ya que se pensó que teniendo tan solo la estructura molecular de una diana, con un coste reducido se iba a poder desarrollar fármacos contra esta proteína.
Como ocurre con todos los descubrimientos y las tecnologías recién desarrolladas, se produjo el efecto conocido como Hype Cycle. Si se pudiesen medir las expectativas que crean las nuevas tecnologías encontramos que generan grandes expectativas cuando salen y comienzan a producir los primeros resultados positivos. Lo que ocurrió tras el descubrimiento del saquinavir es que muchos grupos de investigación comenzaron a tratar de diseñar fármacos a partir de la estructura de proteínas. Una vez pasado este primer momento de entusiasmo comienzan a llegar las desilusiones. Esta tecnología no resulta tan efectiva como se pensaba y los primeros éxitos parecen fruto de la suerte. Las expectativas bajan mucho y la gente comienza a pensar que se trata de una tecnología que no sirve. Por suerte, sigue 18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV habiendo gente que confía en el método y continúa desarrollando mejoras y creando proyectos, logrando conseguir pequeños éxitos (nunca tan grandes como el inicial). A esta dinámica que ocurre cuando sale una nueva técnica se la conoce como Hype Cycle y es lo que ocurrió con el desarrollo de medicamentos in silico (sigue una curva como esta).
Los grupos que han continuado trabajando con esta idea tras la desilusión generalizada han ido realizando mejoras. La estrategia que usan mezcla lo mejor de las dos formas de diseñar fármacos: el diseño experimental y el diseño in silico a partir de la estructura. Este nuevo método es conocido como descubrimiento de fármacos basados en fragmentos o Fragment based drug discovery.
Cuentan con la estructura de la diana farmacológica y van probando pequeños compuestos para ver cuál de ellos es el que se une más eficientemente a la proteína de interés. Una vez hecho esto, obtienen la estructura de este compuesto y estudian cómo pueden modificarlo para conseguir una mayor capacidad de inhibición de la proteína. Es decir, primero se lleva a cabo una fase experimental y luego una segunda fase in silico. Esta estrategia ha tenido bastante éxito.
Se ha llevado a cabo por ejemplo con la proteína CDK2 (desarrollaron un inhibidor). Vieron dónde y cómo se unía el primer pequeño compuesto, con una capacidad de inhibición muy limitada. Una vez resolvieron cómo se unía, diseñaron un compuesto avanzado que mantiene alguna característica del compuesto inicial pero tiene muchas modificaciones y una mayor capacidad para inhibir el fármaco.
Parece que esta estrategia es potencialmente prometedora.
Estos compuestos los venden a alguna farmacéutica.
19 Ingeniería de proteínas Otra aproximación relacionada que se ha llevado a cabo consiste en realizar in silico todo el proceso de selección. Por ejemplo, se han desarrollado de esta manera inhibidores de la interacción CD4MHCII. Los investigadores intentaban encontrar compuestos que se colocasen en la zona y rompieran la interacción entre las dos moléculas. El diseño del inhibidor no comienza desde 0, ya que cuentas con la estructura de la proteína y una biblioteca de estructuras de diferentes compuestos. Prueban in silico todos los compuestos de la biblioteca para ver cuáles se unen.
Encontraron compuestos con capacidad de inhibir, pero no con demasiada efectividad.
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